UV-ARTP復(fù)合誘變選育高產(chǎn)纖維素酶菌株

耿海波

（1.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品與藥品工程系，河北 石家莊 050081；2.石家莊市建材領(lǐng)域高性能纖維素技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050081）

纖維素作為世界上產(chǎn)量最高的可再生有機(jī)質(zhì)資源，在植物、海藻、微生物等生物體內(nèi)廣泛存在，纖維素的有效開發(fā)和資源化利用對(duì)于整個(gè)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[1]?，F(xiàn)如今，纖維素世界年產(chǎn)量已達(dá)1 500億t，其中僅秸稈產(chǎn)量就超過60億t，中國(guó)秸稈年產(chǎn)量約占世界總量的20%～30%[2-3]。2017年，我國(guó)國(guó)家發(fā)展和改革委員會(huì)、國(guó)家能源局等十五部門聯(lián)合印發(fā)的《關(guān)于擴(kuò)大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實(shí)施方案》中指出：到2025年，力爭(zhēng)纖維素乙醇實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，形成更加完善的市場(chǎng)化運(yùn)行機(jī)制[4]，為我國(guó)未來纖維素的開發(fā)利用指明了方向。纖維素因結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以被有效利用，造成了極大的浪費(fèi)，因此，如何對(duì)纖維素類進(jìn)行降解處理成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)[5]。

現(xiàn)有纖維素降解的主要方法包括物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法、生物法和聯(lián)合處理法[6]，其中生物法主要為從自然界篩選可分解纖維素的真菌和細(xì)菌，它們可產(chǎn)生種類多、數(shù)量大的纖維素降解酶，這些纖維素酶雖結(jié)構(gòu)各異，降解作用不同，但是都可以破壞纖維素的化學(xué)鍵使其結(jié)構(gòu)裂解[7-8]。生物法反應(yīng)條件溫和、無污染、成本低、生物轉(zhuǎn)化率高，在生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化方面具有廣闊的應(yīng)用前景[9]，但是現(xiàn)有微生物所產(chǎn)生的纖維素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、活性不高、酶作用條件苛刻等問題，因此，選育優(yōu)良的高產(chǎn)纖維素酶的菌株，提高降解纖維素的效率仍然是當(dāng)前和今后纖維素酶研究的主要任務(wù)[10-11]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的能夠產(chǎn)生纖維素酶的微生物主要集中在真菌中的木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）和曲霉屬（Aspergillus）[12-13]，細(xì)菌中的芽孢桿菌屬（Bacillus）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）以及放線菌中的鏈霉菌屬（Streptomyces）等[14-15]。其中，木霉是目前工業(yè)級(jí)水解酶活性較高的菌種之一[6，16]。在此背景下，不斷選育優(yōu)良的纖維素酶高產(chǎn)木霉菌株，提高菌株的生產(chǎn)穩(wěn)定性，使其得到生產(chǎn)應(yīng)用，是纖維素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要研究方向[17]。

本研究以前期從河北某生物企業(yè)秸稈收儲(chǔ)池篩選的具備一定開發(fā)潛力的擬康氏木霉（Trichodermapseudokoningii）TP-89作為出發(fā)菌株，利用紫外（ultraviolet，UV）誘變結(jié)合常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)[18]對(duì)其進(jìn)行誘變處理，篩選纖維素酶高產(chǎn)正突變株，并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期為纖維素酶生產(chǎn)研究乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供有價(jià)值的菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）TP-89：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳酸、KH2PO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、CaCl2·2H2O、FeSO4、CoCl2、MnSO4、ZnSO4、吐溫80：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CMC-Na、微晶纖維素：上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；酵母粉、玉米漿粉、瓊脂粉：北京索萊寶生物科技有限公司；剛果紅染色液、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京雷根生物技術(shù)有限公司。以上所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[19]：去皮馬鈴薯200 g（切塊后100 ℃加熱30 min，過濾后棄掉濾渣），葡萄糖20 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，pH自然。

菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基[20]：去皮馬鈴薯200 g（切塊后100 ℃加熱30 min，過濾后棄掉濾渣），葡萄糖20 g，K2HPO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

羧甲基纖維素鈉（sodiumcarboxymethyl cellulose，CMCNa）培養(yǎng)基[21]：CMC-Na 15 g，乳糖3 g，KH2PO41 g，（NH4）2SO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉1 g，瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基[22]：微晶纖維素10 g，玉米漿粉12 g，乳糖5 g，（NH2）2SO22 g，MgSO2·7H2O 1.2 g，CaCl2·2H2O 1.4 g，吐溫80 2 mL，Mandels微量元素營(yíng)養(yǎng)鹽（配方：FeSO45 g/L、CoCl23.7 g/L、MnSO41.6 g/L、ZnSO41.4 g/L）1 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH 4.8，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-II型常壓室溫等離子體（ARTP）誘變儀：北京思清源生物科技有限公司；LDZX-50L型高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ME204型電子分析天平、FE22型pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；YJ-VS-1型垂直超凈工作臺(tái)：無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；TG16.5型臺(tái)式高速離心機(jī)：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BS-2E型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：常州恒隆儀器有限公司；DHP-9602型恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LD-96A型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀：山東萊恩德科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化和孢子懸液的制備

取適量實(shí)驗(yàn)室保藏的擬康氏木霉TP-89，于1 mL無菌水中振蕩搖勻，通過涂布平板法接種到PDA培養(yǎng)基上，于30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用接種鏟取0.5 cm×0.5 cm的正方形菌塊，平放到菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板上進(jìn)一步活化，于30 ℃恒溫培養(yǎng)15 d后，收集孢子并用生理鹽水調(diào)節(jié)孢子濃度為1×106個(gè)/mL備用。1.3.2 UV誘變[23]

移取15 mL孢子懸液于無菌培養(yǎng)皿中，在攪拌子作用下將培養(yǎng)皿置于距離紫外燈20 cm處分別照射0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，移取誘變后的孢子懸液用生理鹽水稀釋至104個(gè)/mL后，吸取0.1 mL均勻涂布于菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，避光條件下30 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄各平板形成的菌落數(shù)，以照射時(shí)長(zhǎng)為0 s的培養(yǎng)皿為對(duì)照組，計(jì)算出發(fā)菌株在不同誘變時(shí)間的致死率，并繪制致死曲線進(jìn)而確定最佳誘變時(shí)長(zhǎng)，致死率計(jì)算公式如下：

式中：Z表示誘變致死率，%；X1為誘變組平板的菌落數(shù)，個(gè)；X為對(duì)照組平板的菌落數(shù)，個(gè)。

1.3.3 ARTP誘變[24-25]

保持ARTP誘變儀的工作條件不變，以誘變時(shí)間作為變量對(duì)孢子懸液進(jìn)行誘變處理。具體處理流程為：在超凈工作臺(tái)中，移取10 μL孢子懸液于直徑5 mm的無菌不銹鋼載片上，注入純度為99.999%的氦氣（He），氣體流速選擇10.0 L/min，設(shè)置功率120 W，處理距離2 mm，處理溫度低于40 ℃。出發(fā)菌株孢子懸液分別在ARTP誘變儀下照射處理0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，每次誘變后分別將不銹鋼載片置于含990 μL無菌生理鹽水的EP管中，在漩渦器上振蕩5 min。分別對(duì)上述孢子懸液進(jìn)行梯度稀釋至孢子濃度為104個(gè)/mL，吸取0.1 mL稀釋液涂布接種到菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h后，觀察并記錄菌落數(shù)量，計(jì)算致死率，并繪制致死曲線，確定最佳誘變處理時(shí)間。

1.3.4 UV-ARTP復(fù)合誘變

按照1.3.2獲得的最佳誘變條件對(duì)出發(fā)菌株孢子懸液進(jìn)行紫外誘變后，初篩出發(fā)生正突變的菌株培養(yǎng)并制成孢子懸液，再按照方法1.3.3獲得的最佳誘變條件進(jìn)行ARTP誘變。

1.3.5 突變菌株的初篩

將誘變后的菌株孢子懸液適當(dāng)稀釋后涂布于CMC-Na培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，加入5 mL剛果紅染色液到平板表面染色60 min，采用1 mol/L的NaCl溶液洗脫30 min，記錄水解圈直徑與菌落直徑的比值（H/C），H/C大于對(duì)照組（未經(jīng)誘變菌株）的則視為正突變[22]，選取正突變株進(jìn)行復(fù)篩。

1.3.6 突變菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株接種到200 mL菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)18 h后，制備濃度為1×108個(gè)/mL的孢子懸液，然后以1%（V/V）接種量接種到200 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d，每12 h取樣，在離心機(jī)中以6000r/min離心10min，取上清液即為粗酶液，測(cè)定酶活，選取高產(chǎn)纖維素酶菌株。

1.3.7 纖維素酶活測(cè)定[26-28]

濾紙酶活測(cè)定：裁剪定性濾紙條（1 cm×6 cm）置于試管中，加入50 mmol/L、檸檬酸緩沖液（pH 4.8）1.50 mL和粗酶液0.50 mL，用同體積50 mmol/L、檸檬酸緩沖液（pH 4.8）代替粗酶液作為空白對(duì)照。在50 ℃水浴中振蕩反應(yīng)30 min后，加入DNS溶液2 mL，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定OD540nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y（OD540nm值）=0.446 8x（葡萄糖含量）+0.043 4（R2=0.999 6）計(jì)算葡萄糖含量，并計(jì)算濾紙酶活。

外切酶活測(cè)定：定量稱取50 mg脫脂棉替代濾紙條作為反應(yīng)底物，其他步驟同濾紙酶活測(cè)定。

內(nèi)切酶活測(cè)定：以CMC-Na作為反應(yīng)底物，稱取CMC-Na 0.50 g，用50 mmol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.8）定容至100 mL獲得CMC-Na溶液，用CMC-Na溶液替代檸檬酸水溶液，其他步驟同濾紙酶活測(cè)定。

酶活定義：在上述條件下，1 mL粗酶液每分鐘水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.8 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的高產(chǎn)纖維素酶菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)7次，每代分別制成孢子懸液，按照1%（V/V）的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d，測(cè)定每代菌株的纖維素酶活，從而驗(yàn)證菌株產(chǎn)酶能力的遺傳穩(wěn)定性[20]。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2021對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和作圖，用SPSS 26.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳紫外誘變時(shí)間的確定

在對(duì)出發(fā)菌株TP-89誘變育種時(shí)，菌株的突變率很大程度上受到誘變劑量的影響，誘變劑量越大則突變率越高，但是當(dāng)達(dá)到一定誘變劑量時(shí)，繼續(xù)加大誘變劑量會(huì)導(dǎo)致菌體死亡率過高，誘變效率反而下降[19]。為了獲取理想的誘變效果，以紫外照射時(shí)間為變量，對(duì)擬康氏木霉菌株TP-89誘變處理后的致死率繪制致死曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 紫外誘變時(shí)間對(duì)擬康氏木霉菌株TP-89致死率的影響Fig.1 Effect of UV mutation time on the lethal rate of Trichoderma pseudokoningii TP-89

由圖1可知，隨著誘變時(shí)間在0～100 s范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，菌株致死率迅速增加，有研究表明，一般選擇菌株致死率在80%～90%范圍內(nèi)對(duì)菌株進(jìn)行誘變效果較好[19]。當(dāng)誘變時(shí)間為100 s時(shí)，菌株致死率為83.8%，誘變時(shí)間為120 s時(shí)致死率已達(dá)98.3%，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100 s為紫外誘變處理的最佳時(shí)間。

2.2 最佳ARTP誘變時(shí)間的確定

以ARTP誘變時(shí)間為變量，對(duì)誘變處理后擬康氏木霉菌株TP-89的致死率繪制致死曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 ARTP誘變時(shí)間對(duì)擬康氏木霉菌株TP-89致死率的影響Fig.2 Effect of ARTP mutation time on the lethal rate of Trichoderma pseudokoningii TP-89

由圖2可知，隨著誘變時(shí)間在0～120 s范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，菌株致死率同樣迅速增加，當(dāng)誘變時(shí)間為120 s時(shí)，菌株致死率為86.6%，誘變時(shí)間＞140 s時(shí)，致死率達(dá)到100%，按照菌株致死率在80%～90%范圍內(nèi)進(jìn)行選擇，選擇120 s為ARTP誘變處理的最佳時(shí)間。

2.3 突變菌株的篩選

2.3.1 初篩結(jié)果

出發(fā)菌株TP-89經(jīng)UV-ARTP復(fù)合誘變后，獲得96株正突變菌株，分別編號(hào)為UA-1～UA-96，其中水解圈直徑與菌落直徑比值（H/C）＞2的正突變菌株有6株，結(jié)果見表1。

由表1可知，菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-58、UA-67、UA-95的H/C均＞2，分別為2.06、2.05、2.17、2.19、2.47、2.33，因此，選擇這6株突變株進(jìn)行產(chǎn)酶性能復(fù)篩。

2.3.2 復(fù)篩結(jié)果

對(duì)出發(fā)菌株TP-89和6株初篩突變菌株的纖維素酶酶活進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖3。

圖3 出發(fā)菌株TP-89及6株突變菌株的濾紙酶活（a）、內(nèi)切酶活（b）及外切酶活（c）測(cè)定結(jié)果Fig.3 Determination results of filter paper enzyme activity (a), endonuclide enzyme activity (b), and exonuclide enzyme activity (c) of starting strain TP-89 and 6 mutant strains

由圖3a可知，發(fā)酵過程中，出發(fā)菌株TP-89和6株突變菌株的濾紙酶活均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，且均在培養(yǎng)第4天達(dá)到酶活的峰值。與出發(fā)菌株TP-89相比，5株突變菌株的酶活峰值提高，1株突變菌株的酶活峰值下降，其中突變菌株UA-52和UA-67的最大酶活提高的幅度較大，分別達(dá)到了2.41 U/mL和2.59 U/mL，相較于出發(fā)菌株TP-89（1.40 U/mL）分別提高了72.1%和85.0%

由圖3b可知，發(fā)酵過程中，出發(fā)菌株TP-89和6株突變菌株的內(nèi)切酶活均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。出發(fā)菌株TP-89及突變菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-67、UA-95均在發(fā)酵4 d時(shí)酶活達(dá)到最高，分別為1.89 U/mL、2.35 U/mL、3.43 U/mL、4.53 U/mL、4.26 U/mL和1.69 U/mL；突變菌株UA-58在發(fā)酵5 d時(shí)，酶活達(dá)到最高，為2.34 U/mL。相較于出發(fā)菌株，突變菌株UA-33、UA-52、UA-67的最高酶活提高的幅度較大，分別提高了81.5%、139.7%和125.4%。

由圖3c可知，發(fā)酵過程中，各菌株的外切酶活均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，突變菌株UA-58在發(fā)酵3 d時(shí)，酶活達(dá)到最高，為5.11 U/mL；出發(fā)菌株TP-89及突變菌株UA-7、UA-33、UA-52、UA-67在發(fā)酵4 d時(shí)，酶活達(dá)到最高，分別為4.58 U/mL、5.12 U/mL、5.98 U/mL、7.43 U/mL、7.79 U/mL；突變菌株UA-95在發(fā)酵5 d時(shí)，酶活達(dá)到最高，為4.01 U/mL。相較于出發(fā)菌株TP-89，突變菌株UA-52和UA-67的最高酶活提高的比較明顯，分別提高了62.2%和70.1%。

綜上，突變菌株UA-52和UA-67的濾紙酶活、內(nèi)切酶活和外切酶活均比出發(fā)菌株TP-89得到了明顯的提升，確定為高產(chǎn)纖維素酶的菌株。

2.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

將篩選出的突變菌株UA-52和UA-67連續(xù)7次傳代培養(yǎng)，分別培養(yǎng)4 d后測(cè)定酶活，結(jié)果見表2。

表2 突變菌株UA-52和UA-67遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of genetic stability of mutant strains UA-52 and UA-67

由表2可知，突變菌株UA-52在第5代時(shí)濾紙酶活和內(nèi)切酶活顯著下降（P＜0.05），外切酶活在第4代時(shí)顯著下降（P＜0.05），說明此突變菌株的遺傳穩(wěn)定性不夠穩(wěn)定。而突變菌株UA-67經(jīng)過7次傳代培養(yǎng)后，濾紙酶活、內(nèi)切酶活和外切酶活相對(duì)初代菌株均無顯著變化（P＞0.05），說明菌株UA-67具有較高的遺傳穩(wěn)定性。因此，最終篩選突變菌株UA-67為優(yōu)良的高產(chǎn)纖維素酶菌株，其遺傳穩(wěn)定性與王豐園等[20]篩選的擬康氏木霉相近，且產(chǎn)酶性能更優(yōu)。

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）菌株TP-89為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行UV誘變100 s，ARTP誘變120 s后，獲得96個(gè)正突變菌株，經(jīng)產(chǎn)纖維素酶性能初篩后，發(fā)現(xiàn)6株突變菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值（H/C）＞2；通過復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，突變菌株UA-52和UA-67的濾紙酶活、內(nèi)切酶活和外切酶活較出發(fā)菌株均得到了明顯的提升。對(duì)2株菌株進(jìn)行連續(xù)傳代7次培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)突變菌株UA-67具有較高的遺傳穩(wěn)定性，其在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d時(shí)的濾紙酶活為2.59U/mL、內(nèi)切酶活為4.26U/mL、外切酶活為7.79 U/mL，較出發(fā)菌株TP-89分別提了85.0%、125.4%和70.1%，具有一定工業(yè)應(yīng)用潛力。