乙醇-硫酸銨雙水相體系萃取蝦青素的研究

王世云,馮金華,黃思玉,徐秋彤

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué),河北,秦皇島 066003)

蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素。蝦青素具有強(qiáng)烈的抗氧化性,能被氧化劑氧化為蝦青素醌和其它衍生物,在市場上的應(yīng)用范圍廣闊。蝦青素在水產(chǎn)養(yǎng)殖、藥用、食用等方面主要應(yīng)用蝦青素的抗氧化和增強(qiáng)免疫力的能力。另外,在日本也已推出含有蝦青素成分的眼保護(hù)劑[1]。由Mara公司研發(fā)的紅球藻蝦青素產(chǎn)品(AstaFactor),比其他26種著名的抗炎產(chǎn)品具有更顯著的抗炎抗感染作用[2]。蝦青素已被研究用于包括對眼睛、心臟和大腦健康的臨床應(yīng)用[3]。

蝦青素來源有兩大類:化學(xué)合成和天然蝦青素。合成蝦青素具有與天然蝦青素相同的分子結(jié)構(gòu),為含有不同立體異構(gòu)體的混合物[4]。動(dòng)物體對化學(xué)合成的蝦青素吸收能力較弱,與天然蝦青素相比其著色能力和生物效價(jià)低得多,美國食品與藥物管理局(FDA)已經(jīng)禁止化學(xué)合成的蝦青素進(jìn)入食品和膳食補(bǔ)充劑市場[5],這種來源蝦青素隨著天然來源蝦青素產(chǎn)業(yè)的興起終將被淘汰。天然蝦青素來源廣泛,可從紅發(fā)夫酵母、粘紅酵母、雨生紅球藻、銅綠小球藻以及蝦、蟹殼等多種生物中提取。雨生紅球藻中蝦青素含量可高達(dá)細(xì)胞干重的4%,被公認(rèn)為生產(chǎn)天然蝦青素的最佳來源。目前有多種雨生紅球藻蝦青素提取物在售賣,有效成分蝦青素含量在1%～10%左右。

雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素已有報(bào)道[6]。乙醇-硫酸銨雙水相能夠使蝦殼蝦青素乙醇提取液中80%以上蝦青素包括游離蝦青素及蝦青素酯形成沉淀,而集中于雙水相的上下兩相之間。該法具有分相快速、處理量大、環(huán)境友好、不用加熱等優(yōu)點(diǎn),有利于蝦青素的濃縮和蝦青素固體的制備,在工業(yè)生產(chǎn)蝦青素中具有一定的應(yīng)用潛力。但是將乙醇-硫酸銨雙水相系統(tǒng)用于從雨生紅球藻蝦青素提取物中純化蝦青素還未有報(bào)道。本試驗(yàn)采用乙醇-硫酸銨雙水相體系從含蝦青素5%的雨生紅球藻蝦青素粉中提取蝦青素,可以為雙水相體系在蝦青素制備中的更廣泛應(yīng)用提供一些試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 原料 5%雨生紅球藻蝦青素粉,購買于濟(jì)南魯源生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器 721型可見分光光度計(jì),上海舜宇恒平科技有限公司生產(chǎn);FA2104N型精密分析電子天平,上海菁海儀器有限公司生產(chǎn);IC-20A型島津高效液相色譜儀,Shimadzu島津公司生產(chǎn);DKE-3雙功能水浴恒溫振蕩器,金壇市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn);80-2離心機(jī),江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn);UV-1800PC全波長掃描型紫外可見分光光度計(jì),濟(jì)南歐威騰生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 主要試劑及耗材 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(S13036-250 mg,≥98.0%),由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn);硅膠板(規(guī)格50×100 mm;厚度0.20～0.25 mm),由青島海洋化工有限公司生產(chǎn);無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷,丙酮,分析純,由天津市鑫鉑特化工有限公司生產(chǎn);硫酸銨,分析純,由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);甲醇,色譜純,由天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn);四氫呋喃,色譜純,由天津賽孚瑞科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的提取 制備兩種濃度的蝦青素提取液。分別取0.4 g和0.5 g雨生紅球藻蝦青素粉加入10 mL無水乙醇,室溫避光提取30 min,然后4 000 r/min離心10 min,取上清液,沉淀重復(fù)此操作3次,分別合并4次上清液,作為濃度為C1和C2的雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液。

1.2.2 雙水相萃取蝦青素

采用雙水相萃取蝦殼中蝦青素探索的乙醇-硫酸銨雙水相體系[6]。共包括8個(gè)體系,分別為:

無水乙醇∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5;無水乙醇∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5,其中(NH4)2SO4溶液為質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)。

在進(jìn)行蝦青素萃取試驗(yàn)時(shí),將上述成相體系中的無水乙醇換成1.2.1中制備的雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液。取3 mL蝦青素提取液,按比例加入相應(yīng)體積的20%或30%硫酸銨溶液,混勻,避光靜置1 h,至體系分相完全。

分別記錄各分相體系上下相體積。將上相取出后,避光-15 ℃保存,待檢測。中間相用移液槍抽取出來后,加水,8 000 r/min離心10 min,取沉淀,乙酸乙酯溶解,避光-15 ℃保存,待檢測。

1.2.3 蝦青素的高效液相色譜檢測

高效液相色譜檢測條件為:C18(250 mm×4.6 mm)色譜柱,室溫,進(jìn)樣量10 μL,檢測波長為476 nm,采用甲醇(B)和四氫呋喃(A)梯度洗脫,流速0.8 mL/min。

在檢測雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液中是否含有蝦青素酯時(shí),采用馮金華等[6]的梯度洗脫條件。

在確定原料中不含蝦青素酯后,后續(xù)檢測的洗脫條件見表1。

表1 高效液相色譜流動(dòng)相洗脫條件

在檢測上相蝦青素含量時(shí),為去除硫酸銨對樣品檢測的影響,取100 μL各樣品溶液加2 mL水,然后再加入1 mL乙酸乙酯,將蝦青素及其他色素萃取入乙酸乙酯相,取乙酸乙酯相進(jìn)行高效液相測定。

1.2.4 蝦青素的薄層色譜測定 薄層板為50×100 mm的硅膠板,展開劑:25%丙酮和75%正已烷。

1.2.5 蝦青素的紫外可見光譜檢測 檢測樣品在300～800 nm的吸收光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的鑒定

2.1.1 紫外-可見光譜 如圖1所示,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品乙酸乙酯溶液的紫外-可見吸收光譜只有一個(gè)吸收峰,在476 nm。雨生紅球藻蝦青素粉提取液的紫外-可見吸收光譜有兩個(gè)主要吸收峰,分別在490 nm和440 nm附近,與蝦青素的最大吸收峰在476 nm相比相差很大,說明在雨生紅球藻蝦青素粉中含有比較多的不同于蝦青素的雜色素。

1:蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品

2.1.2 高效液相色譜

以蝦青素的最大吸收波長476 nm為檢測波長,進(jìn)行雨生紅球藻蝦青素粉乙酸乙酯提取液的HPLC檢測。如圖2所示,游離蝦青素的吸收峰在5.3 min左右。

圖2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

雨生紅球藻中蝦青素含有70%的單酯和25%的雙酯形式的蝦青素,只有不到5%的游離蝦青素[7]。在前期檢測蝦殼中蝦青素時(shí)[6],游離蝦青素出峰時(shí)間5.3 min左右,蝦青素單酯和蝦青素雙酯出現(xiàn)在14.0～45.0 min之間。當(dāng)采用相同的檢測方式檢測雨生紅球藻蝦青素提取液中蝦青素的類型時(shí),如圖3所示,所有吸收峰都出現(xiàn)在10 min之前,在14.0～45.0 min之間沒有出現(xiàn)吸收峰,所以雨生紅球藻蝦青素粉中基本不含蝦青素單酯和蝦青素雙酯,5.3 min左右出現(xiàn)了游離蝦青素的吸收峰,但除此之外,在2～5 min之間出現(xiàn)了多個(gè)雜色素的吸收峰,在6.5～7.0 min之間出現(xiàn)了小的雜色素吸收峰。圖3告訴我們,雨生紅球藻蝦青素粉中含有游離蝦青素,不含有蝦青素酯,游離蝦青素的含量不是很高,含有多種雜色素,雜色素的含量比較高。

2.1.3 薄層色譜 由圖4可知,雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素主要為游離蝦青素,除此之外,在游離蝦青素下方出現(xiàn)比較長的紫紅色的雜色素帶。也說明雨生紅球藻蝦青素粉中只含有游離蝦青素,不含有蝦青素酯,含有比較多的紫紅色的雜色素。

2.2 雨生紅球藻蝦青素粉中蝦青素的雙水相分離

2.2.1 雙水相的分相情況

經(jīng)試驗(yàn),雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20% (NH4)2SO4(v/v)=1∶1、1∶1.25、1∶1.5及雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶30%(NH4)2SO4(v/v)=1∶1.5、1∶1.75、1∶2、1∶2.25、1∶2.5組成的8個(gè)體系都能快速分相。而且,分相完全后,8個(gè)體系的上相都為紫紅色,下相無色澄清,上下相交界面上有固體顆粒存在。

同文獻(xiàn)[6]所述相同,8個(gè)體系都有沉淀聚集在上下相之間,但上相是非常明顯的紫紅色,說明8個(gè)體系都不能將提取液中所有色素都沉淀下來,只有少量色素沉淀。為確定中間沉淀出來的色素是蝦青素,還是蝦青素與雜色素的混合物,還是雜色素,需要進(jìn)一步檢測。在進(jìn)一步的檢測時(shí),因?yàn)樯刂饕嬖谟谏舷嗪椭虚g相,因此主要就這兩相進(jìn)行檢測。

2.2.2 高效液相色譜蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖5所示,游離蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=36 308x-5 794.6,R2=0.999 4。

2.2.3 蝦青素沉淀率

制備的兩個(gè)濃度的雨生紅球藻蝦青素提取液中蝦青素濃度分別為:C1=14.09 μg/mL;C2=18.24 μg/mL。

雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液與20%硫酸銨形成的分相體系主要有3個(gè)。如表2所示,隨著硫酸銨體積的增加,上相體積逐漸增加。在兩個(gè)檢測濃度下,3個(gè)雙水相體系上相中的蝦青素與萃取前相比,都減少,說明提取液中的蝦青素在中間相有一定的沉淀。從沉淀率看,隨著20%硫酸銨體積的增加,蝦青素在中間相的沉淀率逐漸增大。2個(gè)濃度的蝦青素提取液,表現(xiàn)出相同的趨勢,都是蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5時(shí)沉淀率最高,都大于70%。

表2 20%硫酸銨和蝦青素提取液的雙水相體系對蝦青素的沉淀效果

雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液與30%硫酸銨形成的分相體系主要有5個(gè)。如表3所示,5個(gè)體系在兩個(gè)檢測濃度下,上相中殘留的蝦青素與萃取前相比,總量都減少,說明提取液中的蝦青素在中間相都有一定的沉淀。如表3所示,隨著硫酸銨體積的增加,上相體積逐漸減少,蝦青素在中間相的沉淀率基本呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢。兩個(gè)個(gè)濃度的蝦青素提取液,表現(xiàn)出相同的趨勢,且都是蝦青素粉乙醇提取液∶30%硫酸銨(v/v)=1∶2.5時(shí),蝦青素在中間相的沉淀率最高,沉淀率大于70%。

表3 30%硫酸銨和蝦青素提取液的雙水相體系對蝦青素的沉淀效果

蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5和蝦青素粉乙醇提取液∶30%硫酸銨(v/v)=1∶2.5兩個(gè)雙水相體系相比,蝦青素在中間相的沉淀率比較接近,都大于70%。本著降低成本的角度,采用蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系從雨生紅球藻蝦青素粉中沉淀蝦青素更有利。

2.2.4 雙水相沉淀蝦青素樣品的純度檢測 對采用蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系制備的中間相沉淀進(jìn)行檢測。

2.2.4.1 高效液相色譜檢測

如圖2所示,游離蝦青素在5.0～5.5 min之間出峰。如圖6所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液中除游離蝦青素外,在5.0 min之前出現(xiàn)多種雜色素吸收峰,為提取液中主要雜色素,6.5～7.0 min之間也出現(xiàn)少量色素。

圖6 雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液

如圖7所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相主要含兩種成分,出現(xiàn)在5.0～5.5 min之間的游離蝦青素為主要成分,另一種為6.5～7.0 min的物質(zhì)。原提取液中在5.0 min之前出現(xiàn)的雜色素在中間相中基本沒有。說明中間相中沉淀出的主要為蝦青素。

圖7 雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相

如圖8所示,雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系的上相,主要為出峰時(shí)間為5.0 min之前的雜色素,游離蝦青素的含量很少。

由以上可知,采用雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系可以使蝦青素很好地在中間相沉淀,不僅沉淀率可達(dá)70%以上,而且純度相對較高,可把提取液中的主要雜色素留在上相。

2.2.4.2 薄層色譜檢測如圖9所示,1∶1.5(20%硫酸銨)雙水相萃取體系中間相(2)中色素基本都為游離蝦青素,基本沒發(fā)現(xiàn)雜色素帶;而上相(4)主要為雜色素帶,基本沒有游離蝦青素的色帶。

注:1:標(biāo)準(zhǔn)品;2:中間相;3:雨生紅球藻蝦青素粉提取液;4:上相

2.2.4.3 紫外-可見光譜檢測

如圖10所示,雨生紅球藻蝦青素粉的提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5雙水相萃取體系中間相與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜很相似,只有一個(gè)大的吸收峰,在473 nm,蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰在476 nm,二者很相近,說明中間相蝦青素純度比較高。上相的吸收峰主要有兩個(gè),在431 nm和531 nm,與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰相差比較大,基本可以看成是雜色素的吸收峰。

圖10 紫外-可見吸收光譜

從高效液相色譜、薄層色譜、紫外-可見光譜分析都可以看出:雨生紅球藻蝦青素粉的提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5體系中間相沉淀為純度比較高的蝦青素,雜色素則被分配于上相。

3 討論

隨著天然蝦青素越來越受到大眾的歡迎,天然蝦青素的提取純化工藝成為研究的熱點(diǎn)。天然蝦青素的分離純化方法有很多,如:超臨界流體萃取、柱色譜法等[8-9],但存在著成本高或操作復(fù)雜等問題。

雙水相萃取法具有分相速度快、低溫、耗能小、適合大規(guī)模操作等優(yōu)點(diǎn)。但雙水相用于色素分離,主要是利用色素在雙水相上下兩相的分配不同,從而將色素萃取到上相或下相來進(jìn)行分離的[10-11]。在前期研究中發(fā)現(xiàn),采用乙醇/硫酸銨雙水相體系萃取蝦殼中蝦青素,可使蝦青素以固相的形式沉淀在兩相之間,采用蝦青素乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.25的體系可以使88.0%以上的蝦殼蝦青素沉淀下來[6]。

本研究原料是5%雨生紅球藻蝦青素粉,是皂化后的蝦青素粉。研究發(fā)現(xiàn),乙醇-硫酸銨雙水相體系可以使蝦青素粉提取液中的游離蝦青素沉淀下來。采用雨生紅球藻蝦青素粉乙醇提取液∶20%硫酸銨(v/v)=1∶1.5的體系可以使70%以上的游離蝦青素沉淀下來而聚集在上下兩相之間,而絕大多數(shù)的雜色素分配在上相。所以可以采用乙醇-硫酸銨雙水相體系從雨生紅球藻蝦青素粉中制備蝦青素沉淀,不僅提取率高,而且純度比較高。該研究進(jìn)一步表明乙醇-硫酸銨雙水相體系在蝦青素純化方面具有潛力。