檢測(cè)時(shí)間和保存方式對(duì)飲用水源水中糞大腸菌群測(cè)定的影響

楊紅力 劉晶

（北京中職安康科技有限公司環(huán)境實(shí)驗(yàn)室，北京 101399）

1 引言

糞大腸菌群（Fecal Coliforms）作為一種糞便污染的指示微生物［1］，具有污染水源從而導(dǎo)致人體腸道疾病的風(fēng)險(xiǎn)［2］，是飲用水源水生物安全中一項(xiàng)重要的檢測(cè)指標(biāo)［3］。由于糞大腸菌群的微生物學(xué)屬性，其生長(zhǎng)和繁殖符合微生物生長(zhǎng)曲線，即大致經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定生長(zhǎng)期、衰亡期4 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期［4］，故其性質(zhì)和一般的理化指標(biāo)完全不同［5］，對(duì)樣品檢測(cè)時(shí)間和保存條件的要求比較特殊［6］。對(duì)于這類樣品，一般的原則是冷藏保存，快速檢測(cè)?，F(xiàn)行的世界各地的標(biāo)準(zhǔn)要求也是這樣規(guī)定的［7］，如中國(guó)的要求是采樣后2 h 內(nèi)檢測(cè)，或0～10 ℃保存，6 h 內(nèi)檢測(cè)［8-10］；美國(guó)是采樣后0～10 ℃保存，8 h 內(nèi)檢測(cè)［11］；歐盟是采樣后5±3 ℃保存，8 h 內(nèi)檢測(cè)［12］；世界衛(wèi)生組織則要求采樣后2 h 內(nèi)檢測(cè)，或4～10 ℃保存，24 h內(nèi)檢測(cè)［13］。總體上都遵循冷藏保存、快速檢測(cè)的原則。但實(shí)際工作中因長(zhǎng)距離運(yùn)輸，如異地采樣，微生物樣品在檢測(cè)之前已經(jīng)保存了較長(zhǎng)時(shí)間［14-15］，使最終檢測(cè)結(jié)果的有效性難以保證［16-17］，因此對(duì)微生物樣品檢測(cè)時(shí)間和保存時(shí)間的研究非常必要。

目前對(duì)微生物樣品檢測(cè)時(shí)間和保存方式的研究多集中在最長(zhǎng)保存時(shí)間和不同溫度點(diǎn)的驗(yàn)證方面［18-19］，對(duì)季節(jié)因素、試驗(yàn)結(jié)果有效性和不同檢測(cè)方法比較的研究鮮有報(bào)道。糞大腸菌群現(xiàn)行的檢測(cè)方法有發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法、紙片法、聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)等，其中前3 種是比較常用的方法［20-22］。本研究擬在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)要求的條件下，以水源水中糞大腸菌群為指標(biāo)，選取上述較常用的3 種方法，在不同季節(jié)、不同保存條件、不同時(shí)間段內(nèi)檢測(cè)目標(biāo)微生物，最后參照GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［22］，以檢測(cè)數(shù)據(jù)的有效性, 針對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)微生物水樣檢測(cè)時(shí)間和保存條件規(guī)定的合理性進(jìn)行探討。

2 試驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

儀器：車載冷藏箱（北京優(yōu)冷，RL-350YS），無(wú)菌采樣袋（青島海博，45 cm×55 cm），高壓蒸汽滅菌器（上海三申，YX280），超凈工作臺(tái)（濟(jì)南鑫貝西，BBSSDC），生化培養(yǎng)箱（上海一恒，LRH-250），拍打式均質(zhì)器（北京陸橋，B01），紫外燈（上海歷辰，365 nm），97 孔定量盤（愛(ài)德士，美國(guó)），程控定量封口機(jī)（愛(ài)德士，CHQC-20），乳糖蛋白胨培養(yǎng)基（陸橋，北京），EC肉體培養(yǎng)基（陸橋，北京），MFC 培養(yǎng)基（陸橋，北京），ONPG-MUG 培養(yǎng)基（Colilert，美國(guó)）。試劑：糞大腸菌群QC 試劑（愛(ài)德士，美國(guó)）。

2.2 樣品采集

分別在冬季和夏季以無(wú)菌采樣的方法采集某水源水引水渠水樣，采樣點(diǎn)離實(shí)驗(yàn)室約20 min 車程，采樣時(shí)記錄當(dāng)時(shí)氣象條件。樣品采集后分兩批保存，一批立即保存于滅過(guò)菌的車載冷藏箱內(nèi)（內(nèi)部溫度3 ℃），另一批保存于滅過(guò)菌的常溫樣品箱內(nèi)。兩批樣品同車運(yùn)送，20 min 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.3 樣品分析

按照標(biāo)準(zhǔn)方法，采用多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法3 種方法，分析不同季節(jié)、不同保存方式下的樣品。第一階段間隔為每0.5 h 1 組，至6.0 h 后進(jìn)入第二階段，時(shí)間間隔為每2.0 h 1 組，至10.0 h 后進(jìn)入第三階段，即24.0 h 后加測(cè)1 組，共15 組。每測(cè)1 組均記錄當(dāng)時(shí)水樣溫度和室溫，每組樣品測(cè)試前需經(jīng)均質(zhì)器拍打，保證樣品的均質(zhì)性。陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和QC 質(zhì)控試驗(yàn)隨各階段同步進(jìn)行。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本研究采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同分析方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，利用雙因素方差分析探討檢測(cè)時(shí)間和保存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，利用t 檢驗(yàn)比較同一檢測(cè)時(shí)間時(shí)不同保存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析在R 軟件中進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同季節(jié)糞大腸菌群生長(zhǎng)結(jié)果

3.1.1 冬季試驗(yàn)結(jié)果

樣品采集后常溫保存，2.0 h 內(nèi)樣品溫度從1.5 ℃升至2.9 ℃，糞大腸菌群繁殖緩慢，從140 個(gè)/L 生長(zhǎng)到200 個(gè)/L（發(fā)酵法），結(jié)果均符合GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的限值要求（≤2 000 個(gè)/L），甚至24.0 h 后結(jié)果依然符合要求，說(shuō)明室溫2.0 h 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求合理有效。冬季常溫保存條件下，不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 冬季常溫保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

樣品采集后冷藏保存，6.0 h 內(nèi)樣品溫度從1.4 ℃升至3.3 ℃，糞大腸菌群繁殖仍然緩慢，從110 個(gè)/L生長(zhǎng)到240 個(gè)/L（發(fā)酵法），結(jié)果均符合GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的限值要求（≤2 000 個(gè)/L），甚至24.0 h 后結(jié)果依然符合要求，說(shuō)明冷藏6.0～10.0 h 內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求合理有效。冬季冷藏保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 冬季冷藏保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

3.1.2 夏季試驗(yàn)結(jié)果

樣品采集后常溫保存，2.0 h 內(nèi)樣品溫度從27.3 ℃升至28.5 ℃，糞大腸菌群快速繁殖，從540 個(gè)/L 生長(zhǎng)到5 400 個(gè)/L（發(fā)酵法），0.5 h 檢測(cè)結(jié)果（540 個(gè)/L）和1.0 h 檢測(cè)結(jié)果（1 400 個(gè)/L）均符合GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的限值要求（≤2 000 個(gè)/L），而1.5 h 檢測(cè)結(jié)果（2 200 個(gè)/L）和2.0 h 檢測(cè)結(jié)果（5 400 個(gè)/L）則不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，即樣品由于保持不當(dāng)和檢測(cè)滯后而致使結(jié)果超標(biāo)，說(shuō)明2.0 h 內(nèi)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求在夏季不適用。10.0 h 和24.0 h 后，糞大腸菌群已經(jīng)迅速繁殖。夏季常溫保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 夏季常溫保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

樣品采集后冷藏保存，6.0 h 內(nèi)樣品溫度從26.1 ℃降至6.2 ℃，糞大腸菌群正常繁殖，從520 個(gè)/L 生長(zhǎng)到1 700 個(gè)/L（發(fā)酵法），結(jié)果均符合GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》的限值要求（≤2 000個(gè)/L），6.0 h 后糞大腸菌群則繁殖加快，至8.0 h 時(shí)結(jié)果超標(biāo)，說(shuō)明冷藏保存條件下6.0 h 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)要求合理有效。夏季冷藏保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 夏季冷藏保存條件下不同檢測(cè)時(shí)間糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果

3.2 3 種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同糞大腸菌群檢測(cè)方法之間的差異，結(jié)果表明，3 種檢測(cè)方法對(duì)不同季節(jié)和不同保存方法下的檢測(cè)結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 3 種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響（單因素方差分析）

3.3 不同季節(jié)檢測(cè)時(shí)間和保存溫度對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果差異性分析

利用雙因素方法分析和t 檢驗(yàn)分析了檢測(cè)時(shí)間與保存溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，具體結(jié)果如圖1。從圖1 可以看出，在冬季，隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，糞大腸菌群檢出的數(shù)值顯著增加（P＜0.001）?？傮w來(lái)看，常溫保存下的糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果要大于冷藏保存（P＜0.05）。在夏季，取樣后0.5 h 時(shí)檢測(cè)，不同保存方式（常溫、冷藏）對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但取樣后1.0 h 時(shí)檢測(cè)，常溫保存樣品中糞大腸菌群的檢出數(shù)值顯著高于冷藏保存樣品（P＜0.01）。并且隨著檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果在兩種保存方式之間的差異越來(lái)越大。

圖1 檢測(cè)時(shí)間和保存溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

4 討論

從試驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見，在冬季，無(wú)論樣品冷藏還是常溫保存，2.0 h 內(nèi)檢測(cè)和10.0 h 內(nèi)檢測(cè)對(duì)結(jié)果的有效性影響不大，甚至24.0 h 后檢測(cè)結(jié)果依然符合要求。說(shuō)明在冬季室溫較低的情況下，保存條件（冷藏或常溫）和檢測(cè)時(shí)間（10.0 h 內(nèi)）對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的影響不顯著。雖然如此，但冷藏樣品檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)（10.0 h 內(nèi)從110 個(gè)/L 生長(zhǎng)到270 個(gè)/L）明顯小于常溫保存（10.0 h 內(nèi)從140 個(gè)/L 生長(zhǎng)到520 個(gè)/L）。對(duì)于較干凈的水樣，這種波動(dòng)也許可以接受，但對(duì)于污染的水樣，則有可能不能完全反映其受污染的程度。因此，在冬季，冷藏保存同樣很有必要。

夏季，由于氣溫高，微生物繁殖旺盛，樣品常溫保存時(shí)，2.0 h 內(nèi)甚至1.5 h 內(nèi)糞大腸菌群已經(jīng)繁殖到超出限值，而冷藏保存6.0 h 內(nèi)檢測(cè)，則對(duì)結(jié)果的有效性影響不大。這說(shuō)明在夏季高溫環(huán)境下，保存條件（常溫）和檢測(cè)時(shí)間對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果的影響顯著，如此則“采樣后2.0 h 內(nèi)檢測(cè)”的標(biāo)準(zhǔn)要求便值得再商榷。

經(jīng)過(guò)分析，3 種檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從檢測(cè)結(jié)果上看，無(wú)論是冷藏還是常溫保存，發(fā)酵法的結(jié)果都比另外2 種方法偏高，濾膜法和酶底物法在數(shù)值增長(zhǎng)上比較一致，可見相比前者，后2 種方法的數(shù)據(jù)更符合實(shí)際。

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析，本研究主要得出以下結(jié)論：

（1）對(duì)于樣品檢測(cè)時(shí)間和保存方式，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的要求值得進(jìn)一步商榷，應(yīng)該考慮季節(jié)的因素，如夏季采樣時(shí)，在常溫保存條件下，采樣后1.0 h 內(nèi)檢測(cè)，或0～4 ℃保存6.0 h 內(nèi)檢測(cè)；冬季采樣，常溫保存條件下，采樣后6.0 h 內(nèi)檢測(cè)，或0～4 ℃保存10.0 h 內(nèi)檢測(cè)。

（2）無(wú)論冬季還是夏季，常溫保存樣品的檢測(cè)結(jié)果均大于冷藏保存，因此，冷藏保存、迅速分析的原則應(yīng)一直貫徹。

（3）就檢測(cè)方法而言，濾膜法和酶底物法更能客觀反映樣品的實(shí)際情況，且在冬季冷藏保存條件下，糞大腸菌群在10.0 h 內(nèi)的結(jié)果均合理有效，對(duì)解決樣品的長(zhǎng)距離運(yùn)輸問(wèn)題也具有現(xiàn)實(shí)意義。