妊娠合并HBV感染患者TRFIA與qPCR檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性研究

成君俐 黃麗芳 陳建斌 鄧常春 吳麗娜

（韶關(guān)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 韶關(guān) 512000）

乙型肝炎感染（HBV）是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的病毒。孕婦一旦感染了乙型肝炎病毒，就會(huì)發(fā)生垂直傳播，對(duì)胎兒造成很大的危害，因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出HBV病毒，對(duì)其進(jìn)行有效的控制和治療是十分重要的[1-2]。目前臨床上常用的檢測(cè)方法有熒光qPCR法、TRFIA法等。其中，qPCR方法是檢測(cè)乙型肝炎病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。TRFIA法主要用于初步評(píng)估機(jī)體是否存在感染，但是不能準(zhǔn)確判斷病毒傳染性的強(qiáng)弱；qPCR方法靈敏度較高，但檢測(cè)時(shí)易受其他因素影響[4-5]。目前關(guān)于qPCR與TRFIA兩種方法檢測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性研究較少，本研究擬對(duì)妊娠合并HBV患者進(jìn)行兩種方法檢測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行評(píng)估，其將有助于對(duì)乙型肝炎患者病情進(jìn)行有效性的診斷與針對(duì)性治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象是2022年1月至2022年12月我院產(chǎn)科住院部及產(chǎn)科門(mén)診收治的妊娠合并乙型肝炎患者100例，并收集保存患者血清樣本。

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡＞20歲；妊娠1～38周；沒(méi)有使用過(guò)治療乙型肝炎藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他嚴(yán)重疾病。

患者樣本的研究經(jīng)申請(qǐng)單位倫理審查會(huì)批準(zhǔn)，并告知所有患者研究?jī)?nèi)容，患者及家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 所有患者入組后均空腹抽取靜脈血5 mL，室溫凝固后離心，吸取上層血清，置于-85 ℃冰箱，直到檢測(cè)。

1.2.1 乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸（HBV-DNA）定量檢測(cè) 患者的血清樣品中的HBV-DNA的濃度都采用了圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?，該試劑盒包含了核酸提取試劑和擴(kuò)增反應(yīng)試劑。操作方法簡(jiǎn)述如下。

試劑準(zhǔn)備：以待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參照物A～D數(shù)量為依據(jù)，按照比例（HBVPCR反應(yīng)液38 μL/人份+HBV酶混合液2 μL/人份+內(nèi)標(biāo)0.2 μL/人份）取對(duì)應(yīng)量的反應(yīng)液、酶混合液及內(nèi)標(biāo)于離心管中，將它們充分混勻成PCR-mix，瞬間離心后備用。將以上制備好的試劑移至樣品處理區(qū)，等待使用。

樣本核酸抽提（在樣本處理區(qū)進(jìn)行）：從抽屜中取出0.2 mL反應(yīng)管（八聯(lián)管）、反應(yīng)管架、離心管架、吸頭以及手套。從試劑盒中取出核酸釋放劑、定量參考品和陰、陽(yáng)性對(duì)照。待上述試劑成分溶解后，使用微型離心機(jī)將核酸釋放劑、定量參考品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照，瞬時(shí)離心，備用。取出n個(gè)0.2 mL反應(yīng)管，使用10 μL移液器向每個(gè)反應(yīng)管中先加入核酸釋放劑5 μL（建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡），然后分別加待測(cè)樣本、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及定量參考品A～D各5 μL，用移液器吸打3～5次混勻。放置10 min，然后用100 μL移液器，向每管中靠壁加入PCR-mix 40 μL，無(wú)須混勻，蓋上管蓋。使用微型離心機(jī)，瞬時(shí)離心后取出（可用手指輕彈，去除氣泡），置于反應(yīng)管架上，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。

PCR擴(kuò)增：將PCR反應(yīng)管放入ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、定量參考品及待檢未知樣本。熒光檢測(cè)通道選擇：①選擇FAM通道檢測(cè)HBV-DNA。②選擇VIC通道檢測(cè)HBV。③參比熒光設(shè)置ROX。循環(huán)參數(shù)設(shè)定：50 ℃ 2 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)保存，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Star值、End值以及Threshold（Star值可以在3～15，End值可設(shè)置在5～20，調(diào)整陰性對(duì)照的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或低于閾值線(xiàn)），點(diǎn)擊Analyze進(jìn)行分析，使各項(xiàng)參數(shù)符合質(zhì)量控制中要求。試劑盒有效檢測(cè)下限為100 IU/mL。

1.2.2 乙型肝炎病毒標(biāo)志物（HBV-M）定量檢測(cè) 時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）檢測(cè)：乙型肝炎兩對(duì)半標(biāo)志物使用TRFIA方法進(jìn)行。檢測(cè)對(duì)血清標(biāo)本中的乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物進(jìn)行測(cè)定。使用Perkin ELmer Easy cuta 1260全自動(dòng)時(shí)間分辨熒光分析系統(tǒng)及其配套試劑對(duì)患者血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)是：①HBsAg＞0.05 ng/mL。②HBs＞10 IU/mL。③HBeAg＞0.1 NCU/mL。④抗-HBe＞0.2 NCU/mL。⑤抗-HBc＞0.9 NCU/mL。

按照實(shí)驗(yàn)室SOP的要求進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)TRFIA檢測(cè)結(jié)果，將乙型肝炎兩對(duì)半五項(xiàng)指標(biāo)陽(yáng)性一致的歸為一類(lèi)，如檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽(yáng)性（大三陽(yáng)）的樣本歸為一類(lèi)，有n份，在這n份樣本中qPCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的為m份，將這兩項(xiàng)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。采用PEMS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料（）進(jìn)行，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在100份血清中使用TRFIA法檢出HBsAg、HBeAg、HBcAb均陽(yáng)性（大三陽(yáng)）29份[29.00%（29/100）]，其中使用qPCR法檢測(cè)HBV-DNA的含量陽(yáng)性27份[93.10%（27/29）]；HBsAg、HBeAb、HBcAb均陽(yáng)性36例[36.00%（36/100）]，其中使用qPCR法檢測(cè)HBV-DNA的含量陽(yáng)性30份[83.33%（30/36）]。TRFIA法檢測(cè)HBV-M陽(yáng)性者（Ⅰ組）71份，使用qPCR法檢測(cè)HBV-DNA的含量陽(yáng)性63份[88.73%（63/71）]；TRFIA法檢測(cè)HBV-M陰性者（Ⅱ組）29份，使用qPCR法檢測(cè)HBV-DNA的含量陽(yáng)性4份[13.79%（4/29）]，其中Ⅰ組HBV-DNA陽(yáng)性率與Ⅱ組進(jìn)行比較，Ⅰ組HBV-DNA陽(yáng)性率高于Ⅱ組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 TRFIA法與qPCR法檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

3 討論

HBV感染是由病毒復(fù)制進(jìn)化、宿主免疫應(yīng)答及環(huán)境因子共同作用所致的，妊娠可引起多種生理變化，產(chǎn)生多臟器效應(yīng)和免疫耐受[6-7]。在妊娠期間，母體的免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)抗原進(jìn)行了適應(yīng)性的耐受，這種情況伴隨著明顯的激素改變，使腎上腺皮質(zhì)激素、黃體酮和雌性激素升高[8-9]。急性乙型肝炎病毒感染轉(zhuǎn)變?yōu)槁砸倚透窝撞《靖腥镜娘L(fēng)險(xiǎn)分別是95%左右發(fā)生在圍生期，20%～30%發(fā)生在1～5歲兒童，而成人低于5%，說(shuō)明慢性HBV感染的孕婦將病毒傳播給胎兒的可能性較大[10]。所以，針對(duì)妊娠婦女的HBV感染狀況，在懷孕前或者懷孕早期，及時(shí)對(duì)HBV進(jìn)行篩查，能夠有效應(yīng)對(duì)可能發(fā)生病毒傳播給胎兒事件。

TRFIA是一種利用稀土元素對(duì)抗原、抗體進(jìn)行標(biāo)記的非同位素免疫分析方法，利用稀土絡(luò)合物的發(fā)光特性，采用時(shí)間分辨的方法對(duì)熒光進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)波長(zhǎng)與時(shí)間的同步測(cè)量，可以有效消除非特異性熒光的干擾，提高分析的特異性[11]。TRFIA檢測(cè)方法是能夠?qū)颊咴跈z測(cè)期間的免疫情況有一個(gè)更好的了解，同時(shí)還能為HBV感染提供一個(gè)間接的證據(jù)，用他來(lái)排查機(jī)體是否感染了HBV，并充分了解到藥物的效果，為醫(yī)師選擇藥物提供依據(jù)。但TRFIA檢測(cè)方法并不能準(zhǔn)確判斷患者體內(nèi)HBV傳染性的強(qiáng)弱。而qPCR作為HBV感染的最直接證據(jù)，具有較高的敏感性和準(zhǔn)確性，是HBV感染的金標(biāo)準(zhǔn)[12]。qPCR可以明確病毒的數(shù)量，可以準(zhǔn)確的判斷HBV在體內(nèi)的復(fù)制情況和傳染性的強(qiáng)弱，可以作為乙型肝炎兩對(duì)半檢查的有力補(bǔ)充。并且該方法的整個(gè)操作過(guò)程均在完全閉管的狀態(tài)下進(jìn)行，不需要開(kāi)蓋電泳，這樣不僅避免了核酸對(duì)環(huán)境的污染，也避免了使用致癌物溴化乙啶對(duì)人體造成的危害。

本研究結(jié)果表明，HBV-DNA與HBeAg呈正相關(guān)，病毒復(fù)制活躍、傳染性強(qiáng)；HBsAb陽(yáng)性是一種保護(hù)性抗體，提示患者感染過(guò)乙型肝炎病毒，病程進(jìn)入恢復(fù)期，無(wú)傳染性。

綜上所述，乙型肝炎病毒標(biāo)志物的含量會(huì)受到人體免疫功能、變異等多種因素的影響，如果僅僅依靠血清乙型肝炎病毒標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果，來(lái)對(duì)病情做出診斷和判斷是不充分的，而且在檢測(cè)HBV-DNA的時(shí)候，很容易受到某些人為或非人為因素的影響，而qPCR與TRFIA方法互相補(bǔ)充，能夠使HBV的檢測(cè)變得更加準(zhǔn)確，能夠更有針對(duì)性地采取相應(yīng)的治療措施。因此，在進(jìn)行臨床工作時(shí)，可以采用兩種方法結(jié)合檢測(cè)，對(duì)妊娠患者的HBV病毒含量進(jìn)行綜合分析，從而對(duì)患者的病情、檢測(cè)感染狀況及病毒的活動(dòng)程度都具有較高的臨床意義。