正交試驗優(yōu)化魚鰾抗氧化肽的提取工藝

郭 鑫，夏子怡，吳 波，夏廣清*，臧 皓*

魚鰾是多數(shù)硬骨魚類具有的一種呼吸輔助器官［1］.魚鰾可分為新鮮魚膠和干制魚膠，干制后呈現(xiàn)淡黃色、角質狀［2］，常用于緩解腎虛滑精等癥狀［3］.魚鰾的化學成分包括粘性蛋白、礦物質和維生素等，其中蛋白含量高達79%［4］.目前，魚鰾作為魚類產品生產中的附屬品，其功能性并未得到高度重視，導致魚鰾的利用率較低.

蛋白質和多肽在生物體內發(fā)揮著重要作用，可調節(jié)生理功能，包括清除體內自由基，調節(jié)身體亞健康等多種癥狀［5-6］.董倍余等［7］采用水酶法制備鯽魚多肽，該多肽具有較強清除DPPH 自由基的能力.周勰等［8］采用水酶法制備烏賊纏卵腺多肽，結果顯示該多肽對羥自由基等具有良好的清除能力且呈現(xiàn)劑量依賴性.張麗娜等［9］發(fā)現(xiàn)魚籽多肽可通過清除ROS 降低細胞氧化應激水平，進而提高抗氧化能力.多數(shù)研究表明，動物類多肽具有較好的抗氧化活性且和相對應的提取工藝有關.因此，本文對魚鰾多肽的提取工藝進行了優(yōu)化，以期為進一步的活性評價提供理論基礎.海洋類動物的蛋白與多肽大部分具有用藥劑量小、效果好等優(yōu)點［10-11］，因此具有較廣闊的發(fā)展前景.本研究采用水酶法進行提取，參照小球藻多肽的方法［12］，優(yōu)化了提取魚鰾多肽的工藝.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干燥魚鰾，通化皇嘉鹿業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（60 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g），北京索萊寶公司.ReadMax1900Plus 型光吸收酶標儀，上海閃普生物科技公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶解法制備魚鰾多肽工藝

取干燥魚鰾，稱量，剪碎，放入水中浸泡，4 ℃過夜后，溫度60 ℃煮1 h，倒入組織搗碎勻漿機，攪拌30 min，待其變成黏液狀物質后，水浴60 ℃下1 h 進行兩次提取，并合并濾液，冷卻至室溫后進行pH 調節(jié)，隨后加入酶酶解（表1），待酶解結束后沸水中滅酶10 min，離心，取上清液置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥50 h，即得魚鰾多肽.

表1 不同蛋白酶最適水解參數(shù)

1.2.2 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的工藝優(yōu)化

單因素實驗：考查酶解過程中pH、酶添加量、酶解時間和酶解溫度對ABTS 清除率的影響.固定反應條件中酶添加量10 000 U/g，酶解時間5 h，酶解溫度60 ℃，考察溶液pH（7、8、9、10、11）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，時間5 h，溫度60 ℃，考察酶添加量（6 000 U/g、8 000 U/g、10 000 U/g、12 000 U/g、14 000 U/g）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解溫度60 ℃，考察酶解時間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h）對ABTS 清除率的影響；固定反應條件pH 9，酶添加量10 000 U/g，酶解時間5 h，考察酶解溫度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）對ABTS清除率的影響.

正交試驗設計：根據(jù)堿性蛋白酶最適水解條件及單因素試驗結果，選用正交試驗探究各條件間的交互作用對ABTS 清除率的影響，進而得到魚鰾多肽酶解的最佳工藝（表2）.

2 結果與分析

2.1 各蛋白酶最適條件下的ABTS 清除率

如圖1 所示，不同蛋白酶酶解多肽的ABTS清除率存在一定的差異，但均呈現(xiàn)劑量依賴性，隨著多肽劑量的增加，ABTS 清除率不斷升高.在各個濃度顯示的結果當中，堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率均顯著高于胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解多肽；在濃度為5 mg/mL時，堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最大，為91.32%±3.21%，胰蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率為80.53%±3.24%，胃蛋白酶酶解魚鰾多肽的ABTS 清除率最低，為52.63%±1.34%.比較三種不同蛋白酶酶解魚鰾多肽的情況，在后續(xù)的實驗中選取具有更高ABTS 清除率的堿性蛋白酶進行魚鰾多肽酶解工藝的優(yōu)化.

圖1 各蛋白酶最適條件下的ABTS 清除率

2.2 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽單因素試驗結果

2.2.1 pH 對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS清除率的影響

圖2 顯示，ABTS 清除率隨溶液pH 值的增大而逐漸增加，當pH 值為10 時，達到ABTS 清除率的最大值；但隨著pH 值繼續(xù)增大，反而抑制了ABTS 的清除率.因此，在本試驗條件下，適宜的pH 值為10.

圖2 pH 對ABTS 清除率的影響

2.2.2 酶添加量對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖3 顯示，酶添加量小于12 000 U/g 時，ABTS 清除率呈顯著升高趨勢（P<0.05），酶添加量為12 000 U/g 時，ABTS 清除率達到最大值.因此，選擇酶添加量12 000 U/g 時為最佳.

圖3 酶添加量對ABTS 清除率的影響

2.2.3 酶解時間對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖4 顯示，ABTS 清除率在3～6 h 之間顯著提高（P<0.05），魚鰾多肽的ABTS 清除率隨酶解時間的延長不斷增加，6 h 時達到最大值，隨后，ABTS 清除率變化不顯著（P>0.05）.考慮成本等原因，選擇6 h 作為適宜酶解時間.

圖4 酶解時間對ABTS 清除率的影響

2.2.4 酶解溫度對堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽ABTS 清除率的影響

圖5 顯示，溫度在45～60 ℃時，魚鰾多肽ABTS 清除率顯著提高（P<0.05），此時魚鰾多肽ABTS 清除率達到最大值.溫度高于60 ℃后，魚鰾多肽可能有部分發(fā)生變性，魚鰾多肽的ABTS 清除率下降.所以選擇適宜酶解溫度為60 ℃.

圖5 酶解溫度對ABTS 清除率的影響

2.3 堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽正交試驗結果

在單因素實驗基礎上，采用正交試驗篩選出最佳工藝參數(shù)（表3）.

表3 正交試驗設計及結果

影響堿性蛋白酶酶解魚鰾多肽工藝的主次因素分別為酶添加量、酶解時間、酶解溫度和pH，最佳提取條件是A1B3C1D1.在此條件下，測得魚鰾多肽為2 mg/mL 時，ABTS 清除率為43.25%±0.95%.

3 結語

本研究以魚鰾多肽的ABTS 清除率作為評價指標進行最優(yōu)酶的篩選和進一步的工藝優(yōu)化，采用正交試驗優(yōu)化魚鰾多肽的提取工藝，得到最優(yōu)的提取方案，即：提取pH 9、酶添加量10 000 U/g、時間5 h、溫度60 ℃.本試驗確定了魚鰾多肽的最佳提取方案，可為魚鰾多肽的現(xiàn)代應用提供參考，為魚鰾食品藥品的相關方向研究與開發(fā)提供依據(jù).