蒙花錨肝寧片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

問靜，韓達(dá)斌，汪永明，王永晶，祁彥凱，劉海青，劉學(xué)良（青海省藥品審評核查中心，西寧 810007）

蒙花錨肝寧片是由橢圓葉花錨（Halenia ellipticaD.Don）的帶花全草經(jīng)70%乙醇提取、濃縮后加工制成的浸膏片，具有清“協(xié)日”，利膽退黃的功效，臨床用于治療“協(xié)日”熱引起的肝膽熱癥，黃疸[1]。橢圓葉花錨，藏名甲地然果，為龍膽科植物橢圓葉花錨的干燥地上部分，花期采收，全草入藥，產(chǎn)于西藏、青海、云南、貴州等地，文獻(xiàn)記載該藥材具有清熱利濕，平肝利膽之功效[1-3]。目前，蒙花錨肝寧片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn) 蒙藥分冊》[1]，只有性狀、薄層鑒別及檢查項（片劑制劑通則項目），專屬性不強，無含量測定項目。為了更全面地控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，本試驗將蒙花錨肝寧片進(jìn)行定性定量研究，建立了橢圓葉花錨的薄層色譜鑒別方法，采用高效液相色譜法對橢圓葉花錨中主要成分進(jìn)行了含量測定研究。研究證明，該方法簡便快捷，專屬性強，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2998型二極管陣列檢測器（美國沃特世有限公司），ME204電子天平[感量0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，XS105DU型分析天平（感量0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司），SB25-12DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），Milli-Q2355型超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試藥

木犀草素（批號：111720-202111，含量：99.1%）、熊果酸（批號：110742-200517，含量：99.3%）、當(dāng)藥苷（批號：111742-200501，含量：99.27%）、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮（批號：111744-200501，含量：100.0%）（中國食品藥品檢定研究院）。甲醇（色譜純，德國默克股份兩合公司）；磷酸（色譜純，上海安譜試驗科技股份有限公司）；水為超純水。硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。5批蒙花錨肝寧片樣品（規(guī)格：0.25 g，批號：190803、190804、190805、190806、190807，三普藥業(yè)有限公司）。橢圓葉花錨藥材采自青海省互助縣北山林場（2022年7月29日花期采集），經(jīng)青海省藥品審評核查中心劉海青主任藥師鑒定為橢圓葉花錨的干燥帶花全草，在試驗中作為對照藥材使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別[4-9]

圖1 1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮TLC鑒別圖（T：19℃，RH：43%）Fig 1 TLC chromatography of l-hydroxy-3，4，5-trimethoxyxanthon（T：19℃，RH：43%）

2.1.2 熊果酸的鑒別 分別取5批次蒙花錨肝寧片，除去包衣，研細(xì)，各稱取0.25 g，置具塞錐形瓶中，加5 mL乙酸乙酯超聲處理（頻率35 kHz，功率350 W）15 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。再取橢圓葉花錨對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。陰性樣品溶液按處方比例去除橢圓葉花錨，并按供試品溶液方法制備。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則 0502）試驗，吸取上述 4種溶液各4 μL，分別點于硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃加熱至斑點顯色清晰。在日光下檢視，供試品在與對照色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點。后置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同的橙黃色熒光斑點，陰性樣品無干擾（見圖2）。

圖2 熊果酸TLC鑒別圖（T：23℃，RH：38%）Fig 2 TLC chromatography of ursolic acid（T：23℃，RH：38%）

2.2 含量測定[10-17]

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Waters SunFir ODS C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），用甲醇-0.05%磷酸溶液為流動相，進(jìn)行梯度洗脫（見表1），流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30℃；檢測波長為254 nm；進(jìn)樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取木犀草素對照品7.13 mg，1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮對照品14.30 mg，當(dāng)藥苷對照品10.10 mg，分別置100 mL、20 mL、100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.0707 mg·mL-1的木犀草素對照品溶液，0.7150 mg·mL-1的1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮對照品溶液，0.1003 mg·mL-1的當(dāng)藥苷溶液。取上述3種對照品溶液2 mL、5 mL、1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含木犀草素0.0028 mg·mL-1、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮0.0715 mg·mL-1、當(dāng)藥苷0.0020 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取蒙花錨肝寧片樣品（批號：190803）適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.22 μm濾過，取續(xù)濾液作為HPLC測定供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 蒙花錨肝寧片由橢圓葉花錨單味藥材制成，故陰性樣品溶液為取輔料按供試品溶液的制備方法制得。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，進(jìn)樣測定，采用外標(biāo)兩點法對峰面積和進(jìn)樣濃度進(jìn)行計算。在本文色譜條件下木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷與樣品中其他成分分離良好，陰性樣品無干擾，理論板數(shù)均不低于3000，與樣品中其他相鄰成分分離度均大于1.5（見圖3）。

圖3 蒙花錨肝寧片HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of Menghuamao Ganning tablet

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，稀釋成系列濃度對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量對峰面積進(jìn)行回歸，計算回歸方程及線性范圍，結(jié)果見表2。3種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表2 3種成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Regression equation，linearity and correlation coefficients of 3 components

2.2.7 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測得木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷峰面積RSD分別為1.4%、0.13%、1.2%，結(jié)果表明方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、8、16、24 h進(jìn)行測定，記錄峰面積，測得木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷峰面積RSD分別為1.0%、0.57%、0.69%，結(jié)果表明供試品中木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取蒙花錨肝寧片樣品（批號：190803）6份，按“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，計算木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷平均含量分別為1.057 mg/片、4.936 mg/片、0.194 mg/片，其RSD分別為0.49%、0.92%、0.86%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗 精密稱取木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷對照品適量，經(jīng)稀釋得到質(zhì)量濃度依次為0.0419 mg·mL-1、0.1964 mg·mL-1、0.0079 mg·mL-1的混合對照品溶液。稱取蒙花錨肝寧片樣品（批號：190803）9份，每份0.1 g，研細(xì)，精密稱定，置錐形瓶中，3份一組，每組分別精密加入上述混合對照品溶液5、10、15 mL，再依次加甲醇20、15、10 mL，按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷低、中、高平均回收率及RSD值分別為98.92%（1.3%）、98.52%（0.97%）、98.28%（1.2%），97.15%（1.3%）、97.65%（1.0%）、96.76%（1.2%），99.26%（0.84%）、98.35%（1.1%）、97.65%（0.72%），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.11 樣品含量測定 5批次蒙花錨肝寧片粉末各取約0.1 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并計算各批次蒙花錨肝寧片中木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮、當(dāng)藥苷的含量。結(jié)果5批次蒙花錨肝寧片中木犀草素含量在0.75～1.05 mg/片、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮含量在3.88～5.02 mg/片、當(dāng)藥苷含量在0.12～0.20 mg/片，見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果(n＝5)Tab 3 Content of samples (n＝5)

3 討論

3.1 薄層色譜展開劑的考察

蒙花錨肝寧片是由橢圓葉花錨提取制成的單方制劑，在《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊》中僅有對照藥材的薄層鑒別方法，專屬性不強。本試驗在對照藥材的基礎(chǔ)上增加了1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮對照品的鑒別，分別考察了石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（7∶3）、石油醚（60～90℃）-氯仿-乙酸乙酯-水（10∶4∶4∶1）、石油醚（60～90℃）-丙酮（7∶3）、環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯（15∶5∶2）等不同展開劑，最終選擇石油醚（60～90℃）-丙酮（7∶3）作為展開劑。同時，參考《中國藥典》2020年版一部山楂項下鑒別方法及其他文獻(xiàn)，以硅膠G板，甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）為展開劑，建立了蒙花錨肝寧片中熊果酸的薄層鑒別方法。經(jīng)方法學(xué)驗證，上述兩個薄層色譜鑒別方法無陰性干擾，斑點清晰，分離良好，專屬性、重復(fù)性、耐用性均符合要求，可以用于蒙花錨肝寧片的鑒別。

3.2 對照品的選擇和色譜條件的確定

在含量測定預(yù)試驗中，參考相關(guān)研究文獻(xiàn)，結(jié)合木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮和當(dāng)藥苷3種對照品溶液的紫外光譜掃描結(jié)果，最終選擇紫外檢測波長為254 nm。同時對甲醇-水，甲醇-冰醋酸溶液，甲醇-0.2%磷酸，乙腈-水，乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相進(jìn)行考察，結(jié)果以甲醇-0.05%磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫時基線較平穩(wěn)，對待測組分峰無干擾。

3.3 樣品結(jié)果分析

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒙花錨肝寧片5批次樣品之間被測成分木犀草素、1-羥基-3，4，5-三甲氧基酮和當(dāng)藥苷含量差距較小，分析其原因，一方面因蒙花錨肝寧片為獨家品種，從國家藥品監(jiān)督局網(wǎng)站查詢顯示，蒙花錨肝寧片只獲批一個批準(zhǔn)文號（國藥準(zhǔn)字Z63020121），生產(chǎn)企業(yè)為三普藥業(yè)有限公司，樣本量較少；另一方面，經(jīng)與企業(yè)質(zhì)控人員進(jìn)行溝通，得知企業(yè)所用橢圓葉花錨為青海地產(chǎn)藥材，每年固定在青海省大通縣境內(nèi)、藥材花期進(jìn)行采集，產(chǎn)地和來源相對穩(wěn)定，藥品生產(chǎn)工藝簡單，從而使得樣品中有效成分含量相對穩(wěn)定。

本試驗首次建立了蒙花錨肝寧片2種有效成分的定性鑒別及3種有效成分的HPLC定量測定的方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，該方法簡便、高效、準(zhǔn)確，能夠為蒙花錨肝寧片的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。