基于TLR4、NF-κB信號(hào)通路探討當(dāng)歸拈痛湯治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制

劉毓，楊釗田，孫理軍（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少致使尿酸鹽在關(guān)節(jié)囊、滑膜囊、軟骨、骨質(zhì)等處沉積結(jié)晶而引起的慢性關(guān)節(jié)炎[1]，證屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，發(fā)作時(shí)關(guān)節(jié)紅腫熱痛，濕熱蘊(yùn)結(jié)、阻滯關(guān)節(jié)等是其基本病機(jī)[2-4]。目前，GA急性發(fā)作期的主要治療方法包括抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)尿酸排泄，但臨床效果不理想，不良反應(yīng)明顯[5]。當(dāng)歸拈痛湯具有清熱利濕、疏風(fēng)止痛的效果，治療GA有較好的療效[6]?；诖耍狙芯坷镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法挖掘當(dāng)歸拈痛湯改善GA的潛在作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，探討當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA的作用機(jī)制，為當(dāng)歸拈痛湯用于臨床治療提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥

當(dāng)歸拈痛湯組成為羌活15 g，防風(fēng)9 g，升麻3 g，葛根6 g，麩炒白術(shù)3 g，當(dāng)歸9 g，黨參6 g，甘草15 g，苦參6 g，黃芩3 g，鹽知母9 g，茵陳15 g，豬苓9 g，鹽澤瀉9 g，蒼術(shù)9 g（陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）。雙氯芬酸鈉緩釋片（規(guī)格：75 mg/片，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：H10980297）。尿酸鈉鹽（MSU，美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)：U2875-5G），HE染液（珠海BASO公司，貨號(hào)BA4025），Anti-NFκBp65（RELA）抗體（武漢boster公司，貨號(hào)A00284-1），抗兔/抗小鼠二抗（上海威奧公司，貨號(hào)WB0177/WB0176），IL-1β、IL-13 ELISA試劑盒（武漢boster公司，貨號(hào)分別為EK0393、EK0900），TNF-αELISA試劑盒（NOVUS公司，貨號(hào)VAL902）。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，體重（200±20）g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030]，22～27℃飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，動(dòng)物自由飲水?dāng)z食。本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（批件號(hào)：SUCMDL20210305006）。

1.3 儀器

BX51顯微鏡（日本奧林巴斯），165-8001電泳儀、170-3930轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad），TL-2010S組織勻漿器（北京鼎昊源公司），F(xiàn)resco21臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、MutiskanTM GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo），TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭公司），BS-220生化分析儀（深圳邁瑞公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.1.1 當(dāng)歸拈痛湯方有效成分及靶點(diǎn)的篩選 當(dāng)歸拈痛湯由羌活、防風(fēng)、升麻、葛根、白術(shù)、當(dāng)歸、黨參、甘草、苦參、黃芩、知母、茵陳、豬苓、澤瀉、蒼術(shù)十五味藥組成，通過TCMSP（https：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得方中各中藥的化學(xué)成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%及類藥性（DL）≥0.18進(jìn)行活性成分篩選。

2.1.2 GA的候選靶點(diǎn)的篩選 分別在OMIM（https：//www.omim.org/）和GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“gouty arthritis”為檢索詞進(jìn)行檢索，獲得GA的相關(guān)靶點(diǎn)基因。對(duì)兩數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果進(jìn)行篩選合并去重，得到疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.3 PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將當(dāng)歸拈痛湯與GA的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫(kù)中，以人為目標(biāo)物種，生成TSV文件。最終將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。

2.1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)GO分析及KEGG富集分析 為了探究當(dāng)歸拈痛湯在治療GA過程中涉及到的生物學(xué)功能和途徑，本研究使用R語言對(duì)候選靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，P值小于0.05的GO術(shù)語或KEGG通路被認(rèn)為是有顯著意義的。

2.2 實(shí)驗(yàn)用藥制備

2.2.1 MSU溶液的制備 將1000 mg MSU，充分研磨后，加入36 mL 0.9%氯化鈉溶液，再加入4 mL吐溫-80（兩者體積比為 9∶1），再加入1 mL 1.5 mol·L-1NaOH，加熱攪拌，配制成25 mg·mL-1的MSU混懸液，4℃保存，用前搖勻。

2.2.2 雙氯芬酸鈉混懸液的制備 將200 mg雙氯芬酸鈉緩釋片溶于299 mL超純水中，制成質(zhì)量濃度為0.67 mg·mL-1的雙氯芬酸鈉混懸液，密封。

2.2.3 當(dāng)歸拈痛湯制備 稱取處方量中藥飲片，于煎藥?kù)抑屑尤?00 mL蒸餾水將各味藥物浸泡30 min。武火煮沸后轉(zhuǎn)文火煎煮40 min，將藥液倒出備用。往藥?kù)抑屑尤?00 mL蒸餾水進(jìn)行二次煎煮，武火煮沸后文火煎煮30 min。將兩次煎煮所得藥液混合，紗布過濾后轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至0.56 g·mL-1。冷卻后裝入滅菌50 mL離心管中-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

將24只雄性SPF級(jí)SD大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行編號(hào)（1～24號(hào)），采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、雙氯芬酸鈉組、當(dāng)歸拈痛湯中藥組，每組各6只。除空白對(duì)照組外，其余3組大鼠參照Coderre等[7]造模方法予大鼠右后側(cè)踝關(guān)節(jié)一次性注射25 mg·mL-1MSU溶液0.2 mL，建立急性GA模型，以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)?？瞻讓?duì)照組大鼠右后側(cè)踝關(guān)節(jié)注射0.2 mL生理鹽水。于造模后開始灌胃給藥，每日1次，灌藥周期參照臨床治療周期，共7 d。

驗(yàn)證造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：肉眼觀察造模后大鼠右踝關(guān)節(jié)明顯紅腫、行走緩慢。炎癥高峰時(shí)可見造模關(guān)節(jié)較健側(cè)關(guān)節(jié)紅腫明顯，皮溫升高，骨性標(biāo)志消失，足爪卷曲、行走遲緩，嚴(yán)重者后肢過度俯曲跛行，甚則表現(xiàn)為三足步態(tài)，提示造模成功。

2.4 實(shí)驗(yàn)給藥

雙氯芬酸鈉組按成人每日雙氯芬酸鈉緩釋片常用量150 mg，依據(jù)人與大鼠的體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)，按照成人體重70 kg換算得出每日藥物用量為13.39 mg·kg-1；大鼠當(dāng)歸拈痛湯組藥量為每日11.25 g·kg-1；空白對(duì)照組與模型對(duì)照組予0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組灌胃量均為20 mL/（kg·d）（5 mL）。

2.5 實(shí)驗(yàn)取材與檢測(cè)

2.5.1 一般情況 觀察大鼠精神、毛發(fā)、行動(dòng)、飲食、排便、死亡等情況。

2.5.2 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)定 造模前，在大鼠右踝關(guān)節(jié)上方 0.5 mm 處用記號(hào)筆劃一條清晰的直線，用自制簡(jiǎn)易足趾容積測(cè)量裝置分別于造模前（0 h）、造模后4、8、24、48、72 h測(cè)定大鼠關(guān)節(jié)容積（將10 mL針筒和2.5 mL 針筒相連接，將大鼠右后肢按照劃線放入10 mL針筒內(nèi)，讀數(shù)，另一側(cè)2.5 mL針筒液面的前后差值即為足趾容積值）。

關(guān)節(jié)腫脹度＝造模后各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)容積-造模前關(guān)節(jié)容積。

2.5.3 樣本采集 給藥結(jié)束后所有大鼠禁食12 h，不禁水，隨后處死取材，腹腔注射水合氯醛麻醉，麻醉劑量為9 mg·kg-1，腹主動(dòng)脈取血，血液靜置1～2 h，離心15 min（4℃、3500 r·min-1，離心半徑15.7 cm），吸取上層血清，分裝，-20℃保存。以大鼠受試踝關(guān)節(jié)為中心，常規(guī)備皮、消毒，切取關(guān)節(jié)囊，分離滑膜組織，保存所需組織。

2.5.4 肝功能、腎功能、IL-1β、IL-13、TNF-α檢測(cè) 以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠肝功能[谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）]、腎功能[尿素（UREA）和肌酐（CREA）]水平。按試劑盒說明，常規(guī)方法測(cè)定大鼠血清中IL-1β、IL-13、TNF-α的濃度。

2.5.5 關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察 取各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織多聚甲醛固定24 h后脫水，依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，載玻片固定后脫蠟、乙醇梯度脫水、蒸餾水浸洗后蘇木素浸染3 min，伊紅浸染1 s，脫水烘干后中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.5.6 關(guān)節(jié)滑膜組織TLR4、NF-κB-p65蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取關(guān)節(jié)滑膜組織總蛋白，BCA法測(cè)定組織蛋白濃度，將所有樣本蛋白調(diào)整至同一濃度后，100℃使蛋白變性，5 min后放置于冰上冷卻，離心取上清液。以每孔10 μL上樣，進(jìn)行電泳，待指示劑到達(dá)距凝膠下端約0.5 cm處時(shí)取出膠板，并在低溫條件下轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束立即取出PVDF膜，放置于5%BSA室溫封閉，2 h后，用1×TBST洗膜3次，5 次·min-1。加入抗體TLR4（1∶1000）、NF-κB（1∶1000）、β-actin（1∶2000），4℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，5 次·min-1。加入HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，1×TBST清洗5次，15 次·min-1。配制化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑（試劑A∶試劑B＝1∶1）并與膜孵育2 min，曝光顯影。以β-actin蛋白表達(dá)量進(jìn)行校正，借助Image J軟件分析各蛋白灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較，若方差齊，采用LSD 法；方差不齊，采用Tamhane’s T2 法。偏態(tài)分布資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q25，Q75）]表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

3.1.1 當(dāng)歸拈痛湯活性成分及候選靶點(diǎn)的篩選從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出來自15種中藥的315個(gè)活性成分。檢索結(jié)果表明羌活中活性成分15個(gè)，防風(fēng)中18個(gè)、升麻中17個(gè)、葛根中4個(gè)、白術(shù)中7個(gè)、當(dāng)歸中2個(gè)、黨參中21個(gè)、甘草中92個(gè)、苦參中45個(gè)、黃芩中36個(gè)、知母中15個(gè)、茵陳中13個(gè)、豬苓中11個(gè)、澤瀉中10個(gè)、蒼術(shù)中9個(gè)。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，共獲得253種活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。同時(shí)，從GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得疾病靶點(diǎn)1762個(gè)，并將活性成分潛在作用靶點(diǎn)和GA相關(guān)靶點(diǎn)均轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)基因名。Venn交集處理之后獲得兩者的共同靶點(diǎn)110個(gè)，這些靶點(diǎn)被認(rèn)為是當(dāng)歸拈痛湯治療GA的候選靶點(diǎn)?！爸兴?活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中含有311個(gè)節(jié)點(diǎn)和1194條邊。在該網(wǎng)絡(luò)中，從活性成分角度來看，甘草異黃酮（licoisoflavone，63343-94-2）、漢黃芩素（wogonin，632-85-9）、磷脂查爾酮（glypallichalcone，146763-58-8）、鱗葉甘草素A（glepidotin A，42193-83-9）、粗毛甘草素C（glyasperin C，142474-53-1）等可能是當(dāng)歸拈痛湯治療GA的關(guān)鍵活性成分。

3.1.2 當(dāng)歸拈痛湯治療GA的PPI網(wǎng)絡(luò)分析為了探究共同靶點(diǎn)之間的互作關(guān)系，將其導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)分析平臺(tái)，以人為目標(biāo)物種，生成TSV文件。用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建PPI，如圖1所示共得到108個(gè)有效節(jié)點(diǎn)，1867條邊，節(jié)點(diǎn)越大表明靶點(diǎn)degree值（度值）越高，在PPI網(wǎng)絡(luò)中，度值較高的蛋白在中心關(guān)聯(lián)中起著重要的作用。以度值大小作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得排名前20的候選靶點(diǎn)，分別是VEGFA、STAT3、PTGS2、PPARG、VCAM1、RELA、MMP9、MYC、NFKBIA、STAT1、SERPINE1、PPARA、MMP2、MTOR、IL-6、NOS3、SELE、JUN、SPP1、MAPK3。

圖1 當(dāng)歸拈痛湯治療GA的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig 1 Protein interaction network of Danggui Niantong decoction for gouty arthritis

3.1.3 高頻藥物的GO分析和KEGG分析 通過使用R4.1.1數(shù)據(jù)包對(duì)所篩選出的基因列表進(jìn)行GO富集分析功能，選取P＜0.01的20條通路得到氣泡圖，見圖2。分子功能中排名前3的分別是DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、磷酸酶結(jié)合和RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。生物過程排名前3的分別是對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)菌來源分子的反應(yīng)和對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)。細(xì)胞成分排名前3的是膜筏、膜微區(qū)和囊泡腔。

圖2 當(dāng)歸拈痛湯治療GA的GO富集分析Fig 2 GO enrichment analysis of Danggui Niantong decoction in GA treatment

通過KEGG通路富集篩選得到175條信號(hào)通路，故選取P＜0.01的30條通路，見圖3。經(jīng)過KEGG通路富集篩選，選取與GA相關(guān)的通路，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)基因在NF-κB信號(hào)通路（NF-κB signaling pathway）、Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）及TNF信號(hào)通路（TNF signalingpathway）上富集的較多。

圖3 當(dāng)歸拈痛湯作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析Fig 3 KEGG enrichment analysis of the target of Danggui Niantong decoction

3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 一般情況 造模前各組大鼠精神良好，反應(yīng)迅捷，毛發(fā)有光澤，飲食排便正常。造模后，除空白對(duì)照組外，其余各組大鼠均出現(xiàn)不同程度的右踝關(guān)節(jié)紅腫、足爪卷曲、行走遲緩、跛行，甚至表現(xiàn)為三足步態(tài)。模型對(duì)照組與給藥組大鼠均出現(xiàn)活動(dòng)量及飲食量減少，體重減輕。模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)枯槁，大便稀溏；給藥組大鼠精神欠佳，皮毛欠光澤，好于模型對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)大鼠死亡。

3.2.2 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠型空關(guān)節(jié)腫脹度的影響 造模后4 h，模型對(duì)照組踝關(guān)節(jié)腫脹度較空白對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；造模后8 h，模型對(duì)照組較空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），各給藥組關(guān)節(jié)腫脹度均有降低，雙氯芬酸鈉組較模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后模型對(duì)照組較空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），給藥組關(guān)節(jié)腫脹度持續(xù)降低，造模后48、72 h與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），見表1。

表1 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

表1 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響(±s，n＝6，mL)Tab 1 Effect of Danggui Niantong decoction on ankle swelling in GA rats (±s，n＝6，mL)

注：與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量/（g·kg-1）造模后時(shí)間4 h8 h24 h48 h72 h空白對(duì)照組0.16±0.040.14±0.040.08±0.050.05±0.050.03±0.04模型對(duì)照組0.66±0.10##0.64±0.10##0.57±0.10##0.50±0.09##0.41±0.04##雙氯芬酸鈉組0.000 670.63±0.070.47±0.09*0.36±0.07**0.28±0.05**0.14±0.04**當(dāng)歸拈痛湯組0.560.67±0.130.50±0.140.46±0.130.38±0.10*0.21±0.05**

3.2.3 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠血清炎癥因子水平的影響 血清炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-13在模型對(duì)照組中較空白對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01），IL-1β、TNF-α各給藥組中均有降低，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。IL-13給藥組較模型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體見表2。

表2 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影響(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

表2 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠血清IL-1β、IL-13、TNF-α的影響(±s，n＝6)Tab 2 Effect of Danggui Niantong decoction on the serum IL-1β，IL-13 and TNF-α in GA rats (±s，n＝6)

注：與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the blank control group，##P＜0.01；compared with the model control group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別劑量/（g·kg-1）IL-1β/（pg·mL-1）IL-13/（pg·mL-1）TNF-α/（pg·mL-1）空白對(duì)照組24.32±1.39 8.17±0.4368.44±3.10模型對(duì)照組31.82±2.10##17.99±1.08##83.21±3.20##雙氯芬酸鈉組0.000 6725.51±0.82**16.38±1.2367.95±0.89**當(dāng)歸拈痛湯組0.5626.80±1.28**16.34±1.0479.24±1.83*

3.2.4 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠肝腎功能的影響如表3所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組ALT、AST差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除雙氯芬酸鈉組ALT較模型對(duì)照組下降外，其余各給藥組ALT、AST水平與模型對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示各組藥物未對(duì)大鼠肝功能造成不良損害。

表3 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠ALT、AST的影響(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

表3 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠ALT、AST的影響(±s，n＝6)Tab 3 Effect of Danggui Niantong decoction on ALT and AST in GA rats (±s，n＝6)

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

組別劑量/（g·kg-1）ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）空白對(duì)照組33.24±1.51137.87±27.18模型對(duì)照組34.59±2.40138.33±31.57雙氯芬酸鈉組0.000 6726.50±4.33*158.02±45.26當(dāng)歸拈痛湯組0.5633.82±4.36103.05±10.60

如表4所示，與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組UREA、CREA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；除雙氯芬酸鈉組UREA較模型對(duì)照組有所下降（P＜0.05），其余各組UREA、CREA與模型對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示各組藥物未對(duì)大鼠腎功能造成不良損害。

表4 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠UREA、CREA的影響(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

表4 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠UREA、CREA的影響(±s，n＝6)Tab 4 Effect of Danggui Niantong decoction on UREA and CREA of GA rats (±s，n＝6)

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05。Note：Compared with the model control group，*P＜0.05.

CREA/（μmol·L-1）空白對(duì)照組6.19±1.0943.61±5.61模型對(duì)照組7.03±1.3043.78±6.64雙氯芬酸鈉組0.000 674.28±0.88*41.01±4.54當(dāng)歸拈痛湯組0.564.95±0.641.08±4.93組別劑量/（g·kg-1）UREA/（mmol·L-1）

3.2.5 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)的影響 根據(jù)大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色結(jié)果可知，空白對(duì)照組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，無腫脹增生，未見或僅見極少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組滑膜細(xì)胞增生，局部可見細(xì)胞變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。雙氯芬酸鈉組相比于模型對(duì)照組，炎性細(xì)胞明顯減少，部分滑膜細(xì)胞增生，當(dāng)歸拈痛湯組見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部有滑膜輕度增生。見圖4。

3.2.6 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR4、NF-κB-p65蛋白表達(dá)的影響 由圖5～6可知，TLR4蛋白在模型對(duì)照組中表達(dá)較空白對(duì)照組升高（P＜0.01），雙氯芬酸鈉組、當(dāng)歸拈痛湯組表達(dá)較模型對(duì)照組降低（P＜0.05，P＜0.01）。NF-κB-p65蛋白在模型對(duì)照組中表達(dá)較空白對(duì)照組升高（P＜0.01），雙氯芬酸鈉組與當(dāng)歸拈痛湯組表達(dá)較模型對(duì)照組降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 各組TLR4、NF-κB-p65蛋白表達(dá)電泳Fig 5 Electrophoresis of TLR4，NF-κB-p65 protein expression in each group

圖6 當(dāng)歸拈痛湯對(duì) GA 大鼠 TLR4/β-actin、NF-κB-P65/β-actin 的影響Fig 6 Effect of Danggui Tiantong decoction on TLR4/β-actin and NFκB-P65/β-actin in GA rats

4 討論

當(dāng)歸拈痛湯出自《醫(yī)學(xué)啟源》，是清熱利濕、疏風(fēng)止痛之名方，方中君藥羌活透利關(guān)節(jié)、防風(fēng)祛風(fēng)勝濕止痛；臣藥升麻、葛根引陰中之陽(yáng)上行以解表疏風(fēng)，白術(shù)、蒼術(shù)燥濕健脾以化濕；方中所用除濕藥性偏苦燥，易傷氣血津液，故以黨參、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，并取當(dāng)歸活血散瘀止痛之效，苦參、黃芩、知母、茵陳泄?jié)駸?、除煩痛，且知母能防苦燥之藥傷陰，祛邪不傷正；豬苓、澤瀉淡滲利濕，導(dǎo)其留飲，共為佐藥；使藥（炙）甘草調(diào)和諸藥。大量實(shí)驗(yàn)與臨床研究證明了當(dāng)歸拈痛湯治療GA的有效性，其能夠改善骨損傷和滑膜纖維化、抑制滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[8-18]。痛風(fēng)和高尿酸血癥病證結(jié)合診療指南也指出當(dāng)歸拈痛湯治療GA的作用已被認(rèn)可[19]。雙氯芬酸鈉在臨床上使用較為廣泛，是治療GA的首選非甾體類藥物，故本實(shí)驗(yàn)選用雙氯芬酸鈉作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。此次實(shí)驗(yàn)中模型大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛等急性炎癥表現(xiàn)，病理組織切片顯示的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、關(guān)節(jié)腔贅生物和滑膜增生等，宏觀角度證明了當(dāng)歸拈痛湯能減輕大鼠關(guān)節(jié)腫脹與疼痛，減輕炎性浸潤(rùn)與滑膜增生，初步驗(yàn)證了當(dāng)歸拈痛湯的有效性。

既往對(duì)當(dāng)歸拈痛湯治療GA抗炎有效性的研究很多，但對(duì)其機(jī)制方面的研究較少。為深入研究當(dāng)歸拈痛湯治療GA的作用機(jī)制，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出當(dāng)歸拈痛湯治療GA的315個(gè)活性成分、30條通路和110個(gè)靶點(diǎn)?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲取的多種活性成分，甘草異黃酮、漢黃芩素、磷脂查爾酮、鱗葉甘草素A、粗毛甘草素C等對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)較多，可能是治療GA的主要活性成分。甘草異黃酮為甘草黃酮中的其中一類，其中以異甘草素為代表。異甘草素能抑制巨噬細(xì)胞的極化，下調(diào)前列腺素和IL-6的表達(dá)[20-21]。痛風(fēng)患者體內(nèi)高水平的尿酸鈉和炎癥因子能夠刺激巨噬細(xì)胞表面的CD14、TLR4，在細(xì)胞內(nèi)激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶2（IRAK2），進(jìn)而上調(diào)NF-κB信號(hào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化，引起IL-1β、IL-6等促炎因子分泌，且M1型巨噬細(xì)胞的過度積聚會(huì)加劇炎癥反應(yīng)[22-27]。異甘草素還能抑制TLR4的二聚化，阻滯炎性信號(hào)傳導(dǎo)而減少炎性因子和炎癥介質(zhì)的合成釋放[28]。更有研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過阻止NF-κB抑制因子（IκB）的磷酸化和降解，抑制了TNF-α誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞層的黏附和NF-κB的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)。管燕等[29]也從基因與蛋白水平證明了甘草黃酮可降低TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的轉(zhuǎn)錄水平并抑制TNF-α的蛋白表達(dá)，有明顯的抗炎活性；并且驗(yàn)證了甘草查爾酮A對(duì)NF-κB活性的抑制作用。漢黃芩素在獲取的活性成分中位列第二，其不僅能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，發(fā)揮抗炎作用[30-32]，還能抑制炎性因子、黏附分子、趨化因子等聚集于關(guān)節(jié)滑膜處[33]。有學(xué)者認(rèn)為其機(jī)制可能是漢黃芩素在結(jié)晶表面形成保護(hù)膜從而減少結(jié)晶黏附[34]。

基于GO富集與KEGG富集分析篩選出3條重要通路：Toll樣受體、NF-κB及TNF信號(hào)通路。Toll樣受體（TLR）是膜結(jié)合受體，在先天免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）上表達(dá)，TLRs通過誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和共刺激分子的上調(diào)來引起先天免疫的快速激活。TLR最常見的為可溶性的TLR4，大量研究表明TLR4/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路在GA的炎癥反應(yīng)中起著重要作用[35]。MSU結(jié)晶能直接激活TLR4，其通過MyD88依賴途徑可與MyD88相互作用，使活化的MyD88募集下游絲/蘇氨酸蛋白激酶IRAKⅠ和IRAKⅡ，隨后IRAK4將IRAKI磷酸化并使之分離，分離出的IRAKⅠ與TNF受體相關(guān)蛋白6（TRAF6）結(jié)合，激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活性激酶1（TAK1），磷酸化了B細(xì)胞k輕肽基因增強(qiáng)子抑制劑（IKK）復(fù)合體，從而釋放NF-κB，調(diào)控下游炎癥因子IL-1、lL-6、TNF-α等的釋放，介導(dǎo)痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[36]。

TNF也是介導(dǎo)炎癥的重要通路，其能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，分泌促炎因子[37]。活化的TNF與其主要受體結(jié)合，介導(dǎo)下游NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)，以促進(jìn)炎癥反應(yīng)。此次研究結(jié)果顯示，TLR4、NF-κB-p65蛋白在模型對(duì)照組中表達(dá)較空白對(duì)照組升高，當(dāng)歸拈痛湯干預(yù)后兩者表達(dá)較模型對(duì)照組降低，證明當(dāng)歸拈痛湯能夠有效抑制TLR4、NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)，抑制炎癥反應(yīng)。

基于PPI，篩選并分析發(fā)現(xiàn)Rel A（P65）和PTGS2是兩個(gè)較為重要的靶點(diǎn)。Rel A（P65）亞基是NF-κB家族5個(gè)成員之一，NF-κB是其亞基的同源/異源二聚體，NF-κB作為二聚體調(diào)節(jié)與免疫、炎癥相關(guān)的基因。NF-κB可由TNF-α、IL-1誘導(dǎo)激活，其依賴于IKK介導(dǎo)的Ser32和36上的NF-kB抑制劑（IκBα）磷酸化和降解的途徑，使p50/p65 NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核并激活基因轉(zhuǎn)錄，這在炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。PTGS2即前列素內(nèi)環(huán)氧化物合成酶2（COX-2），是炎癥反應(yīng)的另一重要因素。研究顯示，在炎性環(huán)境下，關(guān)節(jié)中的滑膜組織會(huì)產(chǎn)生前列腺素，增加COX-2活性，而引起關(guān)節(jié)疼痛[38]。雙氯芬酸鈉能抑制環(huán)氧化酶活性，從而阻斷前列腺素的生成以治療GA[39]。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)分析，當(dāng)歸拈痛湯可能也存在與雙氯芬酸鈉相似的作用機(jī)制。

研究顯示GA患者會(huì)出現(xiàn)血清IL-1β、TNF-α等炎癥因子含量升高，滑膜組織不連續(xù)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及關(guān)節(jié)腔贅生物等表現(xiàn)[40-42]。關(guān)節(jié)炎發(fā)作期間，大量中性粒細(xì)胞向關(guān)節(jié)浸潤(rùn)聚集并受MSU晶體激活，隨之活化的中性粒細(xì)胞與MSU晶體接觸產(chǎn)生和釋放活化的IL-1β，形成網(wǎng)狀沉淀[43-44]；同時(shí)也會(huì)釋放TNF-α、IL-6等進(jìn)一步激活局部炎癥，加劇疼痛[45-47]。在炎性滑膜組織中，MSU向關(guān)節(jié)軟骨表面遷移，侵蝕關(guān)節(jié)軟骨，破壞關(guān)節(jié)組織。IL-13在GA治療過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性，能有效下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子生成[48-51]。但I(xiàn)L-13與IL-4、IL-10等抗炎因子不同，其在GA急性期表現(xiàn)為低水平，在GA緩解期則處于高水平[52]。本研究采集大鼠樣本時(shí)已過GA急性發(fā)作期，模型對(duì)照組大鼠血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-13顯著升高，與GA炎癥反應(yīng)特點(diǎn)一致。證明通過當(dāng)歸拈痛湯的干預(yù)，明顯減少了GA模型大鼠體內(nèi)及組織中炎性介質(zhì)的釋放。

有學(xué)者對(duì)當(dāng)歸拈痛湯干預(yù)后的GA模型進(jìn)行了體重的組間和組內(nèi)比較，均未發(fā)現(xiàn)顯著差異，提示當(dāng)歸拈痛湯對(duì)體重?zé)o明顯影響，安全、可行[53]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出的重要化學(xué)成分，甘草異黃酮與漢黃芩素均有護(hù)肝的功效[54-56]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了當(dāng)歸拈痛湯對(duì)GA大鼠模型沒有造成肝損傷。

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中通路、靶點(diǎn)以及活性成分的篩選結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為當(dāng)歸拈痛湯通過調(diào)控TLR4、NF-κB、TNF-α等相關(guān)通路，增加抑炎因子IL-13水平，減少TNF-α、IL-1β等炎性因子釋放，從而干預(yù)GA，且甘草異黃酮、漢黃芩素可能為發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵成分。本研究證明了當(dāng)歸拈痛湯能通過多靶點(diǎn)、多途徑實(shí)現(xiàn)抗痛風(fēng)作用，并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了當(dāng)歸拈痛湯干預(yù)GA的效果。然而當(dāng)歸拈痛湯中藥成分較多且有效物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，因此在未來研究中，本課題將繼續(xù)完善當(dāng)歸拈痛湯的有效成分研究，進(jìn)一步明確其治療GA的物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，本實(shí)驗(yàn)僅從蛋白水平闡明了當(dāng)歸拈痛湯的作用效果，其基因水平是否發(fā)生變化還有待驗(yàn)證。