不同方法檢測(cè)牛羊布魯氏菌病抗體的比較分析

許玉靜，李 翀，楊若松，華利忠，郝立斌，張騰帥，魏澤華，何 巖，殷克勇，仇國(guó)明，王宏宇，侯桂芳，康 燕，王 悅

（1.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 050035；2.百沃特生物技術(shù)有限公司 301700；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所210014）；4.石家莊市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 050035）

布魯氏菌病，簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起人與動(dòng)物共患的變態(tài)反應(yīng)性傳染病，嚴(yán)重地威脅著人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)以及動(dòng)物性產(chǎn)品的生物安全。布病作為一種重要的人畜共患病，不僅嚴(yán)重影響畜產(chǎn)品質(zhì)量、畜牧業(yè)發(fā)展，也給公共衛(wèi)生安全造成重大威脅。動(dòng)物疫病凈化工作需要新型疫苗、先進(jìn)檢測(cè)方法等一系列關(guān)鍵技術(shù)作為實(shí)施支撐，尤其是布病的凈化工作刻不容緩，因此科學(xué)篩選、優(yōu)化并集成布病檢測(cè)技術(shù)對(duì)及時(shí)檢測(cè)、淘汰布病感染生畜，凈化布病工作的實(shí)施及推動(dòng)具有十分重要的意義。

河北省2023 年對(duì)無(wú)極縣、贊皇縣、玉田縣等17 個(gè)縣區(qū)牛羊養(yǎng)殖調(diào)出大縣以及省級(jí)種牛羊場(chǎng)和種公牛站開展了畜間布病監(jiān)測(cè)，在布病流行病學(xué)調(diào)查、布病防控及凈化方面做了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)工作，我省布病的監(jiān)測(cè)、凈化工作列入年度重點(diǎn)工作之一。

布魯氏菌病原體經(jīng)過(guò)消化道、呼吸道、生殖器的黏膜、眼結(jié)膜、皮膚等侵入機(jī)體的血清和體液后，不斷刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，引起局部炎癥反應(yīng)。首先出現(xiàn)的抗體為IgM，感染后1 個(gè)月達(dá)高峰，再開始下降，隨后出現(xiàn)的抗體為IgG，在疾病發(fā)展過(guò)程中逐漸由IgG 抗體代替IgM，患病動(dòng)物體內(nèi)IgG 抗體不僅占主導(dǎo)地位而且在體內(nèi)維持時(shí)間最長(zhǎng)，該特異性抗體檢測(cè)成為十分重要的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)室常用的血清學(xué)診斷方法有3 種，即虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（i-ELISA）、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（c-ELISA），通過(guò)比對(duì)其敏感度和特異性。為找出更適合牛羊布病臨床檢測(cè)及布病凈化的優(yōu)化方法，我們選用這3 種方法對(duì)2021 年～2022年采集的589 份牛、羊血清樣本進(jìn)行布魯氏菌病抗體檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明：RBT 與i-ELISA 組合初篩組合檢測(cè)，陽(yáng)性樣品確診采用c-ELISA 方法，既能降低陽(yáng)性漏檢率，又能降低陽(yáng)性誤判率，為布病凈化工作提供可信賴的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 血清來(lái)源及要求

奶牛、羊來(lái)自石家莊市、邯鄲市、承德市、張家口市、秦皇島市、唐山市、定州市的奶牛場(chǎng)、羊場(chǎng)，總共采集589 頭份血清。被檢血清新鮮，無(wú)明顯的蛋白凝固物形成，無(wú)溶血現(xiàn)象、無(wú)腐敗氣味。血清分離完成后，多數(shù)在15 d 之內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)。

采血要求：牛、羊采血前可先剪毛、酒精消毒后從頸靜脈采血。為避免所采血清出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，采血時(shí)間最好在早晨飼喂前或飲食后6 h 進(jìn)行；為了獲得比較清亮的血清，采集完成后，將試管傾斜放置，或放置于室溫自然析出血清，冬季可放置于37℃溫箱中使血清快速析出，并做好編號(hào)標(biāo)記。為保證試驗(yàn)用血清新鮮、無(wú)溶血、無(wú)腐敗氣味，應(yīng)盡早分離出血清，并送至實(shí)驗(yàn)室開展試驗(yàn)。

1.2 主要儀器及試劑

Thermo Fisher 通用離心機(jī)，Thermo FisherA2 生物安全柜，安圖酶標(biāo)工作站，TECAN 96 孔全自動(dòng)洗板機(jī)，eppendorf 微量移液器，布病檢測(cè)專用反應(yīng)板。

1.3 主要試劑

RBT 抗原及陰陽(yáng)對(duì)照血清購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司（批號(hào)：202102）；布魯氏菌i-ELISA、c-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號(hào)：20210608）、廣州悅洋生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：EB0221002）。

1.4 方法及檢測(cè)要點(diǎn)

1.4.1 RBT 方法

虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT）也稱緩沖抗原凝集試驗(yàn)，其抗原是一種經(jīng)過(guò)四氯四碘熒光素處理染色的布魯氏菌體，是一種酸性成分，該抗原與被檢血清作用時(shí)能抑制血清中的IgM 類抗體的凝集活性，比較容易檢測(cè)出血清中IgG 類抗體，同時(shí)因?yàn)槠鋚H 值偏低，提高了活化布病抗體的作用，有較好的特異性，目前已普遍應(yīng)用于畜間布病的抗體檢測(cè)。

本研究對(duì)589 份樣品進(jìn)行布病虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測(cè)，操作步驟與結(jié)果判定嚴(yán)格按照《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T18646-2018）進(jìn)行。

技術(shù)要點(diǎn)：開展試驗(yàn)前，應(yīng)將抗原和血清樣品提前拿出放置在室溫30 min，使其回溫；每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照；不能使用血漿樣品，避免假陽(yáng)性出現(xiàn)；首先在玻璃板或一次性檢測(cè)紙上先滴加血清，然后在被檢血清旁滴加抗原，混勻后4 min 觀察并判讀結(jié)果；反應(yīng)條件要控制室溫，虎紅抗原使用前充分搖勻，出現(xiàn)污染或有凝結(jié)塊時(shí)不得使用，嚴(yán)禁冷凍保存，宜4℃保存。

1.4.2 i-ELISA 方法

間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）：該檢測(cè)方法的核心是包被蛋白，包被蛋白的選擇決定該方法的準(zhǔn)確性，目前包被抗原的選擇上大都集中在外膜蛋白和周質(zhì)蛋白，i-ELISA 是將待檢血清樣本中的布魯氏菌抗體與ELISA 板上固定的布魯氏菌抗原物質(zhì)結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合，當(dāng)加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，與一抗結(jié)合形成復(fù)合物，之后加入底物，利用酶標(biāo)抗體檢測(cè)，之后通過(guò)底物顯色，再利用酶標(biāo)儀來(lái)讀值。該方法因其靈敏度較高，標(biāo)記的抗體較少，成本相對(duì)較低，通常作為布病的初篩試驗(yàn)。

本研究對(duì)589 份樣品進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，具體的試驗(yàn)過(guò)程按說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行操作。

1.4.3 c-ELISA 方法

2018 年國(guó)家對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)(GB/T 18646) 進(jìn)行修訂，增加競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(c-ELISA)作為血清學(xué)確診試驗(yàn)方法之一。因試管凝集試驗(yàn)(SAT) 操作繁瑣、耗時(shí)且受人為判定因素影響，c-ELISA 操作相對(duì)簡(jiǎn)便、結(jié)果判定比較客觀，較SAT 具有更高的特異性。

本研究對(duì)589 份樣品進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，具體步驟按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.4 RBT 方法與i-ELISA 方法從檢測(cè)結(jié)果的符合率、敏感性和特異性去分析

計(jì)算方法如下：敏感性=真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))，特異性=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽(yáng)性數(shù))，符合率=(真陽(yáng)性數(shù)+真陰性數(shù))/被檢總數(shù)。

布病假陽(yáng)性監(jiān)測(cè)率：即確診陰性中檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的占比。布病假陰性監(jiān)測(cè)率：即確診陽(yáng)性中檢測(cè)結(jié)果為陰性的占比。

2 結(jié)果

2.1 c-ELISA 檢測(cè)結(jié)果

589 份血清樣本中有16 份為陽(yáng)性樣本，其余573份樣本均為陰性，陽(yáng)性率為2.72%，并以此檢測(cè)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)RBT 方法與i-ELISA 方法進(jìn)行比較。

2.2 RBT 方法與i-ELISA 方法符合率、敏感性和特異性比較

分別用RBT 方法與i-ELISA 方法同時(shí)檢測(cè)589 份牛、羊血清樣本，RBT 方法檢出的11 份陽(yáng)性血清，578陰性血清；i-ELISA 方法檢出的13 份陽(yáng)性血清，576 陰性血清。結(jié)果見下表1。

表1 RBT 試驗(yàn)和i-ELISA 試驗(yàn)檢測(cè)符合率情況比較

本研究中對(duì)RBT 檢出的11 份陽(yáng)性血清進(jìn)行i-ELISA 檢測(cè)，檢出布病陽(yáng)性9 份，陰性2 份；對(duì)RBT檢出的578 份陰性血清進(jìn)行i-ELISA 檢測(cè)，檢出布病陽(yáng)性4 份，陰性574 份。從檢測(cè)數(shù)據(jù)可以看出部分RBT檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品呈現(xiàn)出假陽(yáng)性結(jié)果，若單獨(dú)用該方法檢出的陽(yáng)性動(dòng)物實(shí)行“檢疫-撲殺”策略，勢(shì)必誤殺部分假陽(yáng)性牛、羊。我們對(duì)RBT 檢出的578 頭陰性牛、羊進(jìn)行i-ELISA 檢測(cè)，結(jié)果檢出假陰性4 份。

通過(guò)試驗(yàn)比較表明其敏感性、特異性和符合率分別為69.23%、99.65%、98.98%。

將RBT、i-ELISA 檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果數(shù)與c-ELISA 陽(yáng)性結(jié)果數(shù)進(jìn)行對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)結(jié)果有不一致的情況，RBT與i-ELISA 陽(yáng)性結(jié)果相比有假陽(yáng)性或假陰性情況存在。

3 分析與討論

RBT 檢測(cè)方法是布魯氏菌病早期開發(fā)的用于檢測(cè)的方法[1、2]，RBT 方法簡(jiǎn)單快速易操作，是豬、牛、羊布魯氏菌病檢疫的國(guó)標(biāo)方法，但是由于存在溶血現(xiàn)象、交叉反應(yīng)和超過(guò)4 min 容易出現(xiàn)纖維素的凝集塊等原因會(huì)造成假陽(yáng)性的凝集，導(dǎo)致假陽(yáng)性較高，特異性不強(qiáng)，容易誤判假陽(yáng)性畜，也無(wú)法區(qū)分野毒感染抗體和免疫抗體，致使RBT 不能作為確診判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，RBT 方法在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室及有實(shí)驗(yàn)條件的養(yǎng)殖場(chǎng)中已得到比較廣泛的應(yīng)用，是常見的布魯氏菌病篩查方式。它是根據(jù)抗原抗體結(jié)合時(shí)布魯氏菌抗體與血清發(fā)生凝集的原理，從而簡(jiǎn)便、快捷做出判斷的方法，但RBT 所用試劑成本低廉，不需要特殊的儀器設(shè)備，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求不高，尤其適合基層布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查及檢測(cè)時(shí)用的快速初篩方法。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）此法原理也是基于抗原抗體的特異性結(jié)合，常見的布魯氏菌檢測(cè)方法包括i-ELISA、c-ELISA 兩種。其中i-ELISA 是用聚苯乙烯包被布魯氏菌脂多糖（LPS）抗原檢測(cè)布魯氏菌病，其敏感性和特異性都較高；c-ELISA 采用的是針對(duì)布魯氏菌脂多糖（LPS）的O 型多糖（OPS）表位之一的特異單克隆抗體，其親和力更強(qiáng)，因而特異性較i-ELISA 更高，該實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定的抗體比較全面，主要檢測(cè)I 類抗體和IgG 類抗體。IgM 類抗體為感染后最先產(chǎn)生的抗體類型，產(chǎn)生早、持續(xù)時(shí)間短；IgG 類抗體的產(chǎn)生時(shí)間晚于IgM 類抗體，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，故其敏感性和特異性都比較強(qiáng)，本文以c-ELISA 作為參考標(biāo)準(zhǔn)方法。ELISA 方法操作較簡(jiǎn)便，檢測(cè)通量較大，由于是機(jī)器判定，排除了人為判定存在的誤差，檢測(cè)結(jié)果比較客觀，但同時(shí)也存在步驟相對(duì)繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)操作人員技術(shù)水平有較高要求，同時(shí)其檢測(cè)試劑價(jià)格較高，應(yīng)用成本高，不適合基層進(jìn)行大面積應(yīng)用。

檢測(cè)方法的敏感性越高，對(duì)識(shí)別陽(yáng)性動(dòng)物越有利，特異性越高，可有效減少對(duì)疫病的誤診，進(jìn)一步降低凈化與撲殺的成本。因此，在布病防控與凈化工作中，既要合理地選擇血清學(xué)檢測(cè)方法，同時(shí)應(yīng)結(jié)合動(dòng)物臨床癥狀及免疫情況，進(jìn)行綜合判定。實(shí)施布病防控凈化的牛羊養(yǎng)殖場(chǎng)，應(yīng)盡早檢出陽(yáng)性牛羊，為避免出現(xiàn)假陰性，選擇使用敏感性較高的i-ELISA 方法，同時(shí)避免檢出假陽(yáng)性結(jié)果，推薦使用特異性較高的c-ELISA 方法。通過(guò)比較不同檢測(cè)方法，大規(guī)模初篩建議采用敏感性高的i-ELISA 方法，確診試驗(yàn)采用c-ELISA 方法，其組合應(yīng)用既能降低陽(yáng)性漏檢率，又能降低陽(yáng)性誤判率，是適用基層奶牛布病檢測(cè)的最佳組合[4]；或者為降低檢測(cè)或凈化成本，選擇使用虎紅平板凝集試驗(yàn)篩選陽(yáng)性畜，之后再配合開展敏感性及特異性強(qiáng)的ELISA 試驗(yàn)，對(duì)陽(yáng)性畜進(jìn)行再次檢測(cè)、定性。該措施尤其在布病凈化工作中值得應(yīng)用推廣，不僅能夠減少養(yǎng)殖場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還會(huì)降低不必要撲殺造成的經(jīng)費(fèi)支出，一定程度上促進(jìn)產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果的精準(zhǔn)性判定，直接影響著布病防控策略、措施的制定，同時(shí)也影響著布病凈化效果及進(jìn)程。

4 畜間布病防控措施

推薦采用檢疫、監(jiān)測(cè)、流調(diào)、撲殺和無(wú)害化處理集成化關(guān)鍵技術(shù)。在實(shí)際工作中要將檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果與撲殺分開，撲殺與凈化結(jié)合的理念，真正使廣大養(yǎng)殖場(chǎng)明白凈化的意義、防控的措施。讓廣大養(yǎng)殖場(chǎng)了解免疫本身具有遏制病原繁殖擴(kuò)散的作用，檢測(cè)出的陽(yáng)性畜如果沒有臨床癥狀及流行病學(xué)關(guān)聯(lián)情況，一般不會(huì)造成疫情發(fā)生，但不反對(duì)有條件的養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)施撲殺，剔除陽(yáng)性畜；但對(duì)于實(shí)施凈化的養(yǎng)殖場(chǎng)，如若發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性畜，要進(jìn)行全檢并及時(shí)合理處理陽(yáng)性畜。

5 職業(yè)人員的自我防護(hù)

要定期做布魯氏菌病血清學(xué)檢測(cè)；我國(guó)采用104M苗經(jīng)皮膚劃痕免疫，免疫期約9～12 個(gè)月，保護(hù)力約為80%，僅在高危人群中有限應(yīng)用；可以服用四環(huán)素類藥物預(yù)防，如已發(fā)現(xiàn)典型的臨床癥狀，應(yīng)立即去醫(yī)院治療；基于注射免疫及實(shí)驗(yàn)操作時(shí)存在氣溶膠感染的風(fēng)險(xiǎn)，須佩戴手套、口罩等，要勤洗手、勤消毒，做好防護(hù)；對(duì)感染病料、廢棄物、周圍環(huán)境等進(jìn)行消毒；在實(shí)驗(yàn)室離心血清操作中，為避免微生物氣溶膠的產(chǎn)生，不應(yīng)馬上打開離心機(jī)的頂蓋，最好放置10 min 后再取出離心管；在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中如有血清或抗原濺出，應(yīng)立即進(jìn)行消毒處理；實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)血清樣品進(jìn)行包裝后放入高壓滅菌器中121℃30 min 滅菌后再行處置。