基于AFM 探測分析不同白血病分型患者外周血紅細胞形貌和超微結構的差異

陳廷婷，馬永琪，王 琦，李潤林，姜良軍

1.臨沂大學化學化工學院，山東 臨沂 276000；2.臨沂大學醫(yī)學院，山東 臨沂 276000；3.臨沂市蘭山區(qū)棗園中心衛(wèi)生院，山東 臨沂 276038

白血病是一類起源于造血干細胞的惡性疾病[1]，根據病變白細胞類型和成熟程度等的不同可將其分為L1-3 型和M0-7 型[2]。目前對白血病細胞的研究主要集中在病變白細胞上，而對紅細胞的研究較少且不夠深入[3-4]。絕大部分白血病患者都伴隨著貧血，貧血與紅細胞和血紅蛋白數(shù)目的減少有關，目前臨床關于其的研究較少，未對不同分型白血病患者的紅細胞微納結構進行研究。AFM 具有納米水平的分辨率，對于紅細胞方面的研究和應用已經較為成熟。本文利用AFM 探測分析不同分型白血病外周血紅細胞的形貌、超微結構及細胞參數(shù)，以期為白血病的發(fā)病研究和治療提供實驗數(shù)據。

1 材料和方法

1.1 樣品制備方法

實驗分析所用到的紅細胞分別來自正常人體血液、急性髓系白血病M2a 型患者和急性淋巴細胞白血病L2 型患者血液，均為1.0 mL，并與固定液按照1∶1 的比例混合均勻，放置在4 ℃環(huán)境下固定1 h，低速離心5 min，除去上清液，并用0.1 mol/L 的PBS漂洗沉淀物，重復上述離心操作3 次。最后使用梯度無水乙醇進行脫水處理，用移液槍吸取含紅細胞的乙醇溶液滴在干凈的云母片上，待液體干后進行檢測。

1.2 儀器與測試條件

AFM 產自德國布魯克公司，型號為BioScope Re；實驗測樣在PBS 環(huán)境下采用輕敲模式，使用力常數(shù)為30 N/m、共振頻率為332.132 kHz 的硅探針，掃描范圍從大到小依次進行，掃描頻率為0.5 Hz。

2 實驗結果

2.1 正常紅細胞的AFM 分析

正常紅細胞的AFM 圖像如圖1A 所示，可以發(fā)現(xiàn)正常的紅細胞形態(tài)均勻，呈雙凹盤形，中心偏薄，四周較厚，膜表面光滑。然后縮小掃描范圍，進一步觀察單個紅細胞膜表面的超微結構，發(fā)現(xiàn)其直徑約為7.8 μm，凹陷部分厚度為1.3 μm。通過Nano Scope 統(tǒng)計多個紅細胞參數(shù)（圖2），計算后發(fā)現(xiàn)紅細胞的平均直徑為7.6 μm，凹處厚度為285 nm，邊緣寬度為1.9 μm，細胞膜表面的平均粗糙度（Ra）為3.05 nm，均方根粗糙度（Rq）為3.65 nm。從以上分析可以發(fā)現(xiàn)正常紅細胞表面分布著很多形態(tài)均勻的納米小顆粒，且表面光滑。異常細胞占有核細胞的比例可以用于衡量細胞疾病的嚴重程度，正常紅細胞異常比例一般低于2%。

圖1 AFM 形貌（上）和超微結構圖像（下）：A）正常，B）M2a 組，C）L2 組

圖2 統(tǒng)計數(shù)據圖：A）異常細胞比，B）凹處直徑，C）細胞直徑，D）細胞高度，E）凹處厚度，F(xiàn)）邊緣厚度

2.2 急性髓系白血病M2a 型紅細胞的AFM 分析

圖1B 為M2a 型紅細胞的AFM 掃描分析圖像，能明顯觀察到紅細胞變形嚴重，且其細胞直徑在9.0 μm 左右，凹處厚度約為100 nm，與正常紅細胞存在一定區(qū)別。然后縮小掃描范圍，統(tǒng)計多個紅細胞的參數(shù)（圖2），計算后發(fā)現(xiàn)M2a 型紅細胞的平均直徑為8.9 μm，細胞高度為0.8 μm，凹處直徑與厚度分別為2.2 μm、3.2 μm，邊緣寬度為1.9 μm，Ra 為9.6 nm，Rq 為8.8 nm，異常細胞比例高達60%。從以上數(shù)據可以發(fā)現(xiàn)癌變后的紅細胞直徑明顯大于正常紅細胞，細胞范圍擴大且惡化程度相當高。

2.3 急性淋巴細胞白血病L2 型紅細胞的AFM 分析

圖1C 為L2 型紅細胞的AFM 形貌與超微結構圖像，從圖中可以看到該紅細胞呈球形。通過分析發(fā)現(xiàn)該紅細胞的直徑在7.9 μm 左右，凹陷部分厚度在320 nm 左右。然后縮小掃描范圍，進一步觀察單個紅細胞膜表面的超微結構，統(tǒng)計數(shù)據如圖2 所示。發(fā)現(xiàn)L2 型紅細胞的平均直徑約為7.7 μm，細胞高度約為1.7 μm，中央凹處的平均直徑和邊緣寬度分別為1.9 μm、3.3 μm；異常細胞比例約為25%。再統(tǒng)計該病變紅細胞的表面粗糙度，發(fā)現(xiàn)其Ra 值為11.2 nm，Rq 值為9.2 nm，表面差異性<0.05?；谝陨蠑?shù)據可以看出L2 型紅細胞高度明顯高于正常紅細胞。

3 結語

本文借助原子力顯微鏡極高的分辨率，對人體血液中的正常紅細胞、L 型白血病及M 型白血病患者紅細胞的探測分析結果進行了比較，發(fā)現(xiàn)與健康人群體內的紅細胞相比，病變紅細胞的大小變化不大，但細胞的厚度、凹陷直徑等參數(shù)均出現(xiàn)了不同程度的改變，細胞表面粗糙度增大，同時細胞變得肥厚，這些改變可能與白血病患者易發(fā)生血栓有關。其中最顯著的改變就是病變紅細胞凹陷部分面積明顯減少，這一改變會嚴重影響紅細胞的生理功能，導致紅細胞的變形能力減弱，不利于血液輸送，從而引起局部供血不足，降低其在血漿中的懸浮穩(wěn)定性，使紅細胞下沉，引發(fā)并發(fā)癥；另外細胞的比表面積減少，氣體交換能力減弱，導致血氧指標下降。以上研究也為紅細胞相關疾病的診斷和治療奠定了基礎。