基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

陳文杰 梁江 韋清源 湯復(fù)躍 郭小紅 陳淵

摘要：【目的】基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）開(kāi)發(fā)輔助鑒定南方大豆皺葉癥（SSCLD）的分子標(biāo)記，為快速鑒定生產(chǎn)上遇到的大豆皺葉是否為SSCLD提供技術(shù)支撐?！痉椒ā坷棉D(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的差異表達(dá)基因（DEGs），從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，篩選出表達(dá)差異較大的DEGs進(jìn)行分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗(yàn)評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的表達(dá)專(zhuān)一性，并利用不同類(lèi)型的皺葉表型樣本對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)專(zhuān)一性及可靠性驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】7株皺葉植株樣本和5株正常葉植株樣本的測(cè)序堿基錯(cuò)誤率為0.0226～0.0238，Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量均大于95.00%，GC含量為45.60%～46.24%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。皺葉大豆材料較正常葉大豆材料有1063個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，85個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。根據(jù)基因的表達(dá)量和同源性，共篩選8個(gè)DEGs用作開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的候選基因，均表現(xiàn)為明顯上調(diào)表達(dá)。8個(gè)候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本相符。此外，所篩選基因中有6個(gè)基因表達(dá)在不同程度上受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境脅迫誘導(dǎo)，其中，種植于皺葉癥土壤中的皺葉型株系葉片GLYMA_18G033400基因的相對(duì)表達(dá)量均高于其在正常土壤中受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽等逆境脅迫后的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)GLYMA_18G033400基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記qCL-18G033400，并用該分子標(biāo)記對(duì)19份不同皺葉類(lèi)型的葉片樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以ΔCt值小于10.00作為SSCLD的判定標(biāo)準(zhǔn)，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果同田間鑒定結(jié)果一致。【結(jié)論】利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

關(guān)鍵詞：大豆；皺葉癥；分子標(biāo)記；開(kāi)發(fā)；轉(zhuǎn)錄組；輔助鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1587-11

Development of molecular markers based on transcriptome

sequencing for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease

CHEN Wen-jie1， LIANG Jiang1， WEI Qing-yuan1， TANG Fu-yue1，

GUO Xiao-hong1， CHEN Yuan2*

（1Cash Crops Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning， Guangxi? 530007，China；

2Key Laboratory of Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi? 530007，China）

Abstract：【Objective】Molecular markers based on transcriptome sequencing（RNA-Seq） for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease（SSCLD） was developed to provide technical support for quickly identifying whether the soybean leaves encountered in production were SSCLD. 【Method】Transcriptome sequencing technology was used to analyze differentially expressed genes between crinkle leaf and normal leaf soybean materials with similar genetic background in the crinkle leaf-induced soil environment. Homologous sequences with highly similar nucleotide sequences were removed， DEGs with large expression differences were selected for molecular marker development， the expression specificity of molecular markers was evaluated by using crinkle leaf soybean material and stress treatment test， and the expression specificity and reliability of molecular markers were verified by different types of crinkle leaf phenotype samples. 【Result】The sequencing base error rate of seven crinkle leaf plants and five normal leaf plants were 0.0226-0.0238， the numbers of bases in Q20 and Q30 were 99.00% and 99.90%， and the GC contents were 45.60% to 46.24%， indicating good quality of transcriptome sequencing data. Transcriptome data showed that 1063 genes were up-regulated and 85 genes were down-regulated in leaves from the crinkle leaf type material，compared to that from normal leaf type material. Based on the expression level and homology of the genes， eight genes were screened according to the expression level and the identification of the homology in soybean genome，and both of them were up-regulated genes. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis of the eight candidate genes generally agreed with the transcriptome data.The expression levels of six of these genes showed varying degrees of interference by diverse abiotic stress，including dry stress，water logging stress，cold stress，shade and salt stress，and the expression level of GLYMA_18G033400 in crinkle leaves from the crinkle leaf-induced environment was higher than that from normal soil under dry stress，waterlogging stress，cold stress，shade and salt stress. Molecular marker qCL-18G033400 was designed according to the GLYMA _ 18 G033400 gene sequence， and used to perform real-time fluorescence quantitative PCR on 19 leaf samples of different crinkle leaf types. The results showed that ΔCt value less than 10.00 was used as the determination criterion of SSCLD， and the identification results were consistent with the field identification results. 【Conclusion】Molecular marker qCL-18G033400 deve-loped using transcriptome sequencing can assist in the identification of SSCLD.

Key words： soybean； crinkle leaf disease； molecular marker； development； transcriptome； auxiliary identification

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32060490， 32260451）； Special Construction Project of China Agriculture Research System （CARS-04-CES30）； Guangxi National Science Foundation（2019GXNSFAA185009）

0 引言

【研究意義】大豆［Glycine max （L.） Merr.］是豆科大豆屬的一年生草本植物，是我國(guó)重要的糧、油、飼兼用作物，在我國(guó)國(guó)民生產(chǎn)中具有重要的作用。南方大豆產(chǎn)區(qū)是我國(guó)重要的高蛋白大豆產(chǎn)區(qū)之一，為大豆蛋白加工提供優(yōu)質(zhì)的原料。近年來(lái)廣西、廣東、福建和貴州等地大豆生產(chǎn)中出現(xiàn)類(lèi)似但非大豆病毒病引起的葉片皺縮病癥，稱(chēng)為南方大豆皺葉癥（Southern soybean crinkle leaf disease，SSCLD），發(fā)生嚴(yán)重時(shí)大豆可減產(chǎn)40%左右（陳文杰等，2022a），嚴(yán)重影響該產(chǎn)區(qū)大豆的生產(chǎn)。引發(fā)大豆皺葉的因素有病毒、除草劑、金屬離子、基因突變等，其中病毒、除草劑等引起的大豆皺葉與 SSCLD的葉片形態(tài)上存在相似性，受大豆品種等差異因素的影響，很難準(zhǔn)確辨別生產(chǎn)上遇到的皺葉類(lèi)型是否為SSCLD（陳文杰等，2022b）。然而，SSCLD葉片表型具有表達(dá)專(zhuān)一性，推測(cè)SSCLD葉片中存在特異表達(dá)基因，該基因可用于開(kāi)發(fā)輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記。因此，開(kāi)發(fā)輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標(biāo)記，以期快速判定皺葉類(lèi)型是否為SSCLD，對(duì)大豆皺葉癥檢測(cè)和防治及安全生產(chǎn)具有重要的研究意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鑒定由病毒引起的皺葉癥狀時(shí)，可根據(jù)病毒保守序列設(shè)計(jì)特異分子標(biāo)記，再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行判斷。目前此類(lèi)鑒定方法已很成熟，廣泛用于豆類(lèi)（涂麗琴等，2019；吉穎等，2022）、馬鈴薯（魏瑤等，2020）、辣椒（龔明霞等，2022）和黃瓜（車(chē)海彥等，2020）等作物上。隨著酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和膠體金免疫層析法（Gold immunochromatography assy，GICA）等免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，使得病毒病的檢測(cè)快速便捷（王佳等，2021；董旭旭等，2022）。因此，病毒感染所導(dǎo)致的皺葉癥（Samertwanich et al.，2001；Ramon et al.，2014；王大剛等，2018；Yang et al.，2019）可通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)法和分子標(biāo)記法（趙小慧等，2021）檢測(cè)，但SSCLD并非由病毒感染所致，無(wú)法利用這2種方法檢測(cè)。本研究團(tuán)隊(duì)前期根據(jù)田間皺葉形態(tài)建立SSCLD鑒定方法（陳文杰等，2020）。該方法需將被鑒定大豆種質(zhì)的種子種植于穩(wěn)定誘發(fā)SSCLD的土壤中，根據(jù)大豆不同時(shí)期葉片形態(tài)表現(xiàn)進(jìn)行鑒定。對(duì)于其他地區(qū)生產(chǎn)上出現(xiàn)的皺葉癥狀，單從形態(tài)上有時(shí)較難判定是否為SSCLD類(lèi)型?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)大豆皺葉的研究還比較少，具體何種因素導(dǎo)致SSCLD尚不清楚。SSCLD表型上具有表達(dá)專(zhuān)一性，推測(cè)SSCLD發(fā)生時(shí)會(huì)有特異表達(dá)基因，這些基因可用于開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助鑒定SSCLD，但目前鮮見(jiàn)開(kāi)發(fā)輔助鑒定SSCLD分子標(biāo)記的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列，篩選出表達(dá)差異較大的DEGs進(jìn)行分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)，利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗(yàn)評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的表達(dá)專(zhuān)一性，并利用不同類(lèi)型的皺葉表型樣本對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)專(zhuān)一性及可靠性驗(yàn)證，以期開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記用于輔助鑒定SSCLD。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的大豆品種為桂春8號(hào)（正常葉，皺葉癥級(jí)為0）和粵春2017-1（皺葉，皺葉癥級(jí)為7）有性雜交衍生的雜合異質(zhì)系材料GY_C（皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下表現(xiàn)皺葉）和GY_N（皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境表現(xiàn)正常葉）（陳文杰等，2022a）以及近雜合異質(zhì)系材料F2：7，即從F2代取雜合單株進(jìn)行株行種植，收獲皺葉單株，再進(jìn)行株行種植，然后選擇分離的株行收獲皺葉單株繼續(xù)進(jìn)行株行種植，按照此方法一直種至F2：6代的植株，單株收獲F2：6代中皺葉植株，得到F2：6代皺葉單株的種子F2：7，以上材料均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。主要試劑：總RNA提取試劑盒（RNAsimple Total RNA Kit）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒［FastKing RT Kit （With gDNase）］均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；2×Es Taq MasterMix購(gòu)自于康為世紀(jì)生物科技有限公司；2×ChamQTM Univarsal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。主要設(shè)備儀器：LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche，美國(guó)）

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 F2：7代皺葉癥田間鑒定試驗(yàn) F2：6代皺葉單株的種子F2：7于2020年3月8日播種于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽(yáng)基地（東經(jīng)108°14′11″，北緯22°36′30″，海拔105.64 m，紅壤土），多年試驗(yàn)證明該地塊為大豆皺葉癥表現(xiàn)穩(wěn)定的地塊。選擇皺葉和正常葉分離的株行（圖1），于始花期分別取7株皺葉植株（C_3、C_6、C_10、C_11、C_18、C_23和C_24）和5株正常葉植株（N1_1、N1_3、N1_5、N1_6和N1_7）的頂部嫩葉2 g左右，分別用錫箔紙包好后置于液氮保存，隨后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，即提取總RNA后Oligo dT富集mRNA，然后對(duì)富集后的mRNA進(jìn)行片段化處理，隨后利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，片段兩端連接adaptor后利用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后，圖像信號(hào)經(jīng)Base Calling得到Raw bases，數(shù)據(jù)質(zhì)控得到Clean data，使用TopHat2 （http：//tophat.cbcb.umd.edu/）與大豆參考基因組Wlliams82.a4.v1（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82a4_v1）進(jìn)行對(duì)比得到mapped data（Kim et al.，2013），使用Cufflinks（http：//cole-trapnelllab.github.io/cufflinks/）將mapped reads進(jìn)行組裝拼接（Trapnell et al.，2010），使用RSEM獲得每個(gè)樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts（Li and Deweg，2011），然后對(duì)其進(jìn)行TPM（Transcripts per million reads）轉(zhuǎn)換，進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因/轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。TPM轉(zhuǎn)換方式：先將讀數(shù)計(jì)數(shù)除以每個(gè)基因的長(zhǎng)度（以千堿基為單位），得到每千堿基Reads（Reads per kilobase，RPK）。計(jì)算各樣本中所有的RPK值，然后將其除以1000000，得到每百萬(wàn)縮放因子（Per million scaling factor），最后將RPK值除以每百萬(wàn)縮放因子即可得到TPM。

1. 2. 2 逆境處理試驗(yàn) 為驗(yàn)證在皺葉和正常葉中表達(dá)差異的基因是否具專(zhuān)一性，2021年7—12月利用皺葉材料GY_C進(jìn)行干旱（Drought stress treatment，DST）、水漬（Water logging treatment，WLT）、冷害（Cold stress treatment，CST）、蔭蔽（Shading treatment，ST）和鹽脅迫（Salt stress treatment，SST）等逆境處理試驗(yàn)。試驗(yàn)采用盆栽方法，逆境處理使用土為營(yíng)養(yǎng)土（皺葉材料表現(xiàn)正常），設(shè)置1個(gè)營(yíng)養(yǎng)土對(duì)照（CKN）和1個(gè)皺葉土壤對(duì)照（CKC），重復(fù)3次。皺葉種子播種于花盆（口徑×底徑×高為21.5 cm×17.3 cm×14.8 cm），每盆播種4～5粒，待真葉期每盆留2株，隨后分別進(jìn)行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理。干旱脅迫處理參考王興榮等（2021）的方法，即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理，停止正常供水3 d后取頂部嫩葉。水漬處理參考孫慧敏等（2010）的方法，即第3片復(fù)葉期開(kāi)始水漬處理15 d后取頂部嫩葉。冷害處理參考蓋志佳等（2019）的方法，即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理，3 ℃培養(yǎng)箱中處理12 h后取頂部嫩葉。蔭蔽處理參考劉婷等（2016）的方法，即第6片復(fù)葉期在透光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)下處理5 d后取頂部嫩葉。鹽脅迫參考嚴(yán)勇亮等（2021）的方法，即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理，置于1.5%的NaCl溶液中處理3 d后取頂部嫩葉。CKN和CKC均于第6片復(fù)葉期取頂部嫩葉。嫩葉用錫箔紙包好置于液氮中保存?zhèn)溆?。用RNAsimple Total RNA Kit提取嫩葉樣品總RNA，然后用FastKing RT Kit （With gDNase）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 3 皺葉樣品采集及田間鑒定試驗(yàn) 2021年7—9月分別在南寧、貴港和賀州等地取不同大豆皺葉類(lèi)型的大豆植株，取嫩葉后提取其總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。同時(shí)用標(biāo)牌標(biāo)記好植株成熟后收獲該單株，2022年春季在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽(yáng)基地田間鑒定各材料的皺葉癥級(jí)，鑒定方法參考陳文杰等（2020），即始花期連續(xù)調(diào)查10株的皺葉癥級(jí)，根據(jù)以下公式計(jì)算皺葉病癥指數(shù)（DI）：

DI（%）=［∑（N×R）/（M×T）］×100

式中，N表示病害某一級(jí)別的植株數(shù)；R表示病害的相對(duì)病級(jí)數(shù)值；M表示病害的最高病級(jí)數(shù)值；T表示調(diào)查的總株數(shù)。然后根據(jù)皺葉癥指數(shù)劃定皺葉癥分級(jí)：0級(jí)為高抗（HR），DI=0；3級(jí)為抗（R），0<DI≤30%；5級(jí)為中抗（MR），30%<DI≤60%；7級(jí)為感（S），60%<DI≤90%；9級(jí)為高感（HS），DI>90%。

1. 3 DEGs篩選

為了篩選DEGs，對(duì)各基因的TPM值進(jìn)行t檢驗(yàn)，篩選皺葉和正常葉的DEGs。篩選條件：TPM-Cmin>TPM-Nmax或TPM-Cmax<TPM-Nmin、TPM-Cmin/TPM-Nmax≥5或TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5。其中，TPM-Cmin表示某基因中皺葉個(gè)體TPM最小值；TPM-Nmax表示某基因中正常葉個(gè)體TPM最大值；TPM-Cmax表示某基因中皺葉個(gè)體TPM最大值；TPM-Nmin表示某基因中正常葉個(gè)體TPM最小值。

1. 4 DEGs同源性比對(duì)分析

因大豆屬于古四倍體，大多數(shù)基因?qū)儆谕葱蛄?，?dǎo)致擴(kuò)增該基因難以保證其表達(dá)專(zhuān)一性。因此，設(shè)計(jì)分子標(biāo)記時(shí)需刪掉候選基因中核苷酸序列高度相似的基因。將篩選得到的基因cDNA預(yù)測(cè)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，以獲得大豆基因組內(nèi)的核苷酸序列高度相似的序列，從候選基因中刪除這些序列。核苷酸序列高度相似的基因判定規(guī)則：Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%；不存在高度相似基因滿(mǎn)足條件：NQP<1。NQP代表Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%基因的個(gè)數(shù)。

1. 5 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及表達(dá)驗(yàn)證

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)篩選得到候選基因的定量引物，引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在100～250 bp。通過(guò)溫度梯度PCR檢測(cè)擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率和最適退火溫度（表1）。挑選擴(kuò)增條帶清晰且不存在非表達(dá)專(zhuān)一性擴(kuò)增的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。以皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境中的GY_C和GY_N株系葉片cDNA為模板，以GmActin為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表1，用上述篩選出的引物驗(yàn)證分子標(biāo)記表達(dá)的差異性。利用2×Es Taq MasterMix試劑盒進(jìn)行引物篩選。溫度梯度PCR反應(yīng)體系25.0 μL： 2×Es Taq MasterMix 12.5 μL，10 nmol/L上、下游引物各1.0 μL，4 ng/μL cDNA模板1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL；擴(kuò)增程序：96 ℃預(yù)變性2 min；96 ℃ 30 s，退火溫度（見(jiàn)表1）30 s，72 ℃ 10 s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。利用2×ChamQTM Universal SYBR qPCR MasterMix試劑盒對(duì)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，操作流程參考其說(shuō)明書(shū)。

1. 6 分子標(biāo)記表達(dá)專(zhuān)一性評(píng)價(jià)

以干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理及相應(yīng)對(duì)照CKN和CKC的GY_C株系葉片cDNA為模板，Actin11為內(nèi)參基因，對(duì)篩選出的優(yōu)質(zhì)分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，進(jìn)一步篩選出受逆境影響小的基因中的分子標(biāo)記。

1. 7 分子標(biāo)記可靠性驗(yàn)證

以Actin11為內(nèi)參基因，用篩選出的分子標(biāo)記對(duì)南寧、貴港和賀州等地采集的不同皺葉類(lèi)型的大豆葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。依據(jù)各基因的ΔCt值進(jìn)行SSCLD鑒定，并將鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果相比較，以驗(yàn)證分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的吻合度。

1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析；采用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果

由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)（表2）可知，12個(gè)樣本的測(cè)序堿基錯(cuò)誤率為0.0226～0.0238，均在0.1000%以下，Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量均大于95.00%，GC含量為45.60%～46.24%。由表3可知，每個(gè)樣本93.00%以上的reads均可比對(duì)到大豆參考基因組上，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2. 2 DEGs篩選及同源性分析結(jié)果

在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下，皺葉材料和正常葉材料葉片共同表達(dá)基因數(shù)為32100個(gè)，占表達(dá)基因總數(shù)的94.1%，其中在皺葉材料葉片中DEGs數(shù)為1351個(gè)，占表達(dá)基因總數(shù)的4.0%；在正常葉材料葉片中DEGs數(shù)為660個(gè)，占表達(dá)基因總數(shù)的1.9%（圖2-A）。與正常葉材料相比，皺葉材料中有1063個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá)，85個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)（圖2-B）。其中，上調(diào)的DEGs中TPM-Cmin>TPM-Nmax的基因有540個(gè)，下調(diào)的DEGs中TPM-Cmax<TPM-Nmin的基因有39個(gè)。下調(diào)的DEGs中無(wú)TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5.00的基因，上調(diào)的DEGs中在正常葉中不表達(dá)的共有13個(gè)，但其中11個(gè)基因的TPM平均值小于1.00，可作為備選基因。最終篩選出9個(gè)表達(dá)差異較大的DEGs（表4），且均表現(xiàn)為明顯表達(dá)上調(diào)。

提取上述9個(gè)DEGs的cDNA序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示僅有GLYMA_15G156200基因在大豆基因組中存在2個(gè)高度相似基因（表4），且與GLYMA_09G049500基因的Query cover和Percent identity分別為88.00%和92.27%。因此選擇余下的8個(gè)DEGs用作開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的候選基因。

2. 3 輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

根據(jù)篩選出的8個(gè)候選基因cDNA序列信息設(shè)計(jì)引物，以溫度梯度PCR篩選引物的最佳退火溫度。以皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的皺葉材料（GY_C）和正常葉材料（GY_N）株系葉片cDNA為模板，對(duì)8個(gè)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果（表5）顯示，與正常葉材料相比，皺葉材料葉片中8個(gè)候選基因的表達(dá)量均明顯增加，其中差異倍數(shù)最小的是GLYMA_13G167100基因，僅為2.55倍；差異倍數(shù)最大的是GLYMA_18G033400基因，達(dá)66.26倍。表達(dá)差異較小可能會(huì)影響SSCLD的鑒定效果。因此，選擇表達(dá)差異較大的GLYMA_18G033400、GLYMA_09G130800、GLYMA_15G160600、GLYMA_15G156200、GLYMA_04G242400和GLYMA_07G229500共6個(gè)基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)專(zhuān)一性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

2. 4 分子標(biāo)記專(zhuān)一性評(píng)價(jià)結(jié)果

干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境是生產(chǎn)中常見(jiàn)的非生物逆境脅迫。對(duì)皺葉材料進(jìn)行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)表達(dá)量差異較大的6個(gè)基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行專(zhuān)一性評(píng)價(jià)，結(jié)果（表6）顯示，qCL-09G130800在蔭蔽、干旱、冷害和鹽脅迫處理下的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC和CKN均顯著增加（P<0.05，下同），qCL-15G160600在蔭蔽和鹽脅迫處理下的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKN顯著增加，qCL-04G242400在鹽脅迫處理的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC顯著增加，qCL-15G156200在蔭蔽、和鹽脅迫處理的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC顯著增加，表明這些基因的表達(dá)受逆境脅迫影響的程度高于SSCLD，盡管qCL-18G033400在蔭蔽、冷害和鹽脅迫處理植株葉片中相對(duì)表達(dá)量顯著高于CKN，但均顯著低于CKC。因此，選擇qCL-18G033400為輔助鑒定SSCLD的候選分子標(biāo)記。

2. 5 分子標(biāo)記可靠性驗(yàn)證結(jié)果

2021年4—6月，從南寧、貴港和賀州等地采集不同皺葉類(lèi)型的大豆葉片樣品共19份（圖3）。其中，從南寧明陽(yáng)基地采集到14份樣品（編號(hào)為樣1～14），從貴港市良種繁殖示范場(chǎng)采集到2份樣品（編號(hào)為樣15和樣16），從賀州市黃姚鎮(zhèn)采集1份（樣17），從賀州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地采集到2份（編號(hào)為樣18和樣19）。利用GLYMA_18G033400基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400對(duì)19份皺葉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)內(nèi)參基因Actin11的表達(dá)量計(jì)算出各樣本GLYMA_18G033400基因的相對(duì)表達(dá)量ΔCt值，同時(shí)進(jìn)行田間皺葉癥抗性鑒定，結(jié)果如表6所示。當(dāng)材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值大于10.00時(shí)，田間鑒定為高抗性材料（皺葉癥級(jí)為0級(jí)）；當(dāng)材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值小于10.00時(shí)，田間鑒定為中抗、感等材料，表明該標(biāo)準(zhǔn)可滿(mǎn)足分子標(biāo)記輔助鑒定SSCLD的要求。

3 討論

SSCLD在我國(guó)南方多個(gè)?。▍^(qū)）可導(dǎo)致大豆嚴(yán)重減產(chǎn)（陳文杰等，2022a）。本研究課題組團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SSCLD不同以往的大豆皺葉類(lèi)型，極有可能由土壤中未知微生物所致，建立快速準(zhǔn)確的SSCLD鑒定方法可為SSCLD的防治提供技術(shù)支持。陳文杰等（2022a）根據(jù)大豆葉片皺縮程度建立了SSCLD田間鑒定方法，但該方法需要穩(wěn)定發(fā)病的田間環(huán)境，且無(wú)法直接鑒定生產(chǎn)上遇到的皺葉是否屬于SSCLD，若采用南方皺葉癥田間鑒定方法對(duì)種子進(jìn)行鑒定，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象，比如對(duì)于攜帶皺葉基因（顯性）材料，葉片可能發(fā)生非SSCLD類(lèi)型的皺縮，收集該材料種子進(jìn)行田間鑒定結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)廣泛用于植株分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)（胡小文等2022；秦英之等，2022；徐曉丹等，2023），尤其是用于沒(méi)有參考基因組的植物上（伍越等，2021）。為了克服表型鑒定SSCLD的缺點(diǎn)，本研究以遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選其葉片在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境中的DEGs，并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記。

本研究篩選出用作開(kāi)發(fā)輔助鑒定皺葉分子標(biāo)記的候選基因GLYMA_18G033400。該基因在Soybase網(wǎng)站（https：//www.soybase.org/）查詢(xún)結(jié)果顯示，其序列全長(zhǎng)為790 bp，含2個(gè)外顯子，編碼區(qū)序列僅為249 bp。再將該基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，該基因與LOC114394687基因的序列一致。LOC114394687基因編碼一種lncRNA，但功能未知，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，僅有一條來(lái)自蕓豆（Phaseolus vulgaris）的mRNA與其同源。lncRNA雖不編碼蛋白，但在表觀遺傳調(diào)控（Gupta et al.，2010）、細(xì)胞周期調(diào)控（Kitagawa et al.，2013）和細(xì)胞分化調(diào)控（Yao et al.，2022）等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。一些lncRNA是人類(lèi)腫瘤重要的調(diào)控因子，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有表達(dá)專(zhuān)一性，故常被作為一種生物標(biāo)志物用于腫瘤的診斷（王思宇和王宇，2022）。大量研究表明，lncRNA廣泛參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)生物或非生物逆境等生理過(guò)程（李寧等，2019），如lncRNASABC1基因通過(guò)響應(yīng)化學(xué)信號(hào)等介導(dǎo)的早期快速抗性反應(yīng)激活植物對(duì)病原的免疫（Liu et al.，2022）。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常葉相比，GLYMA_18G033400基因在皺葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著性增加，且其表達(dá)受遮蔭和干旱等生產(chǎn)上常見(jiàn)的非生物逆境脅迫影響較小，推測(cè)該基因在SSCLD發(fā)生過(guò)程中具有一定的表達(dá)專(zhuān)一性。GLYMA_18G033400基因是否在其他逆境誘導(dǎo)的葉片中表達(dá)量高于皺葉癥，目前尚未知需要更多的逆境試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，但其并不影響GLYMA_18G033400基因作為SSCLD鑒定的指示基因。在涉及大量皺葉性狀的材料需鑒定時(shí)，可利用該基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行初篩。低表達(dá)的皺葉類(lèi)型可斷定為非南方皺葉癥類(lèi)型，而對(duì)于高表達(dá)的皺葉類(lèi)型可借助田間鑒定方法進(jìn)行綜合判定。目前該分子標(biāo)記鑒定采集的19份皺葉材料同田間鑒定結(jié)果一致性較好，但還需要更多的皺葉材料驗(yàn)證該分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，導(dǎo)致大豆皺葉的誘因還有很多，如病毒、除草劑、金屬離子等，分子標(biāo)記在這些誘因?qū)е碌陌櫲~中GLYMA_18G033400基因是否過(guò)表達(dá)目前尚未知，還需要進(jìn)一步收集這些誘因?qū)е碌陌櫲~樣品對(duì)qCL-18G033400進(jìn)行驗(yàn)證。

分子標(biāo)記輔助鑒定SSCLD的方法較田間鑒定方法縮短了鑒定時(shí)間，能在較短時(shí)間內(nèi)判斷生產(chǎn)上遇到的皺葉癥狀是否為SSCLD，為今后生產(chǎn)上SSCLD的快速診治提供技術(shù)參考。但目前生產(chǎn)上存在皺葉癥狀的嚴(yán)重程度不等的情況，目前還缺乏不同皺葉癥級(jí)與標(biāo)記qCL-18G033400表達(dá)量方面的數(shù)據(jù)。因此，若要想精準(zhǔn)判定葉片皺縮是否為SSCLD需盡快找出SSCLD致病因子，通過(guò)檢測(cè)土壤或植株中致病因子含量情況進(jìn)行精準(zhǔn)判定。

4 結(jié)論

根據(jù)遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從DEGs中篩選出SSCLD表達(dá)專(zhuān)一性表達(dá)的基因GLYMA_18G033400，利用其開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）

收稿日期：2023-03-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32060490，32260451）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-04-CES30）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2019GXNSFAA185009）

通訊作者：陳淵（1971-），https：//orcid.org/0000-0003-0876-0154，研究員，主要從事大豆栽培和遺傳育種研究工作，E-mail：chenyuan 313@163.com

第一作者：陳文杰（1982-），https：//orcid.org/0000-0002-3317-4205，副研究員，主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機(jī)制研究工作，E-mail：cenwenji1030@163.com

陳文杰（1982-），副研究員，主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機(jī)制研究工作。主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“新型大豆皺葉基因CL12的圖位克隆及其對(duì)產(chǎn)量性狀影響”和“大豆皺葉癥關(guān)鍵致病因子分析及其誘發(fā)的皺葉分子機(jī)制”2項(xiàng)、廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“大豆皺葉癥抗基因鑒定及功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)”1項(xiàng)，作為主要成員參與省部級(jí)項(xiàng)目8項(xiàng)；獲廣西科技進(jìn)步獎(jiǎng)二、三等獎(jiǎng)各1項(xiàng)；以第一完成人育成已通過(guò)廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的大豆新品種1個(gè)，作為主要參與者育成已通過(guò)廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的大豆新品種8個(gè)；獲第一發(fā)明人授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利7件，實(shí)用新型專(zhuān)利7件；在《中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《大豆科學(xué)》等期刊發(fā)表科技論文35篇，其中以第一作者發(fā)表中文核心期刊論文14篇。