健脾除痰解毒方通過(guò)PD-1/PD-L1通路平衡Th1/Th2漂移而增強(qiáng)Lewis肺癌小鼠免疫功能*

詹 雪， 馮詩(shī)函， 楊 倩， 譚 琪， 張佳艷， 王淑美

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

肺癌作為全球癌癥死亡的主要原因，手術(shù)、放療和化療是根除其最主要的手段［1］。近年來(lái)，隨著腫瘤免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)科的交叉滲透，腫瘤免疫治療成為新的研究熱點(diǎn)和前沿科學(xué)問(wèn)題［2］。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)免疫治療也存在毒副作用大，自身耐藥等諸多問(wèn)題［3］。近年來(lái)有研究證實(shí)，抗癌中藥或方劑在改善免疫功能方面起著重要作用［4］。

健脾除痰解毒方（Jianpi-Chutan-Jiedu Formula，JCJF）是重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科李榮亨教授臨床治療肺癌的經(jīng)驗(yàn)用方除痰解毒方加減而來(lái)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，除痰解毒方可促進(jìn)腫瘤凋亡，抑制肺腺癌小鼠移植瘤生長(zhǎng)，并具有增強(qiáng)靶向藥吉非替尼療效的作用，從而延緩靶向耐藥的發(fā)生［5-6］。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除痰解毒方適當(dāng)加減變化可通過(guò)免疫反應(yīng)發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)作用［7］。

程序性死亡受體1（programmed death-1， PD-1），是T細(xì)胞表面重要的免疫抑制分子，通過(guò)抑制T細(xì)胞免疫活動(dòng)，可阻礙免疫系統(tǒng)殺死癌細(xì)胞［8］。程序性死亡受體配體1（programmed death-ligand 1， PD-L1）與PD-1 相結(jié)合，可以傳導(dǎo)抑制性信號(hào)。腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)PD-L1，一旦與PD-1 結(jié)合便會(huì)向T 細(xì)胞傳遞“剎車(chē)”信號(hào)，導(dǎo)致T 細(xì)胞無(wú)法識(shí)別腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)“免疫逃逸”［9-10］。因此，下調(diào)PD-1/PD-L1 表達(dá)，阻斷PD-1 與PD-L1 結(jié)合，恢復(fù)T 細(xì)胞抗腫瘤活性，激活T 細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞，已成為免疫治療的焦點(diǎn)。且研究表明［11］，Th1 和Th2 細(xì)胞作為機(jī)體免疫失衡的有效反映指標(biāo)，在腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

在此基礎(chǔ)上，本研究擬探討JCJF通過(guò)調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1 通路平衡Th1/Th2 漂移對(duì)肺癌荷瘤小鼠肺癌細(xì)胞免疫功能的影響，為臨床應(yīng)用JCJF 治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動(dòng)物

Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。SPF級(jí)C57BL/6J小鼠70只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)于湖南萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證：SCXK（湘）2019-0004］。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 藥物和主要試劑

JCJF（木香15 g、砂仁15 g、黨參30 g、白術(shù)15 g、茯苓30 g、陳皮10 g、法半夏10 g、三棱30 g、莪術(shù)30 g、威靈仙30 g、仙鶴草30 g和黃芪30 g）購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院。藥材提前浸入10倍量水浸泡1 h，武火煮沸后轉(zhuǎn)文火30 min，共煎3 次，合并3 次藥液，濃縮至含生藥量為2 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射用順鉑（cisplatin， DDP）購(gòu)自云南植物藥業(yè)有限公司，使用前用生理鹽水配成0.25 g/L。胎牛血清購(gòu)自VivaCell；ELISA 試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；PD-1、PD-L1和GAPDH抗體購(gòu)自Signalway Antibody；Bax、Bcl-2、白細(xì)胞介素10（interleukin-10， IL-10）和IL-13抗體購(gòu)自Affinity BioReagents。

3 主要方法

3.1 造模、分組和給藥 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度至2×106mL-1，于60只C57BL/6J 小鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2 mL 單細(xì)胞懸液，接種后7 d 左右，以右側(cè)腋窩皮下觸及豆粒大小腫物為造模成功。造模成功后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將60 只小鼠分為模型（model）組、DDP 組、低劑量JCJF（L-JCJF）組、中劑量JCJF（M-JCJF）組、高劑量JCJF（H-JCJF）組和H-JCJF+DDP 組，每組10 只；另取10只健康C57BL/6J小鼠作為空白（blank）組。

細(xì)胞接種后第8 天開(kāi)始給藥，給藥劑量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》折算，小鼠用藥量（g/kg）=臨床用藥量（g）/60 kg×9.01（小鼠與人的等效劑量比值），每劑生藥含量為275 g，得L-JCJF、M-JCJF 和H-JCJF 組分別按照10.32、20.65和41.30 g/kg煎劑灌胃，每天1次，腹腔注射0.002 5 g/kg DDP，每周2 次；blank 組和model 組灌胃等體積生理鹽水，每天1 次，腹腔注射0.002 5 g/kg 生理鹽水，每周2 次；DDP 組腹腔注射0.002 5 g/kg DDP，每周2 次，灌胃等體積生理鹽水，每天1 次；H-JCJF+DDP 組灌胃41.30 g/kg JCJF，每天1 次，腹腔注射0.002 5 g/kg DDP，每周2 次。干預(yù)14 d后，戊巴比妥鈉麻醉處死小鼠，并進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

3.2 腫瘤體積和腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn) 于造模開(kāi)始第8天起，每2 天以游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），計(jì)算腫瘤體積［V（mm3）=ab2/2］，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

3.3 各組瘤體質(zhì)量、抑瘤率及脾臟指數(shù)計(jì)算 治療14 d 后，戊巴比妥鈉麻醉摘眼球取血并取腫瘤和脾臟組織，稱(chēng)取瘤體和脾臟質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率和脾臟指數(shù)。抑瘤率（%）=（模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量）/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

3.4 HE 染色觀察腫瘤組織和肺組織切片 處死小鼠后，完全剝離Lewis 肺癌小鼠腫瘤組織，打開(kāi)胸腔完整取出肺臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定。常規(guī)脫水、包埋，制備厚度為4 μm 的石蠟切片，染色，封片。200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組腫瘤組織和肺組織病理形態(tài)學(xué)。

3.5 TUNEL法檢測(cè)小鼠腫瘤組織凋亡 將置于4%多聚甲醛中固定的腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋、4 μm 切片，切片依次經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、洗片，滴加蛋白酶K，37 ℃孵育10 min 后PBS 沖洗3 次，滴加TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育60 min，PBS沖洗3 次，滴加DAPI 染液，避光反應(yīng)10 min。PBS 清洗后稍甩干，抗熒光淬滅封片劑封片。于熒光顯微鏡下觀察小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況并采集圖像。

3.6 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠腫瘤組織PD-L1表達(dá) 腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)、封閉，4 ℃下孵育PD-L1 抗體（1∶300）過(guò)夜；孵育Ⅱ抗（1∶1 000）60 min，顯色、蘇木素進(jìn)行核復(fù)染、脫水封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。

3.7 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2、IL-10 和IL-13 濃度 治療14 d，麻醉后摘眼球取血，4 ℃、3 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃冰箱保存待測(cè)。操作遵循說(shuō)明書(shū)，于450 nm測(cè)各孔吸光度，并以空白孔調(diào)零，計(jì)算IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13濃度。

3.8 RT-qPCR 檢測(cè)小鼠腫瘤組織PD-1、PD-L1、Bax和Bcl-2 的mRNA 水平 每組取50 mg 腫瘤組織，用超純RNA 提取試劑盒提取樣本中總RNA，并檢測(cè)各組提取RNA 的濃度及純度，后按試劑盒操作逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列由上海生工合成，序列見(jiàn)表1。

3.9 Western blot 法檢測(cè)小鼠腫瘤組織PD-1、PDL1、Bax、Bcl-2、IL-10 和IL-13 蛋白表達(dá) 每組提取50 mg 腫瘤組織總蛋白，配膠后經(jīng)電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)于PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入PD-1、PD-L1、Bax、Bcl-2、IL-10、IL-13 和GAPDH 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min，加Ⅱ抗，室溫孵育2 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，ECL 發(fā)光試劑盒顯影，ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Graph-Pad Prism 8.0 軟件整理生成統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠移植瘤體積和抑瘤率

治療進(jìn)程中，model 組、DDP 組、L-JCJF 組、MJCJF 組、H-JCJF 組及H-JCJF+DDP 組移植瘤生長(zhǎng)速度依次減緩，各組抑瘤率分別為17.65%、18.99%、39.04%、49.05%和59.72%。與model 組相比，MJCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組 瘤 質(zhì) 量 降 低（P<0.05）；與DDP 組相比，H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組瘤質(zhì)量明顯降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The size， volume and weight of the tumor in mice.A： transplanted tumor size； B： tumor volume changes （n=9）； C： tumor weight （n=10）.Mean±SD.*P<0.05 vs model group； #P<0.05 vs DDP group.圖1 各組小鼠移植瘤大小及生長(zhǎng)比較

2 各組小鼠脾臟指數(shù)

與blank 組相比，model、DDP、L-JCJF 和M-JCJF組脾臟指數(shù)顯著降低（P<0.05）；與model 組相比，HJCJF+DDP 組脾臟指數(shù)顯著升高（P<0.05）；與DDP組相比，H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組脾臟指數(shù)顯著升高（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 健脾除痰解毒方對(duì)荷瘤小鼠脾臟指數(shù)的影響Table 2.Effect of Jianpi-Chutan-Jiedu Formula （JCJF） on the spleen index in tumor-bearing mice （Mean±SD.n=10）

3 各組小鼠腫瘤組織和肺組織形態(tài)學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，model 組腫瘤組織見(jiàn)較多核分裂（黑色箭頭），未見(jiàn)明顯壞死，其余各組胞核固縮或碎裂，少見(jiàn)核分裂，H-JCJF+DDP 組見(jiàn)較多局灶性腫瘤細(xì)胞壞死（紅色箭頭）；model組肺組織可見(jiàn)胞核較大、異形，核質(zhì)比高的腫瘤轉(zhuǎn)移灶（綠色箭頭），其余各組均未見(jiàn)明顯轉(zhuǎn)移灶形成，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Histological observation of tumor and lung tissues （HE staining， ×200）.圖2 腫瘤組織和肺組織形態(tài)學(xué)變化

4 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況

藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核（DAPI），綠色熒光標(biāo)記TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞。與model組相比，L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 組和H-JCJF+DDP 組凋亡率均顯著升高（P<0.05）；與DDP組相比，H-JCJF+DDP組凋亡率顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 3.Tumor cell apoptosis detected by TUNEL method （scale bar=20 μm）.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group； #P<0.05 vs DDP group.圖3 TUNEL法檢測(cè)各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡

5 各組小鼠腫瘤組織PD-L1表達(dá)

與model 和DDP 組相比，H-JCJF 和H-JCJF+DDP組PD-L1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein expression of PD-L1 in tumor tissue detected by immunohistochemistry（×200）.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs model group； #P<0.05 vs DDP group.圖4 免疫組化觀察各組小鼠瘤組織中PD-L1蛋白表達(dá)

6 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13濃度

與blank 組相比，model、DDP、L-JCJF 和M-JCJF組血清IFN-γ 水平顯著降低（P<0.05），model、DDP、L-JCJF、M-JCJF 和H-JCJF 組IL-2 水平顯著降低（P<0.05），IL-10 和IL-13 水平顯著升高（P<0.05）；與model 組相比，H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組IFN-γ 水平顯著升高（P<0.05），M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP組IL-2 水平顯著升高（P<0.05），L-JCJF、M-JCJF、HJCJF 和H-JCJF+DDP 組IL-10 水 平 顯 著 降 低（P<0.05），M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組IL-13 水平顯著降低（P<0.05）；與DDP 組相比，H-JCJF 和HJCJF+DDP 組IFN-γ 和IL-2 水平顯著升高（P<0.05），H-JCJF+DDP 組IL-10 水平顯著降低（P<0.05），MJCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組IL-13 水平顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 5.Serum levels of IFN-γ （A）， IL-2（B）， IL-10 （C） and IL-13 （D） among the groups.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs blank group； #P<0.05 vs model group； △P<0.05 vs DDP group.圖5 各組小鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-13濃度

7 各組小鼠移植瘤組織PD-1、PD-L1、Bax 和Bcl-2的mRNA表達(dá)

與model 組 相 比，M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組PD-1 和PD-L1 的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），DDP、L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP組Bax 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），L-JCJF、MJCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組Bcl-2 的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）；與DDP 組相比，H-JCJF 和HJCJF+DDP 組PD-1 和PD-L1 的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP組Bax 的mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），L-JCJF、MJCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組Bcl-2 的mRNA 表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），見(jiàn)圖6。

Figure 6.The mRNA expression levels of PD-1/PD-L1 （A） and Bcl-2/Bax （B） in tumor tissues.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group； #P<0.05 vs DDP group.圖6 各組小鼠移植瘤組織PD-1、PD-L1、Bax和Bcl-2的mRNA表達(dá)

8 各組小鼠移植瘤組織PD-1、PD-L1、Bax、Bcl-2、IL-10和IL-13蛋白表達(dá)

與model 組相比，L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和HJCJF+DDP 組PD-1 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），MJCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組PD-L1蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）；與DDP組相比，M-JCJF、H-JCJF和HJCJF+DDP 組PD-1 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），HJCJF+DDP 組PD-L1 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）。與model 組相比，DDP、L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和HJCJF+DDP 組Bax 蛋白表達(dá)顯著增多（P<0.05），LJCJF、M-JCJF、H-JCJF和H-JCJF+DDP組Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）。與DDP 組相比，M-JCJF、HJCJF 和H-JCJF+DDP 組Bax 蛋白表達(dá)顯著增多（P<0.05），L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）。與model 組相比，L-JCJF、M-JCJF、H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組IL-10和IL-13 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）；與DDP 組相比，L-JCJF 和M-JCJF 組IL-10 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05），H-JCJF 和H-JCJF+DDP 組IL-10 和IL-13 蛋白表達(dá)顯著減少（P<0.05）。見(jiàn)圖7。

Figure 7.The protein expression of PD-1， PD-L1， Bcl-2， Bax， IL-10 and IL-13 in the tumor tissues.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs model group； #P<0.05 vs DDP group.圖7 各組小鼠移植瘤組織PD-1、PD-L1、Bax、Bcl-2、IL-10和IL-13蛋白表達(dá)

討 論

肺癌屬于中醫(yī)學(xué)中“咳嗽”“肺痿”“痰飲”“肺積”等范疇［12］，肺癌中醫(yī)發(fā)生發(fā)展的病因病機(jī)多認(rèn)為是痰瘀氣滯、陰傷氣耗、虛實(shí)夾雜，瘰疬積于內(nèi)而成［13］。目前，中醫(yī)藥在治療肺癌方面優(yōu)勢(shì)凸顯，在調(diào)節(jié)免疫平衡，增強(qiáng)體內(nèi)外化療作用方面療效顯著，可有效提高肺癌患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)患者生存期［14］。

JCJF 全方由木香、砂仁、黨參、白術(shù)、茯苓、陳皮、法半夏、三棱、莪術(shù)、威靈仙、仙鶴草和黃芪組成。方中香砂六君子湯健脾益氣化痰，理氣暢中［15］；三棱和莪術(shù)活血化瘀消癥［16］；威靈仙通絡(luò)止痛，兼能軟堅(jiān)［17］；仙鶴草解毒止血，扶正補(bǔ)虛［18］；黃芪提高機(jī)體免疫力［19］；全方共奏解毒散結(jié)化瘀、健脾除痰之功。這體現(xiàn)了中藥治療肺癌扶正兼祛邪的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)HE染色觀察腫瘤和肺組織病理形態(tài)學(xué)，判斷JCJF是否能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡壞死、抑制腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，結(jié)果顯示，除model組外，各用藥組胞核固縮或碎裂，少見(jiàn)核分裂，H-JCJF+DDP 組可見(jiàn)較多局灶性腫瘤細(xì)胞壞死；且model組可見(jiàn)肺癌轉(zhuǎn)移灶，其余各組均未見(jiàn)局部轉(zhuǎn)移灶。這說(shuō)明JCJF 有抗腫瘤及抗轉(zhuǎn)移的療效，且聯(lián)合化療藥使用更能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死凋亡。

Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡和存活的過(guò)程密切相關(guān)，Bax過(guò)表達(dá)能夠有效抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2過(guò)表達(dá)能顯著抑制Bax表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，并協(xié)助腫瘤細(xì)胞抵抗免疫監(jiān)視，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［20-21］。賈羲等［22］發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草多糖可明顯降低肺癌小鼠模型中Bcl-2 mRNA 表達(dá)，增加Bax mRNA表達(dá)，從而達(dá)到干預(yù)腫瘤組織生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用。鴉膽子油乳對(duì)A549 肺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，并且鴉膽子油乳能夠抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)，與其調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)因子Bcl-2 和Bax 蛋白的表達(dá)有密切的關(guān)系［23］。本研究結(jié)果也表明，JCJF 可明顯下調(diào)Leiws 肺癌小鼠腫瘤組織中Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)，上調(diào)組織中Bax mRNA 和蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的壞死凋亡。

當(dāng)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞時(shí)，機(jī)體可通過(guò)其正常免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞可通過(guò)上調(diào)免疫抑制或下調(diào)免疫激活機(jī)制促使其發(fā)生免疫逃逸［24-25］。IL-2和IFN-γ 主要由Th1 細(xì)胞分泌，IL-10 和IL-13 主要由Th2 細(xì)胞分泌［26］。生理情況下，Th1/Th2 細(xì)胞維持動(dòng)態(tài)平衡，使機(jī)體維持正常的免疫功能。在腫瘤組織中，當(dāng)Th1 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)升高，提示機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫力較活躍；但當(dāng)Th1/Th2 細(xì)胞失衡，Th1向Th2細(xì)胞漂移，Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)升高時(shí)，則提示機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫力降低［27］。因此，平衡Th1/Th2細(xì)胞對(duì)于調(diào)節(jié)腫瘤免疫功能至關(guān)重要。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JCJF 可顯著提高Th1 細(xì)胞水平，降低Th2細(xì)胞水平，對(duì)Th1/Th2具有平衡功能。

PD-1 作為I 型跨膜蛋白，主要表達(dá)于活化的CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和B 細(xì)胞等免疫細(xì)胞中［28］，其配體PD-L1 主要表達(dá)于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中［29-30］。有研究表明，PD-L1 在人體正常組織中表達(dá)相對(duì)較低，但是在肺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤組織中的表達(dá)量非常高［31］，并且PD-L1 可促進(jìn)IL-10的分泌，由于IL-10 具有免疫抑制作用，因此有報(bào)道提出PD-L1 對(duì)免疫系統(tǒng)具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用［32］。PD-1及其配體PD-L1 廣泛存在于腫瘤免疫微環(huán)境中，對(duì)腫瘤免疫起著非常重要的調(diào)節(jié)作用［33］。本研究結(jié)果表明，JCJF 可降低腫瘤組織中PD-1/PD-L1 表達(dá)，恢復(fù)T 細(xì)胞活性，上調(diào)IFN-γ 和IL-2 水平，下調(diào)IL-10 和IL-13 水平，平衡Th1/Th2 漂移，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能。

本研究認(rèn)為JCJF可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的凋亡來(lái)達(dá)到抗腫瘤的目的，并且可能通過(guò)降低肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織PD-1/PD-L1 表達(dá)，平衡Th1/Th2 細(xì)胞，恢復(fù)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的分泌能力，減少腫瘤細(xì)胞周?chē)鶷 細(xì)胞丟失，抑制腫瘤細(xì)胞逃逸免疫防御和監(jiān)視，從而增強(qiáng)肺癌荷瘤小鼠免疫功能。