基于多光譜成像技術(shù)鑒別不同紫花苜蓿品種的種子

倪浩然,王 潤,胡 昊,劉俊澤,田沛鑫,賈善剛

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100193)

多光譜成像(Multispectral imaging,MSI)技術(shù)是一種新型的分析檢測技術(shù),它將空間成像系統(tǒng)和光譜探測系統(tǒng)相結(jié)合,能夠同時獲取被測物的光譜和空間信息。該技術(shù)具有簡便易行、使用可靠、成本較低等優(yōu)點,且不會對被測物造成破壞[1-3]。歸一化標(biāo)準(zhǔn)判別分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)是一種基于MSI變換的監(jiān)督變換構(gòu)建方法,能夠?qū)D像分割成具有不同光譜特征的感興趣區(qū)域,當(dāng)兩個不同品種具有不同的光譜特征時,在nCDA變換后的圖像中,它們會表現(xiàn)為兩個不同的感興趣區(qū)域,更便于解釋和分割,以便進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析[1]。Shrestha等[4]使用nCDA對11個番茄(SolanumlycopersicumL.)品種進行配對判別,正確識別率達到100%,只有少數(shù)幾個品種的識別率低于85%。王雪萌等[5]采用多光譜成像的無損檢測方法,成功地對紫花苜蓿硬實種子和非硬實種子進行了識別,準(zhǔn)確率高達96.8%～99.0%。

抗壞血酸(Ascorbic acid,AsA)又稱維生素C,化學(xué)名為L-蘇糖型-六-2-烯醇-1內(nèi)酯[6],植物體內(nèi)有效的抗氧化劑和自由基清除劑,參與植物體內(nèi)許多物質(zhì)代謝和氧化還原反應(yīng),可以減少膜脂過氧化對細胞造成的傷害[7-10]。國內(nèi)外許多研究表明,AsA有利于種子的萌發(fā)。如尚瑞廣等[11]發(fā)現(xiàn),300 mg·L-1AsA處理的瑪咖(LepidummeyeniiWalp.)陳種子發(fā)芽率最高。Dolatabadian等[12]發(fā)現(xiàn)AsA對向日葵(HelianthusannuusL.)和油菜(BrassicanapusL.)種子萌發(fā)有顯著的促進作用。Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)0.1 mmol·L-1AsA通過抑制過量的ROS產(chǎn)生、降低離子毒性和上調(diào)抗氧化系統(tǒng)來促進紫花苜蓿種子的萌發(fā)和誘導(dǎo)耐鹽性。

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科牧草,具有營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高、適應(yīng)性好、抗逆性強等特點[14-15],在我國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護中發(fā)揮著重要的作用[16],被稱為“牧草之王”[17]。目前,國內(nèi)外使用多光譜技術(shù)來進行牧草種子尤其是紫花苜蓿種子品種區(qū)分的研究較少,且AsA含量與種子的多光譜參數(shù)間是否存在一定的關(guān)聯(lián)還未知。因此,本研究利用多光譜技術(shù)對25個不同紫花苜蓿品種的種子形態(tài)特征和光譜特征進行采集,同時結(jié)合nCDA算法,對不同品種種子的形態(tài)特征和光譜特征進行了分析,以期為多光譜成像技術(shù)在牧草品種識別領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

25個紫花苜蓿品種分別為：WL系列品種‘298’‘319’‘343’‘349’‘354’‘358’‘363’‘377’‘440’‘525’和‘712’,以及‘阿爾岡金’‘東苜2號’‘甘農(nóng)1號’‘甘農(nóng)9號’‘公農(nóng)1號’‘驚喜’‘可汗’‘龍牧803’‘龍牧806’‘苜豐’‘中草3號’‘中蘭2號’和‘中苜1號’。WL系列種子由北京正道種子公司惠贈,其它苜蓿種子由育種單位與代理公司提供,或本實驗室保存。

1.2 多光譜信息采集

使用多光譜成像儀VideometerLab(Videometer A/S,Herlev,Denmark)來進行種子圖像信息的采集[18]。

在獲取種子的RGB圖像后,導(dǎo)出種子形態(tài)特征數(shù)據(jù),包括面積(Area)、長度(Length)、寬度(Width)、長寬比(RatioWidthLength)、緊實度圓(Compactness Circle)、形狀參數(shù)(BetaShape)、顏色參數(shù)(CIELab)、飽和度(Saturation)、色調(diào)(Hue)等指標(biāo);然后在“statistic”模塊中導(dǎo)出種子的光譜特征數(shù)據(jù),包括從種子圖像像素中計算的19個波長反射光的平均反射率[19]。

1.3 多光譜數(shù)據(jù)分析

利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder將形態(tài)特征差別最大的‘阿爾岡金’和‘WL377’分別標(biāo)記為紅色和藍色,以此作為標(biāo)準(zhǔn),依次輸出其余23個紫花苜蓿品種的nCDA圖像。

使用R語言中的factoextra包來進行k-means聚類分析。

1.4 發(fā)芽率與AsA含量測定與特征參數(shù)分析

各品種均采用紙上發(fā)芽,將種子以10×10擺放在發(fā)芽盒上,每個品種3次重復(fù)。參照《草種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗》GB/T 2930.4-2017[20]進行操作,將培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為恒溫20℃,模擬正常光照條件,發(fā)芽第10天測定發(fā)芽率。

種子發(fā)芽率=(末次計數(shù)時全部正常發(fā)芽粒數(shù)/供檢種子數(shù))×100%。

使用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的還原型AsA含量測定試劑盒進行AsA含量的測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 26進行單因素方差分析(One-way ANOVA),使用R語言中的heatmap函數(shù)來繪制特征參數(shù)相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種紫花苜蓿種子的多光譜形態(tài)與光譜特征分析

利用不同品種種子的多光譜形態(tài)與光譜特征參數(shù),繪制25個品種種子的折線圖(圖1)。選取差異較大的4個形態(tài)參數(shù),進行25個品種的比較,結(jié)果顯示,與其他各品種相比,品種‘WL298’的飽和度、顏色參數(shù)A和顏色參數(shù)B差異較大,而其余各品種間也有一定區(qū)別(圖1a)。隨著波長的增加,光譜反射率呈上升趨勢,其中品種‘WL298’在365,405和430 nm三個波長下的光譜反射率與其他品種相比差異較大(圖1b)。其余各品種在各個波長下的光譜反射率也顯示出一定差異。

圖1 不同品種種子的多光譜形態(tài)與光譜特征參數(shù)Fig.1 MSI morphology and spectral data for seeds of 25 different varieties注：(a)不同品種紫花苜蓿種子的形態(tài)特征參數(shù),從中選取顏色參數(shù)L、顏色參數(shù)A、顏色參數(shù)B、飽和度繪制折線圖;(b)不同品種紫花苜蓿種子的光譜特征參數(shù)Note：(Panel a) Morphological data for different alfalfa varieties seeds,“CIELab”and “Saturation”were selected;(Panel b) Spectral data for different alfalfa varieties seeds

2.2 不同品種紫花苜蓿種子的特征參數(shù)聚類分析

利用形態(tài)特征參數(shù)進行聚類,結(jié)果顯示6個國外WL系列品種(‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’)被歸為一類(II),第Ⅲ類也偏向于國外品種。而品種‘WL298’被單獨歸為一類(I),這顯示其形態(tài)上的顯著不同(圖2a)。第Ⅳ類包括10個偏向于國內(nèi)的品種。利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder輸出nCDA圖像,可以看到‘WL298’‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’這幾個品種均顯示為均勻的藍色,其中品種‘WL298’的藍色則最為均勻,紅黃色種子則偏向于集中在第Ⅲ類和第Ⅳ類。

圖2 基于形態(tài)和光譜特征參數(shù)的聚類分析Fig.2 K-means clustering of morphological and spectral data注：(a)基于多光譜形態(tài)參數(shù)的聚類分析樹狀圖,外圈為各品種對應(yīng)的nCDA圖像;(b)基于光譜特征參數(shù)的聚類分析樹狀圖,外圈為各品種對應(yīng)的RGB圖像Note：(Panel a) K-means clustering of morphological data,the outer is the nCDA images corresponding to the tested individual varieties;(Panel b) K-means clustering of spectral data,the outer is the RGB images corresponding to the tested individual varieties

基于光譜特征進行聚類分析,結(jié)果顯示從‘驚喜’到‘龍牧806’的18個品種被歸為一大類(III),‘品種WL298’被單獨歸為一類(I)。雖然基于形態(tài)聚類結(jié)果沒有將一些品種區(qū)分開,如品種‘WL349’和‘甘農(nóng)1號’‘東苜2號’,但是它們在光譜聚類中能夠區(qū)分。這說明,結(jié)合形態(tài)參數(shù)和光譜參數(shù),可以將本實驗25個品種區(qū)分開。此外,除品種‘WL298’外,各品種種子的RGB圖像差別不大,無法從肉眼上進行區(qū)分。

2.3 不同品種紫花苜蓿種子的發(fā)芽結(jié)果與AsA含量

比較各品種種子發(fā)芽率,我們發(fā)現(xiàn)有14個品種的發(fā)芽率都在90%以上,僅有‘阿爾岡金’的發(fā)芽率低于80%(圖3a)。經(jīng)過相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),發(fā)芽率與各個參數(shù)間的相關(guān)性很低。

比較各品種種子的AsA含量,發(fā)現(xiàn)品種‘WL363’的AsA含量最高,為1 856.15 mg·g-1,‘苜豐’的AsA含量最低,為845.41 mg·g-1(圖3b)。

圖3 不同品種發(fā)芽率及AsA含量Fig.3 Germination rate and AsA content of 25 different varieties注：(a)各品種紫花苜蓿種子正常萌發(fā)第十天發(fā)芽率;(b)各品種紫花苜蓿種子AsA含量。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note：(Panel a) Germination rate for different alfalfa varieties seeds on the tenth day;(Panel b) AsA content of alfalfa seeds of different varieties.Different lowercase letters indicate a significant difference at the 0.05 level

2.4 特征參數(shù)相關(guān)性分析

對AsA含量和形態(tài)、光譜特征參數(shù)分別進行相關(guān)性分析,繪制出參數(shù)相關(guān)性的熱圖(圖4)。AsA含量與形狀參數(shù)a、形狀參數(shù)b、長寬比以及緊實度呈一定的負相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為-0.59,-0.58,-0.67,-0.68,而與其余形態(tài)特征參數(shù)則有一定的正相關(guān)關(guān)系,但相關(guān)性較弱(圖4a)。另外,各個形態(tài)參數(shù)之間存在一定的相關(guān)性,在熱圖中大致分為三個區(qū)域。與此同時,AsA含量與光譜特征參數(shù)的相關(guān)性較弱,而各波長下的光譜反射率之間存在一定相關(guān)性,也同樣被分為三個區(qū)域(圖4b)。

圖4 特征參數(shù)相關(guān)性分析熱圖Fig.4 Heat map for correlation analysis注：(a)AsA含量與形態(tài)特征參數(shù)相關(guān)性分析熱圖;(b)AsA含量與光譜特征參數(shù)相關(guān)性分析熱圖Note：(Panel a) Heat map for correlation analysis between AsA content and morphological data;(Panel b) Heat map for correlation analysis between AsA content and spectral data

3 討論

種子因外表氧化,不同儲存年限的種皮顏色會呈現(xiàn)一定區(qū)別,年份較遠的種子會因為氧化問題而顏色變暗,失去光澤,從而飽和度降低[21]。這可能是導(dǎo)致‘WL298’飽和度低于其他品種的原因。此外,CIELab顏色參數(shù)是一種由國際照明委員會推薦的用于檢驗顏色的指標(biāo),其中L*表示亮度,a*表示由綠到紅,b*表示由藍到黃[22]。該參數(shù)可以區(qū)分人眼不能察覺的顏色變化,從而消除視覺上的主觀性[23]。在本研究中,‘WL298’的CIELab a*和CIELab b*與其他品種相比差別較大,與輸出的RGB圖像結(jié)果基本一致。而其余各品種的形態(tài)參數(shù)特征差別不明顯,用肉眼也無法對他們進行區(qū)分。在光譜特征方面,品種‘WL298’在365～450 nm波長下的光譜反射率高于其他品種,也極有可能是由于種皮顏色變灰、變白導(dǎo)致的[24]。

基于形態(tài)特征的聚類分析顯示,大多數(shù)的來自國外的紫花苜蓿WL品種(‘WL354’‘WL363’‘WL366’‘WL377’‘WL525’‘WL712’)被歸為一類,說明這幾個品種在形態(tài)特征上的相似度極高。另外第Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ類偏向于國外品種,第Ⅳ類偏向于國內(nèi)品種,說明國外品種與國內(nèi)品種在形態(tài)特征上存在一定區(qū)別,以‘WL377’和‘阿爾岡金’為標(biāo)準(zhǔn)輸出的nCDA圖像也同樣說明了這一觀點。此外,不管是基于形態(tài)特征參數(shù)還是基于光譜特征參數(shù),結(jié)果顯示‘WL298’都被單獨聚為一類,且它的RGB圖像也與其他品種具有較大差別,可以通過肉眼觀察得到,這個結(jié)果從一定程度上說明了利用多光譜成像技術(shù)對于特征差別較大的品種的區(qū)分比較準(zhǔn)確。因此,以上結(jié)果表明利用多光譜成像技術(shù)來對不同品種進行鑒別具有一定的效果。

許多研究表明,外源施加AsA能夠提高種子在逆境條件下的發(fā)芽率[25-30]。對不同苜蓿品種的發(fā)芽率與其內(nèi)在AsA的含量進行了測定,結(jié)果顯示兩者相關(guān)性不強,可能是由于各種子貯藏年限不盡相同所導(dǎo)致的。對不同品種的種子內(nèi)在AsA含量和形態(tài)、光譜特征參數(shù)進行了相關(guān)性分析,結(jié)果顯示AsA含量與部分形態(tài)特征參數(shù)的相關(guān)性大于與光譜特征參數(shù)的相關(guān)性。在植物中,AsA由L-半乳糖通過Smirnoff-Wheeler途徑合成[31]。Mario等[32]的研究表明,AsA濃度與組織類型和環(huán)境密切相關(guān),尤其是光照強度。但是對AsA含量與種子多光譜形態(tài)、光譜特征參數(shù)是否有關(guān)聯(lián)的研究甚少。在形態(tài)特征參數(shù)中,形狀參數(shù)a表示通過多光譜成像儀獲取種子圖像后計算并輸出β橢圓擬合的參數(shù)a,對應(yīng)于種子形狀中最尖銳部分的寬度;而形狀參數(shù)b則對應(yīng)最粗鈍部分的寬度[19]。緊實度圓代表種子面積與相同長度的圓的面積之比。本研究的結(jié)果顯示AsA含量與種子的形狀參數(shù)a、形狀參數(shù)b、長寬比以及緊實度圓有一定的負相關(guān)關(guān)系,且相關(guān)性較強,但具體原因仍不清楚,后續(xù)可以進行深入研究。

不同品種的牧草種子在肉眼上難以區(qū)別,傳統(tǒng)的對于品種進行鑒別的方法通常包括蛋白質(zhì)指紋圖譜鑒定和化學(xué)鑒定法等[33-34]。這些方法主要是基于種子的化學(xué)、物理以及生物學(xué)特性來進行鑒定[35],但是往往耗費時間長、成本高,而且這些方法會破壞種子的完整性。王芳等[36]利用太赫茲時域光譜(THz-TDS)技術(shù)對豆科牧草種子進行鑒定識別,結(jié)果表明該技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計分析方法可以作為無損鑒定牧草種子真?zhèn)魏妥R別牧草種子種類的一種有效手段,但該技術(shù)目前缺少一個標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫。駱坤蘭[37]建立了基于高光譜成像技術(shù)的甜瓜(CucumismeloL.)種子識別模型,識別準(zhǔn)確率達98%以上,但高光譜成像技術(shù)成本較高。因此,對于種子行業(yè)來說,發(fā)展一種通量高、無損、省時、成本低且準(zhǔn)確率高的檢測技術(shù)極為重要,本研究的結(jié)果表明,多光譜成像檢測技術(shù)的應(yīng)用將是一個極具潛力的發(fā)展方向。

4 結(jié)論

利用多光譜成像技術(shù),結(jié)合形態(tài)和光譜特征參數(shù),能夠在一定程度上將不同品種的牧草種子區(qū)分開,因此具有很大的研究潛力。此外,種子抗壞血酸含量與部分形態(tài)特征參數(shù)存在一定的相關(guān)性,后續(xù)可以對相關(guān)機理進行更深入的研究。