Napsin A 表達與培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療表皮生長因子受體突變肺腺癌患者療效和預(yù)后的關(guān)系△

程蘭蘭，陳君平，呂東來，徐軍#

解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院1病理科，2腫瘤一科，合肥 230031

表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為EGFR突變的晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者一線治療的首選藥物，但大量患者表現(xiàn)出原發(fā)性或獲得性耐藥和腫瘤進展。培美曲塞聯(lián)合鉑類方案化療仍是目前臨床應(yīng)對EGFR-TKI 治療失敗患者的常用治療手段，探索能有效預(yù)測二線化療療效的分子標志物可為臨床制訂個體化治療方案提供參考。Napsin A是目前診斷肺腺癌最常用的標志物之一，也是早期肺癌手術(shù)切除后的預(yù)后評估指標[1-3]。研究報道，接受培美曲塞化療的NSCLC中NapsinA基因表達與胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）水平和患者預(yù)后相關(guān)[4]，TS 是培美曲塞的靶酶，其表達情況與培美曲塞的療效密切相關(guān)。本研究探討Napsin A 表達與培美曲塞聯(lián)合鉑類方案二線治療NSCLC 患者療效及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月至2021 年6 月解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院收治的肺癌患者。納入標準：①組織學(xué)分型為肺腺癌；②臨床分期為ⅢB～Ⅳ期；③EGFR突變陽性且一線接受EGFR-TKI 治療后進展；④年齡≥18 歲；⑤有耐藥后二次活檢EGFR、Kirsten 鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、腫瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）和T790M 基因突變檢測結(jié)果，且有足夠可用的組織用于免疫組化檢測；⑥后續(xù)至少接受2 個周期培美曲塞聯(lián)合鉑類化療。排除標準：①肝腎功能、血常規(guī)及心電圖異常；②既往接受過培美曲塞或吉西他濱等治療。依據(jù)納入和排除標準，本研究共納入64 例肺腺癌患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意。

1.2 基因突變檢測

所有標本用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。應(yīng)用FFPE 樣品DNA 分類試劑盒提取DNA，人類EGFR等多基因突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物醫(yī)藥有限公司，詳細操作參照試劑盒說明書進行。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定

采用BenchMark-GX 全自動免疫組化儀進行免疫組化染色，采用EnVision 二步法。兔抗人單克隆抗體Napsin A 購自福州邁新公司，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照，用已知陽性的手術(shù)切除肺腺癌組織作為陽性對照。Napsin A 定位于細胞質(zhì)，使用半定量法來確定免疫組化評分。陽性細胞百分比評分：無陽性細胞為0 分，1%～10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～80%為3 分，＞80%為4 分；染色強度評分：無染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩項評分相乘，總分≥4 分定義為陽性，＜4 分定義為陰性。

1.4 療效評價及預(yù)后分析

根據(jù)實體瘤療效評價標準[5]評價療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）和疾病進展（PD）?？陀^緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+PR）例數(shù)/總例數(shù)×100%，疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）例數(shù)/總例數(shù)×100%。無進展生存期（progression-free survival，PFS）定義為二線治療開始至疾病進展或尚未出現(xiàn)疾病進展的末次隨訪時間，總生存期（overall survival，OS）定義為二線治療開始至因任何原因死亡的時間或末次隨訪時間。隨訪截止時間為2022 年12 月31 日。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Log-rank 檢驗；影響因素分析采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達情況的比較

64 例肺腺癌患者中，EGFR少見突變8 例，其中L861Q 和S768I 共突變2 例，G719X 突變4 例，19del 和L858R 共突變2 例；19del 繼發(fā)T790M 突變8 例，L858R 繼發(fā)T790M 突變5 例。Napsin A 在肺腺癌組織中呈細顆粒狀著色，陽性表達率為73.4%（47/64）。不同性別、年齡、吸煙史、EGFR突變類型、KRAS狀態(tài)、TP53狀態(tài)及繼發(fā)T790M 突變情況的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；國際肺癌研究協(xié)會（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）分級為Ⅰ或Ⅱ級的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 陽性表達率明顯高于IASLC分級為Ⅲ級的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同臨床特征肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 表達情況的比較

2.2 近期療效分析

64 例EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后，CR 0 例，PR 17 例，SD 39 例，PD 8 例，ORR 為26.6%，DCR 為87.5%。女性患者ORR 高于男性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.460，P=0.044）；Napsin A 陽性患者DCR 明顯高于Napsin A 陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.997，P=0.003）。（表2）

表2 不同臨床特征EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療的近期療效

2.3 二線治療后PFS 影響因素的單因素分析和多因素分析

單因素及多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A 陽性、聯(lián)合貝伐珠單抗治療、無繼發(fā)T790M 突變均是EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后PFS 的保護因素（表3）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，64 例患者中位PFS 為5.0 個月（95%CI：4.120～5.880 個月）；Napsin A 陽性、聯(lián)合貝伐珠單抗治療、無繼發(fā)T790M 突變患者的PFS 均優(yōu)于Napsin A 陰性、未聯(lián)合貝伐珠單抗治療、繼發(fā)T790M 突變患者（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同臨床特征EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后的PFS曲線

表3 EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后PFS 影響因素的單因素分析和多因素分析

2.4 二線治療后OS 影響因素的單因素分析和多因素分析

多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A 陽性是EGFR突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后OS 的保護因素（表4）。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，64例患者中位OS為21.0個月（95%CI：15.271～26.729個月）；Napsin A陽性患者中位OS 為26.0 個月（95%CI：19.988～32.012 個月），明顯優(yōu)于Napsin A 陰性患者（中位OS 為16.0 個月，95%CI：13.485～18.515個月）（P=0.003）（圖2）。

圖2 Napsin A陽性（n=47）和Napsin A陰性（n=17）肺腺癌患者的OS曲線

表4 EGFR 突變肺腺癌患者接受培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療后OS 影響因素的單因素分析和多因素分析

3 討論

本研究集中探討EGFR-TKI治療進展后的培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療效果，總體ORR 為26.6%，與Zhong 等[6]（30.9%）、Masuda 等[7]（23.0%）和Jiang等[8]（27.0%）報道相近；中位PFS 為5.0 個月，與Han等[9]（5.09 個月）、Masuda 等[7]（5.1 個月）的結(jié)果相近，略高于Zhong 等[6]（4.5 個月）報道；中位OS 為21.0 個月，與鄭宣軒等[10]（20.4 個月）的結(jié)果相近，但比Masuda 等[7]（17.8 個月）報道的略長。出現(xiàn)這些差異的可能原因：一是樣本量差異；二是本研究及Masuda等[7]的研究均入組了部分聯(lián)合貝伐珠單抗治療的患者，一定程度上能有效延長PFS 和OS；三是入組患者中19del突變比L858R突變的比例略高，以往研究表明19del突變患者的OS優(yōu)于L858R突變患者[11]，本研究結(jié)果也顯示19del 趨向于是患者OS的獨立保護因素，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.052）。

本研究分析了二線治療后患者PFS 和OS 的影響因素。多項研究表明，應(yīng)用貝伐珠單抗二線及以上治療晚期肺腺癌療效顯著，EGFR-TKI 和貝伐珠單抗有協(xié)同作用，二者有共同的c-met 上游通路[12]。鄭宣軒等[10]報道應(yīng)用貝伐珠單抗聯(lián)合化療二線及以上治療晚期NSCLC 的ORR 為32.2%，PFS 為6.4個月。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合貝伐珠單抗治療患者的ORR 為27.6%，中位PFS 為6.6 個月，均優(yōu)于未聯(lián)合貝伐珠單抗治療患者，聯(lián)合貝伐珠單抗治療是二線治療后患者PFS 的獨立保護因素。繼發(fā)T790M 突變是一代EGFR-TKI 獲得性耐藥的機制之一，相比于其他原因引起的耐藥，T790M 突變患者預(yù)后更好[13]，但如果在TKI 治療前伴發(fā)T790M 突變則臨床反應(yīng)較差[14]。本研究檢測到繼發(fā)T790M突變13 例（20.3%），遠低于文獻報道的突變率[13]。主要原因：入組均為TKI 耐藥后接受化療的患者，不能代表整個EGFR突變?nèi)后w，另有很大一部分T790M 突變患者繼續(xù)接受二代或三代TKI 治療而非化療。結(jié)果顯示，無繼發(fā)T790M 突變患者接受二線治療后PFS 優(yōu)于繼發(fā)T790M 突變患者，繼發(fā)T790M 突變是二線治療后患者PFS 的獨立危險因素，提示這部分患者二線接受化療療效有限，可以選擇二代或三代TKI 治療或其他治療。

Napsin A 是繼甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）之后又一個在預(yù)后中受到關(guān)注的肺腺癌標志物[1]，常表達于肺腺癌、卵巢透明細胞癌、腎細胞癌、甲狀腺癌等[15-16]，是判斷早期手術(shù)切除的肺腺癌患者預(yù)后的標志物[1-3]。Lee 等[3]單因素分析顯示，TTF-1 陽性患者預(yù)后較好，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.096）；多因素分析顯示，無論TNM 分期如何，Napsin A 是一個比TTF-1 更有利于預(yù)后的獨立影響因素。研究發(fā)現(xiàn)，Napsin A 表達受TTF-1 的調(diào)控[1]，TTF-1 表達與培美曲塞化療后患者的PFS 有關(guān)[17]，但該研究有一定局限性，沒有分析OS?；谶@些結(jié)果，本研究探究了Napsin A對培美曲塞聯(lián)合鉑類二線治療肺腺癌療效的預(yù)測價值。結(jié)果顯示，在EGFR突變肺腺癌中Napsin A陽性表達率為73.4%，與文獻報道的陽性表達率（70.0%～90.0%）相近。本研究結(jié)果顯示，Napsin A陽性患者DCR 為95.7%，顯著優(yōu)于陰性患者（64.7%）。單因素和多因素分析結(jié)果顯示，Napsin A陰性是二線治療患者PFS 和OS 的獨立危險因素，提示臨床選擇Napsin A 陽性患者接受二線治療對DCR、PFS、OS 更有利，因此Napsin A 是預(yù)測培美曲塞聯(lián)合鉑類方案二線治療EGFR突變肺腺癌患者療效和預(yù)后的分子標志物。

有關(guān)Napsin A 在培美曲塞聯(lián)合鉑類治療中的作用機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，IASLC 分級為Ⅰ或Ⅱ級的肺腺癌患者肺腺癌組織中Napsin A 陽性表達率明顯高于IASLC 分級為Ⅲ級的患者，說明腫瘤分化程度越差就越容易出現(xiàn)Napsin A表達缺失，患者預(yù)后越差。研究報道，下調(diào)Napsin A可促進轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）誘導(dǎo)的肺腺癌細胞增殖[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，Napsin A 表達水平與厄洛替尼的藥物敏感性呈正相關(guān)，Napsin A 過表達可抑制TGF-β1 和integrin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和由EMT 介導(dǎo)的EGFR-TKI 耐藥，而EMT 也是培美曲塞化療的耐藥機制之一[19-21]。Napsin A 在培美曲塞聯(lián)合鉑類治療中的確切作用還需進一步探討。

本研究尚有不足之處：①病例選擇的偏倚不可避免，因為本研究是對當(dāng)時接受了EGFR檢測和培美曲塞化療患者的數(shù)據(jù)進行的回顧性分析，而不是研究期間所有患者的結(jié)果，數(shù)量偏少。②未進行TS 表達量的評估，因此無從判斷療效差異是否與各自的TS 水平差異有關(guān)。③根據(jù)現(xiàn)有資料，僅觀察了EGFR、KRAS、TP53和T790M 基因突變，無法排除其他驅(qū)動基因突變對結(jié)果的影響。下一步需進行大樣本前瞻性研究驗證結(jié)果。