當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

劉宗欣，李孟韓，萬 婷，陳興華△

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

血管性癡呆（VD）是由腦血管病變導(dǎo)致慢性腦區(qū)低灌注引起的認(rèn)知功能障礙綜合征，發(fā)病率高［1］，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。雖然控制致病性腦血管疾病危險因素、抗血小板聚集、抗凝等措施可預(yù)防VD［2］，但該病尚無獲批的特效治療藥物。VD 可由氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、突觸改變及遺傳等多種因素導(dǎo)致［3］，其發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)元的自噬、變性、凋亡、壞死、氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)，發(fā)病過程涉及磷脂酰肌醇- 3 - 激酶（PI3K）、核因子- κB（NF - κB）、細(xì)胞鐵死亡等信號通路［4-7］。有研究表明，細(xì)胞鐵死亡在認(rèn)知障礙相關(guān)疾病的發(fā)病過程中有重要作用［8］。中醫(yī)認(rèn)為，癡呆由髓減腦消、神機(jī)失用所致，其中氣血虧虛是主要病機(jī)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯是中醫(yī)經(jīng)典補(bǔ)血方劑，始載于《陳素庵婦科補(bǔ)解》。該方劑治療認(rèn)知障礙相關(guān)疾病療效明顯［9］，具有抗動脈粥樣硬化［10］、抗氧化［11］及神經(jīng)保護(hù)作用［12］，其作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激及細(xì)胞鐵死亡等相關(guān)。本研究中利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，探討了當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療VD 的作用機(jī)制，以期為VD患者的臨床用藥提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分及靶點(diǎn)獲取

以“黃芪”“當(dāng)歸”“huangqi”“danggui”為關(guān)鍵詞，檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）＞30%、藥物類藥性（DL）＞0.18 為條件篩選活性成分；通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)靶點(diǎn)，利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：// www. uniprot. org）查詢對應(yīng)基因，采用Perl 5.26.3軟件對靶點(diǎn)基因進(jìn)行注釋。

1.2 VD 靶點(diǎn)獲取

以“vascular dementia”為關(guān)鍵詞，分別檢索Gene-Cards數(shù)據(jù)庫（https：//genealacart.genecards.org）、OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org），獲取VD 靶點(diǎn)基因，建立疾病基因數(shù)據(jù)集。

1.3 成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入R 3.6.1 軟件，獲得共有靶點(diǎn)。采用Perl 軟件對成分和共有靶點(diǎn)進(jìn)行一一映射，利用Cytoscape 3.7.2 軟件對映射結(jié)果進(jìn)行拓?fù)溆嬎悖瑯?gòu)建成分- 共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件，對各成分與共有靶點(diǎn)的相互作用數(shù)量（即邊數(shù)）進(jìn)行排序，篩選邊數(shù)＞15的成分為核心成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.stringdb. org），種屬選擇“homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為中等（medium confidence，0.400），隱藏游離節(jié)點(diǎn)，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。導(dǎo)出.tsv 文件，采用R 3.6.1 軟件對節(jié)點(diǎn)、邊數(shù)、度值進(jìn)行循環(huán)計算，以各條件均大于中位值的基因?qū)?yīng)的蛋白為核心靶點(diǎn)。對核心靶點(diǎn)的度值排序，選取度值大于40 的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 富集分析

將共有靶點(diǎn)輸入R3.6.1 軟件進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。利用Bioconductor 軟件包中的“org. Hs. eg. db”“colorspace”“stringi”“ggplot2”“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”繪圖包，設(shè)置P＜0.05，分別計算富集的基因數(shù)目，選取P值排名前20的GO 功能富集分析結(jié)果繪制柱狀圖；選取排名前30 的KEGG 通路富集分析結(jié)果繪制氣泡圖。

1.6 分子對接驗證

通過RCSB 數(shù)據(jù)庫（http：// www. rcsb. org）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，采用PyMOL 2.3.0 軟件去除蛋白結(jié)晶水、原始配體；根據(jù)核心成分小分子的CAS 號，從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）中下載SDF格式的3D 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入ChemBio3D Ultra 14.0 軟件進(jìn)行能量最小化，將Minimum RMS Gradient 設(shè)置為0.001，將小分子結(jié)構(gòu)保存為.mol2格式。將處理后的關(guān)鍵靶點(diǎn)和核心成分文件分別導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6軟件處理，將結(jié)果保存為pdbqt格式。采用POCASA 1.1在線工具（http：//altair.sci.hokudai.ac.jp/g6/service/pocasa/）預(yù)測蛋白結(jié)合位點(diǎn)，采用AutoDock Vina 1.1.2 軟件進(jìn)行分子對接，采用PyMOL 2.3.0 軟件分析相互作用模式，并計算結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分與靶點(diǎn)

共獲得活性成分22個（當(dāng)歸2個，黃芪20個），詳見表1；作用靶點(diǎn)1 807 個（當(dāng)歸864 個，黃芪943 個），剔除重復(fù)后為142個。VD靶點(diǎn)3 414個。

表1 當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分Tab.1 Active ingredients of Danggui Buxue Decoction

2.2 成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

共獲得共有靶點(diǎn)81個（見圖1），成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2。共160個節(jié)點(diǎn)、354條邊。共獲得18個與VD有關(guān)的活性成分（黃芪16個、當(dāng)歸2個），7個核心成分（3，9 -二-O-美迪紫檀苷、7-O-甲基異黏菌素醇、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚及槲皮素）。

圖1 藥物-疾病靶點(diǎn)維恩圖Fig.1 Venn diagram of drug-disease targets

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)

PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖3，共38 個節(jié)點(diǎn)，203 條邊，平均度值為5.01。共獲得絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、白細(xì)胞介素4（IL - 4）、RELA 原癌基因、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM1）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）10 個核心靶點(diǎn)，經(jīng)度值篩選后，共獲得6 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，即AKT1，HMOX1，MAPK8，MAPK14，PPARγ，STAT1。

圖3 當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆共有靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of common targets of Danggui Buxue Decoction in the treatment of VD

2.4 富集分析

GO功能富集分析獲得生物過程（BP）1 404個條目，細(xì)胞組成（CC）53 個條目，分子功能（MF）130 個條目。P值排名前20 的富集條目見圖4。其中，BP 主要包括異源性刺激應(yīng)答、缺氧反應(yīng)、血管管徑調(diào)節(jié)等；CC主要包括筏膜、突觸膜及其前后膜組成部分等；MF主要包括核受體活動、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、G蛋白耦聯(lián)胺類受體的活性等。KEGG通路富集分析共富集相關(guān)通路161條，排名前30的通路見圖5。主要涉及脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路等。

圖4 GO功能富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO functional enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析結(jié)果Fig.5 Results of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 分子對接

核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接結(jié)果見表2，將每個靶蛋白與活性成分結(jié)合性最強(qiáng)的對接結(jié)果（即芒柄花素與AKT1，槲皮素與HMOX1 和STAT1，異鼠李素與MAPK8，MAPK14，PPARγ）進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖6。

a. 芒柄花素與AKT1 b. 槲皮素與HMOX1 c. 槲皮素與STAT1 d. 異鼠李素與MAPK8 e. 異鼠李素與MAPK14 f. 異鼠李素與PPARγ圖6 分子對接示意圖a.Formononetin with AKT1 b.Quercetin with HMOX1 c.Quercetin with STAT1 d.Isorhamnetin with MAPK8 e.Isorhamnetin with MAPK14 f.Isorhamnetin with PPARγFig.6 Display of molecular docking

表2 分子對接結(jié)果（kcal/mol）Tab.2 Results of molecular docking（kcal/mol）

3 討論

VD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，腦神經(jīng)元的死亡與VD 的發(fā)生密不可分。VD 患者常存在慢性腦區(qū)低灌注損傷，引起腦細(xì)胞缺氧，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時產(chǎn)生大量自由基對腦血管造成損害，故氧化應(yīng)激反應(yīng)是造成VD 發(fā)病早期神經(jīng)元死亡的重要原因［13］。鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)、脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽/ 谷胱甘肽過氧化物酶4 可能參與了VD的病理過程［14-15］。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯是傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)中的經(jīng)典名方，其組方特色為黃芪與當(dāng)歸用量比為5∶1，通過重用黃芪為君，少量當(dāng)歸活血為臣，從而達(dá)到補(bǔ)益氣血的目的。本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分中，黃芪占多數(shù)，印證了該方配伍的合理性。中藥方劑包含多種藥物成分，每種成分可作用于多個靶點(diǎn)發(fā)揮藥效。本研究結(jié)果表明，當(dāng)歸補(bǔ)血湯核心成分為7-O-甲基異黏菌素醇、毛蕊異黃酮、芒柄花素、異鼠李素、山柰酚、槲皮素。其中，3，9-二-O-美迪紫檀苷是從黃芪中分離的小分子化合物，可抑制血小板衍生生長因子BB 誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及血管平滑肌細(xì)胞增殖［16］，防止動脈粥樣硬化及斑塊形成，從而預(yù)防VD發(fā)生，并延緩其進(jìn)展；7-O-甲基異黏菌素醇有良好的OB，可能對心血管疾病、凝血障礙、帕金森病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的治療具有潛在應(yīng)用價值［17］。毛蕊異黃酮、芒柄花素及異鼠李素均被證實可通過激活Nrf2 通路或其上游靶點(diǎn)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而保護(hù)損傷后的腦細(xì)胞［18-19］；槲皮素具有免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等活性［20］，還可通過緩解腦部氧化應(yīng)激反應(yīng)改善缺血性腦卒中模型小鼠的腦功能［21］；山柰酚有助于保護(hù)大腦，預(yù)防缺血性腦卒中導(dǎo)致的腦損傷及其他慢性炎性疾?。?2］。

本研究結(jié)果提示，當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療VD 的核心靶點(diǎn)與脂質(zhì)和動脈硬化通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、AGE - RAGE 信號通路、TNF 信號通路密切相關(guān)；且VD 的發(fā)病過程與能量代謝、炎癥相關(guān)等信號通路密不可分。低密度脂蛋白可積聚在血管壁內(nèi)，并通過氧化修飾從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，是導(dǎo)致動脈粥樣硬化及相關(guān)心腦血管疾病的根本原因；流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路可通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)從而預(yù)防動脈粥樣硬化［23-24］。AGE/RAGE信號通路可提高NF-κB 的活性，從而促進(jìn)白細(xì)胞介素1、白細(xì)胞介素6、TNF-α促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)［25］。TNF信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、增殖及炎癥和免疫等生物過程，其受體可通過NF-κB和MAPK 途徑調(diào)控細(xì)胞生存及凋亡。故當(dāng)歸補(bǔ)血湯的核心靶點(diǎn)可能參與腦血管動脈粥樣硬化形成的調(diào)控通路，可能通過調(diào)控NF - κB 和Nrf2 的表達(dá)對VD 起治療作用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療VD 的核心靶點(diǎn)與異源性刺激應(yīng)答、缺氧反應(yīng)、血管管徑調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，提示當(dāng)歸補(bǔ)血湯可能通過參與細(xì)胞缺氧反應(yīng)、血管調(diào)節(jié)等過程發(fā)揮治療VD的作用。

本研究結(jié)果顯示，芒柄花素與AKT1，槲皮素與HMOX1 和STAT1，異鼠李素與MAPK8，MAPK14，PPARγ 均有較好的對接效果。AKT1 基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶依賴的機(jī)制被胞外信號激活，是PI3K/ AKT 信號通路的核心因子。YI等［26］的研究表明，PI3K-AKT-mTOR 通路的持續(xù)激活可抑制鐵死亡。芒柄花素與AKT1 結(jié)合良好，SUGIMOTO 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，芒柄花素可通過激活PI3K/Akt-Nrf2信號增強(qiáng)抗氧化基因表達(dá)，降低活性氧水平，從而實現(xiàn)對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 的神經(jīng)保護(hù)，故推測芒柄花素可能通過與AKT1 靶點(diǎn)結(jié)合從而發(fā)揮激活相關(guān)通路的作用。

STAT1 具有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用［28］。研究證明，Nrf2 可通過JAK/ STAT 等潛在信號通路被激活［29］。HMOX1 基因是鐵死亡過程中的重要靶點(diǎn)基因，其編碼的蛋白是鐵死亡過程中鐵依賴性脂質(zhì)過氧化的必需酶。YANG 等［30］通過腫瘤相關(guān)實驗表明，Nrf2/HMOX1 信號軸的激活可抑制細(xì)胞鐵死亡過程。TIAN等［31］的實驗證明，槲皮素能通過激活Nrf2 信號通路上調(diào)HMOX1 的表達(dá)，以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。LUO 等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過HMOX1 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中以還原型輔酶Ⅱ為來源的超氧陰離子的產(chǎn)生，且該過程與Nrf2 的核內(nèi)積累和其負(fù)調(diào)控因子KEAP1 的下調(diào)有關(guān)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯能增加細(xì)胞的能量代謝，鐵是血紅蛋白攜氧必不可少的因素，其代謝過程發(fā)生異常會導(dǎo)致貧血。故槲皮素可能通過調(diào)控HMOX1 及STAT1靶點(diǎn)基因從而激活Nrf2通路，可能與細(xì)胞鐵死亡過程被抑制有關(guān)。

PPARγ 是一類由配體調(diào)節(jié)的核激素受體，主要負(fù)責(zé)脂類的分解代謝等［33］。MA 等［34］證明，藥物可通過調(diào)節(jié)腎炎模型小鼠Nrf2及PPARγ途徑發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。MAPK8 與MAPK14 同為絲裂原活化蛋白激酶，是MAPK 通路的核心因子。MAPK 是細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者，可被氧化應(yīng)激反應(yīng)及多種促炎因子激活，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)過程，對Nrf2/HMOX1通路具有激活和調(diào)節(jié)作用［35］。LI 等［36］通過細(xì)胞實驗證明，藥物可通過靶向MAPK -Nrf2/ARE 信號通路，從而保護(hù)黑色素細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。但MULATI 等［37］通過動物實驗證明，異鼠李素通過抑制MAPK 信號通路改善了高脂肪和高果糖飲食模型小鼠的認(rèn)知障礙，提示MAPK通路在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激過程中可能發(fā)揮雙向作用。WU 等［38］的研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素可通過Nrf2/ HMOX1 信號通路緩解高糖缺氧HT22 海馬神經(jīng)元的炎性反應(yīng)。根據(jù)分子對接結(jié)果，推測異鼠李素可能通過MAPK 與PPARγ 共同調(diào)節(jié)Nrf2 信號通路，從而緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，當(dāng)歸補(bǔ)血湯活性成分可能作用于多個VD 靶點(diǎn)相關(guān)通路，調(diào)控氧化應(yīng)激損傷機(jī)制或鐵死亡各個環(huán)節(jié)，從而緩解或逆轉(zhuǎn)受損細(xì)胞的氧化應(yīng)激過程。