循環(huán)腫瘤細胞與三陰性乳腺癌預后及腫瘤狀態(tài)的關系分析

王 浩, 李南林, 曹海玲

(廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院, 1. 病理科, 3. 甲狀腺乳腺外科, 廣東 廣州, 510000;2. 中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院 甲乳外科, 陜西 西安, 710032)

乳腺癌(BC)是女性最常見的一種惡性腫瘤,且發(fā)病率呈逐年升高趨勢[1]。BC包括不同的亞型,通常根據(jù)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)以及人表皮生長因子受體2(HER2)的狀態(tài)進行分類[2]。ER、PR、HER2均陰性表達的三陰性乳腺癌(TNBC), 由于具有疾病侵襲性高等特點且缺乏特異性治療靶點,目前治療難度較大[3]。原發(fā)性腫瘤樣本可反映特定腫瘤類型的相關特征,也可明確最具侵襲性腫瘤細胞的分子復雜性?；谘h(huán)腫瘤細胞(CTC)的研究可提供疾病的全面信息及不同位置腫瘤的特征,幫助識別新的生物標志物和治療靶點,進而改善癌癥患者預后[4]。不同階段TNBC患者的外周血中均存在CTC[5], CTC簇在TNBC患者中常見且與不良預后相關[6]。除了CTC對TNBC患者的預后價值之外, CTC的表型和分子特征還可以用于實時液體活檢。AGELAKI S等[7]發(fā)現(xiàn),早期TNBC患者CTC表型具有異質(zhì)性,而HER2陽性(HER2+)在疾病演變過程中一直存在。CTC在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生變化,這些變化主要與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程、上皮標記物表達減少和可塑性、侵襲性增加有關,可使腫瘤細胞更能抵抗細胞衰老和死亡,從而影響腫瘤的治療和預后[8]。本研究從32例Ⅲ～Ⅳ期TNBC患者外周血中分離出CTC, 用與癌癥侵襲性和細胞可塑性相關的基因進行表征,以期確定新的生物標志物和治療靶點,為TNBC患者的治療方案制訂和預后監(jiān)測提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院2014—2017年收治的32例TNBC患者作為研究對象。納入標準: ① 病理診斷符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)》中的TNBC診斷標準者; ② 首次發(fā)病或復發(fā)者; ③ 血細胞計數(shù)、肝腎功能和血脂指標等正常者; ④ 同意參與研究并簽署知情同意書者。排除標準: ① 乳腺急性炎癥期患者; ② 存在精神疾病或認知功能障礙者; ③ 合并其他惡性腫瘤者; ④ 哺乳期或妊娠期婦女。另選取30名匹配的健康人員作為對照,年齡42～78歲,平均56.1歲。本研究經(jīng)廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準,所有受試者簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CTC檢測和分析: 分別采集所有患者和健康人員的外周血各2管(3.2 mL/管)。第1管外周血樣先于室溫條件下以1 900轉(zhuǎn)/min離心5 min棄上層血漿,再用氯化銨裂解紅細胞后以1 900轉(zhuǎn)/min離心5 min去除紅細胞碎片,加入磁珠孵育后去除白細胞,將剩余細胞懸液濃縮涂片。干燥后,使用抗人CD45和針對7號染色體著絲粒、8號染色體著絲粒的探針通過CD45免疫染色和熒光原位雜交(FISH)技術檢測CTC。CD45陰性, 7號染色體著絲?；?號染色體著絲粒中任意1個陽性, 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚陽性,則該樣品被判定為CTC。第2管外周血樣用于分離上皮細胞黏附分子(EpCAM)陽性CTC, 將全血樣品于室溫下以 600 ×g離心10 min, 去除血漿,將細胞部分與涂有抗EpCAM 抗體(克隆 Ber-EP4)的動態(tài)珠孵育并分離,產(chǎn)生磁場。富集步驟后,將與磁珠偶聯(lián)的CTC重懸于100 μL RNAlater中,并儲存于-80 ℃環(huán)境直至RNA提取。本研究將每3.2 mL血液中含5個CTC作為CTC陽性閾值,使用Cyttel方法識別和計數(shù)CTC, 該方法結(jié)合了陰性富集、CD45免疫染色和FISH技術(預實驗中已確認技術細節(jié),包括方法的準確性、線性和重現(xiàn)性)。CTC檢測使用Cyttel CTC檢測試劑盒和Cyttel CTC檢測系統(tǒng),均由萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司(萊爾生物)生產(chǎn)。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測基因表達: ① 使用 Qiagen QIAmp病毒RNA提取試劑盒提取CTC樣本的RNA, 使用Takara SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 使用TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒進行RT-qPCR檢測。將CD45作為內(nèi)參基因,采用2-△△ct法進行相對定量分析。② 使用miRNeasy FFPE提取試劑盒和脫蠟溶液從所有福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPE)切片樣品(3個10 μm切片)中提取 RNA,使用Takara SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA, 使用TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒進行實時定量PCR檢測。將GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-△△ct法進行相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 TNBC患者一般資料和臨床病理特征分析

32例TNBC患者年齡33～80歲,平均58.5歲; 腫瘤分期為Ⅲ期9例,Ⅳ期23例; 樣本狀態(tài)為初診24例,復診8例; 腫瘤轉(zhuǎn)移21例,其中17例為內(nèi)臟轉(zhuǎn)移,4例同時有內(nèi)臟轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移; 腫瘤病理類型為導管原位癌29例、浸潤性小葉癌1例、化生性乳腺癌2例,組織學分級為3級22例、2級10例; 有手術史者23例,未接受過任何抗腫瘤治療者5例; Ki67表達水平低4例、高27例,表達陰性1例; 疾病進展期20例,無進展生存期(PFS)為0.5～45.2個月,平均12.4個月; 生存狀態(tài)為生存15例、死亡17例,總生存期(OS)為0.5～45.2個月,平均18.4個月。

2.2 TNBC患者CTC計數(shù)及其與預后的關系

采用Cyttel技術檢測31例患者(另1例患者因出現(xiàn)假陰性情況被剔除)外周血中CTC水平,其中8例檢出≥5個CTC, 3例檢出CTC簇。本研究未發(fā)現(xiàn)CTC計數(shù)與其他臨床病理特征存在相關性。與3.2 mL血樣中CTC計數(shù)<5個的23例患者相比, CTC計數(shù)≥5個的8例患者PFS、OS均更差,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.033、0.006), 表明CTC計數(shù)對TNBC患者預后具有評估價值; 3.2 mL血樣中CTC計數(shù)≥5個的患者中, CTC簇的存在與患者較差的OS有關(P=0.001)。見表1。

表1 31例TNBC患者CTC水平與預后情況

高水平VIM不僅與高水平的EMT啟動子(如TIMP1或SNAIL1)和干細胞標記物(如CD44、ALDH2和CD49F)相關,還與EPCAM、CDH1基因相關。受試者工作特征(ROC)曲線分析結(jié)果顯示,這些基因的曲線下面積(AUC)均>0.66, 且P<0.05, 可區(qū)分患者與健康對照者,證實其對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移具有診斷價值,見表2。

表2 CTC標記物的診斷價值

2.3 TNBC患者CTC具有細胞高可塑性的特征

為了利用Cyttel系統(tǒng)對CTC計數(shù)進行補充,本研究于EpCAM陽性CTC免疫分離后通過RT-qPCR法對患者隊列中的CTC群體進行表征,將30名健康對照者的外周血樣本作為所選基因的非CTC相關表達的參考對照。將GAPDH和CD45作為內(nèi)參基因進行表達譜分析,包括與EMT、干性表型和BC侵襲性相關的基因。分析所有樣本后,本研究發(fā)現(xiàn)CTC群體的特點是表達上皮標志物(CDH1、EPCAM), 與分離方法一致; 此外,這些細胞還不同程度表達與間充質(zhì)和更多惡性特征相關的基因(如VIM、SNAIL1、TIMP1和CRIPTO1等)以及干性標記物(如CD49F、ALDH2、CD44和BCL11A等),見圖1。

A: 上皮相關基因(CDH1、EPCAM); B: 間充質(zhì)相關基因(VIM、SNAIL1、TIMP1、CRIPTO1、ZEB1、ZEB2、LOXL2); C: 干細胞特征基因(CD49F、ALDH2、CD44、BCL11A、ALDH1和CD133); D: AR、ANXA2基因。灰色圓點代表健康對照者(n=30)基因表達水平,黑色圓點代表TNBC患者(n=32)基因表達水平。圖1 TNBC患者CTC和健康對照者CTC的基因表達譜比較

2.4 CTC表達特征對患者預后的預測價值

以百分位數(shù)70作為臨界值,將基因表達水平分為高水平和低水平。高水平CD49F與轉(zhuǎn)移腫瘤細胞存在相關性(P=0.024), 而非轉(zhuǎn)移腫瘤細胞顯示低水平AR(P=0.035)和TIMP1(P=0.014)。為了確定TNBC患者CTC標志物的預后價值,本研究進行Kaplan-Meier生存分析,結(jié)果顯示,高水平的CD49F、ALDH2、CD44、GAPDH、TIMP1均與患者較短的OS顯著相關(P<0.05), 高水平的CD49F、GAPDH、TIMP1均與患者較短的PFS顯著相關(P<0.05), 見表3。Cox回歸分析顯示,CD49F、TIMP1、GAPDH、ALDH2、CD44高水平患者的死亡風險顯著增加,分別是低表達水平患者的5.12、5.12、5.18、3.12、3.70倍;CD49F、TIMP1、GAPDH高水平患者的復發(fā)風險也顯著增加,分別是低水平患者的3.33、3.86、3.56倍,見表3。

表3 CTC標志物的單變量Cox回歸分析

本研究對所有差異表達的標記物進行二元Logistic回歸和ROC曲線分析。分析結(jié)果顯示,TIMP1、SNAIL1、BCL11A三者聯(lián)合是檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的最佳組合(AUC為0.861,P<0.001)。模型方程為Ln(odds) =2.02+0.31×TIMP1表達+0.05×SNAIL表達+0.55×BCL11A表達?；谶@個模型,本研究能夠以0.756的截斷值和100%的特異度,識別出60%的患者存在轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞。

本研究進一步分析CTC標志物表達水平和CTC細胞計數(shù)后發(fā)現(xiàn), CTC計數(shù)≥5個的患者具有更高水平的CDH1、EPCAM、TIMP1(P=0.018、0.008、0.025), 表明Cyttel系統(tǒng)識別的CTC表達這3種標志物。為了確定標志物在腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中的作用,本研究分析了19例患者在診斷或手術時獲得的原發(fā)腫瘤、轉(zhuǎn)移組織和健康組織樣本,并在原發(fā)腫瘤和非腫瘤組織的轉(zhuǎn)移灶中發(fā)現(xiàn)EPCAM、SNAIL1、CD44、CDH1、TIMP1和BCL11A表達水平顯著增高,說明其可能在腫瘤形成和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

3 討 論

近年來,研究[9-10]證明CTC與不同類型腫瘤的預后有關。CTC具有特殊的分子特征,是轉(zhuǎn)移病灶形成的關鍵,而TNBC是最具侵襲性的BC亞型,具有高轉(zhuǎn)移率和缺乏有效治療靶點等特點[11]。因此,對TNBC患者CTC進一步研究,或可為改善預后和明確診斷提供有用信息。

本研究基于Cyttel系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)患者CTC陽性檢出率為25.8%(8/31), 這些患者均已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。ZHANG Y W等[12]使用Cyttel技術分析286例Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期TNBC患者手術前后的CTC水平,發(fā)現(xiàn)各期的平均CTC含量分別為23%、37%和 56%。MAGBANUA M J等[13]基于Cyttel系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)102例Ⅳ期TNBC患者開始化療前的CTCs檢出率(CTCs ≥5個)為 44%, 而開始治療后15 d時則降至33%。由此表明,目前的技術還不能充分有效地檢測CTC。為了更好地探索CTC在TNBC中的潛在價值,本研究應用不同于既往研究[14]的方法深入探討CTC的分子特征。

CDH1、EPCAM在從TNBC患者樣本中分離出的CTC中高表達,說明腫瘤細胞起源于上皮細胞。上皮蛋白的活性在腫瘤細胞定植的最后階段尤為重要,此時腫瘤細胞必須增殖,以重建新的腫瘤病灶[15]。TNBC患者CTC中VIM、SNAIL1、TIMP1、CRIPTO1、CD49F、ALDH2、CD44和BCL11A等基因表達,表明存在間充質(zhì)干細胞標記物,可能有助于腫瘤細胞在血液中的存活。研究[16-17]表明,從上皮到間充質(zhì)特征的轉(zhuǎn)變會誘導上皮起源的腫瘤細胞出現(xiàn)干細胞特性,這些中間表型與侵襲性有關。有研究[18]對CTC群體進行表征,發(fā)現(xiàn)這些中間表型的出現(xiàn)對腫瘤細胞的存活和定植有顯著影響,與本研究結(jié)果一致。在滲入和遷移到血液的過程中,細胞可塑性使得CTC能夠克服缺氧環(huán)境,避免凋亡和被免疫細胞識別,在極端惡劣的環(huán)境下生存[19]。本研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者CTC中,TIMP1、AR和CD49F表達水平更高,這可能與CTC數(shù)量增加有關,且這些基因表達水平增高可能與疾病進展有關。本研究結(jié)果顯示,表型可塑性更強的EpCAM陽性CTC與腫瘤惡性進展有關,這可為癌癥患者提供有效的預后信息。

綜上所述, CTC計數(shù)及分子特征是獲取疾病相關信息的有效途徑,可為建立新的TNBC診斷、監(jiān)測、預后評估方法提供參考依據(jù),這種基于CTC液體活檢的方法有可能成為探索TNBC擴散機制的重要工具。此外,本研究在TNBC患者CTC中發(fā)現(xiàn)了細胞可塑性,這可能與腫瘤的不良預后和高侵襲性有關。