Combretastatin A-4衍生物的設(shè)計、合成及抗乳腺腫瘤活性初探

高祎婷, 丁茂鵬, 馬 騰, 周昊天, 劉曉航, 孫曉飛, 馬 成

(1.新疆第二醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,新疆 克拉瑪依 834000; 2. 新疆第二醫(yī)學(xué)院 體育教學(xué)部,新疆 克拉瑪依 834000; 3.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830000)

Combretastatin A-4(CA-4)從南非灌木Combretumcaffrum的樹干中分離得到,其結(jié)構(gòu)與秋水仙堿類似,是目前已知微管蛋白秋水仙堿結(jié)合位點抑制劑(Colchicine binding site inhibitors, CBSI)中活性最強的化合物之一(圖1)[1-2]。CA-4水溶性差,且容易形成熱力學(xué)上更穩(wěn)定但活性更弱的反式CA-4異構(gòu)體,使其難以進一步得到應(yīng)用[3]。因此,對CA-4進行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾、生物活性研究以及構(gòu)效關(guān)系分析成為抗腫瘤新藥研究的熱點。

通過查閱活性結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物相關(guān)的文獻,總結(jié)得到化合物CA-4的構(gòu)效關(guān)系(圖2)。李春葆等[4]在制備考布他丁A-4霧化劑時,發(fā)現(xiàn)CA-4結(jié)構(gòu)中A環(huán)上的3個甲氧基是必要的活性基團,對其修飾會降低CA-4活性;連接A、 B環(huán)的雙鍵必須為順式[5],但是A、 B環(huán)之間的雙鍵可以用雜環(huán)如噻唑、噻二唑、苯并呋喃和二氧戊環(huán)等替代[6-9],也可以用鏈狀結(jié)構(gòu)如羰基等替代[10-11]。LEE[12]發(fā)現(xiàn)一種具有二苯甲酮結(jié)構(gòu)的微管蛋白聚合抑制劑,羰基的加入增加了整個分子活性,藥效更強,目前處于Ⅱ期臨床試驗;苯并[b]呋喃環(huán)取代CA-4 B環(huán)的BNC105P可以改善藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì)[13],提高藥物的生物活性,因而可用于治療晚期惡性胸膜間皮瘤,目前已進入Ⅱ期臨床試驗階段。同時B環(huán)上C-4位甲氧基是活性必需基團,而C-3位羥基則相對靈活可被修飾[14]。馬中林等[15]研究發(fā)現(xiàn),在B環(huán)引入氫鍵受體基團如F原子可增強結(jié)構(gòu)活性。鹵素的電負性可增強分子生物活性,促進跨膜轉(zhuǎn)運并提高生物利用度?，F(xiàn)今在先導(dǎo)化合物中引入鹵素已經(jīng)成為一種主要的結(jié)構(gòu)修飾方法。

圖2 CA-4的構(gòu)效關(guān)系

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是一組質(zhì)膜相關(guān)的脂質(zhì)激酶,由3個亞基組成,包括p85調(diào)節(jié)亞基、p55調(diào)節(jié)亞基和p110催化亞基。根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同,PI3K分為3類:I類,II類和III類,其中I類PI3K與腫瘤細胞生長關(guān)系最為密切,具有PI3Kα、 PI3Kβ、 PI3Kδ和PI3Kγ4種關(guān)鍵亞型[16]。 PI3Kα是PI3K家族中作為癌癥治療的主要靶點,其高表達與結(jié)腸癌[17]、乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、胃癌[20]、直腸癌[21]和卵巢癌[22]等癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。2019年,Alpelisib為FDA批準(zhǔn)的第1個PI3Kα抑制劑,具有羰基、氟原子等活性基團,用于乳腺癌治療,但該藥物卻有嚴重的濃度依賴性副作用和耐藥性[23]。 BKM120作為一種泛PI3K抑制劑,對腫瘤細胞的抗增殖活性并不是通過抑制PI3K的4種亞型,而是由微管依賴性細胞毒性所致[24]。此外,將BKM120的嘧啶骨架替換為吡啶或三嗪骨架,可分別獲得微管去穩(wěn)定劑和PI3K抑制劑[25]。

本研究結(jié)合CA-4構(gòu)效關(guān)系和Alpelisib的基團結(jié)構(gòu),利用基于受體的藥物設(shè)計方法(Structure-base drug design, SBDD)對CA-4進行結(jié)構(gòu)改造(圖3),即保留A環(huán)和A環(huán)上的3個甲氧基,以羰基取代連接雙鍵碳以保證順式構(gòu)型,苯并呋喃環(huán)取代B環(huán),B環(huán)側(cè)鏈引入烯苯鹵素增效,從而緩解分子疏水性。依據(jù)結(jié)合活性自由能打分值篩選出9種活性高的衍生物,并進行衍生物與雙靶點蛋白對接分析及可視化分析,最后經(jīng)4步合成法化學(xué)合成目標(biāo)化合物(圖4),以期得到能夠同時靶向微管蛋白和PI3K的雙重抑制小分子化合物。

圖3 CA-4衍生物的設(shè)計思路

圖4 CA-4衍生物的合成路線

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RY-2型顯微熔點儀;WFH-203B型三用紫外分析儀;Unity-Inova 600型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內(nèi)標(biāo));Thermo Finnigan LCQ Advantage MAX型質(zhì)譜儀;MYP19150型電動攪拌器;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;AD340型酶標(biāo)儀;CW-2000型超聲儀;Pymol軟件(Delano Scientific LLC); Auto Dock Tools 1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)。

3,4,5-三甲氧基苯乙酮、2-氟苯乙烯、3-氟苯乙烯、3,5-二氟苯乙烯、丙烯酸乙酯、雙(三苯基磷)二氯化鈀(Ⅱ)、N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、氫氧化鈉、N-碘代琥珀酰亞胺(NIS)、氯化鈉、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、無水乙醇、甲醇、乙腈、三乙胺、茴香醛、鹽酸、無水硫酸鎂、無水碳酸鉀、無水碳酸鈉均為分析純。細胞株MCF-7和MDA-MB-231由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院申春燕課題組惠贈。

1.2 計算機輔助藥物設(shè)計

本課題采用SBDD法[26-28],以微管蛋白和PI3K為結(jié)合受體,以CA-4和Alpelisib(BYL-719,已上市的PI3K抑制劑,圖3)化學(xué)結(jié)構(gòu)為參考,對結(jié)構(gòu)修飾后的64種化合物進行分子對接。通過比較其結(jié)合自由能篩選出9種優(yōu)勢化合物并進行對接分析及可視化分析。

(1) 蛋白質(zhì)受體準(zhǔn)備

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protenin Data Bank, PDB.http://www.rcsb.org/)下載用于分子對接的受體蛋白:PI3Kα(PDB編號:4waf),分辨率為0.239 nm;微管蛋白(PDB編號:1sa0),分辨率為0.358 nm。使用軟件PyMol(http://www.pymo l.org/)對4waf進行處理,去除里面包含的小分子配體。同時對1sa0處理,選取A鏈和B鏈2個微管蛋白結(jié)構(gòu)單元,分離其中包含的秋水仙堿(CN2)配體。分離、去除配體后,使用AutoDockTools.1.5.6(http://mgltools.scripps.edu/)對受體進行刪去結(jié)晶水,加入Gasteiger電荷和添加極性氫等操作后,生成對應(yīng)的4waf.pdbqt和1sa0.pdbqt文件。

(2) 配體結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

將上述設(shè)計的60種分子、CA-4和Alpelisib使用ChemDraw 20.0以及Chem3D 20.0軟件畫出其3D結(jié)構(gòu)并將其以.mol2的文件形式導(dǎo)出為1.mol2、 2.mol2···79.mol2、 CA-4.mol2和Alpelisib.mol2。再使用AutoDock Tools.1.5.6對配體進行去水、加全氫、加入Gasteiger電荷和合并非極性氫等處理,并檢查其扭轉(zhuǎn)鍵和旋轉(zhuǎn)中心后輸出為.pdbqt的文件以用于對接。

(3) 分子對接

利用AutoDockTools.1.5.6半柔性對接上述制作的配體和受體,設(shè)置算法為遺傳算法(Genetic Algorithm),對接次數(shù)設(shè)置為50次,最大迭代次數(shù)設(shè)置為2.5×106,種群數(shù)目設(shè)置為150,其余數(shù)值均采用系統(tǒng)默認數(shù)值,通過將每個分子配體都與受體蛋白4waf和1sa0對接后得到結(jié)合自由能數(shù)據(jù)[29-30]。

1.3 合成

(1) 中間體化合物2-溴-1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙酮(a)的合成

將3,4,5-三甲氧基苯基乙酮3.15 g(15.00 mmol)與無水乙醇30 mL加入三頸燒瓶中,使其溶解完全。將NBS(5.34 g, 30.00 mmol)溶解于裝有80 mL無水乙醇的錐形瓶。將NBS的無水乙醇溶液緩慢滴加至三頸燒瓶中(30 min內(nèi)加完),水浴45 ℃條件下進行反應(yīng),同時進行TCL監(jiān)測,直到原料藥點消失后方可停止反應(yīng),反應(yīng)液濃縮后用飽和NaCl溶液洗滌,抽濾得到濾餅,然后用硅膠柱層析分離得到中間體化合物a,白色粉末,產(chǎn)率80.7%, m.p.64.5～65.5 ℃;1H NMRδ: 7.25(s, 1H, Ar—H), 7.27(s, 1H, Ar—H), 4.68(s, 2H, —COCH2Br), 3.94(s, 9H, —OCH3)。

(2) 中間體化合物2-羥基-5-碘-4-甲氧基苯甲醛(b)的合成

向乙腈(3 mL)中加入2-羥基-4-甲氧基苯甲醛152.00 mg(1.00 mmol),再加入p-TosOH 95.00 mg(0.50 mmol)。攪拌溶液15 min后,加入N-碘代琥珀酰亞胺225.00 mg(1.00 mmol)。室溫下攪拌過夜,然后將所有的揮發(fā)物真空除去。柱層析后得到中間體化合物b,黃色粉末,產(chǎn)率70.6%, m.p.127～130 ℃;1H NMRδ: 11.45(s, 1 H, —OH), 9.68(s, 1H, —CHO), 7.88(s, 1H, Ar—H), 6.43(s, 1H, Ar—H), 3.94(s, 3H, —OCH3)。

(3) 中間體化合物(5-碘-6-甲氧基-苯并呋喃-2-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮(c)的合成

將化合物a1.44 g(5.00 mmol)、化合物b1.43 g(5.00 mmol)和K2CO31.38 g(10.00 mmol)置于三頸燒瓶中,使用30 mL丙酮溶解,TCL監(jiān)測,在70 ℃下加熱回流攪拌,直至原料點消失后停止反應(yīng),旋干部分丙酮后,加入少量蒸餾水,并用CH2Cl2(3×15 mL)萃取后合并有機相,有機相用飽和NaCl溶液洗滌3次,加入少量無水硫酸鎂使其干燥,減壓蒸餾得到粗產(chǎn)物,經(jīng)過重結(jié)晶(V乙醇∶V乙腈=10 ∶1)得到中間體化合物c,棕黃色粉末,產(chǎn)率75.5%, m.p.143～144 ℃;1H NMRδ: 8.14(s, 1H, Ar—H), 7.41(s, 2H, Ar—H), 7.08(s, 1H, C=C—H), 3.95(s, 3H, —OCH3), 3.93(s, 6H, 2—OCH3), 3.82(s, 3H, —OCH3)。

(4) 目標(biāo)化合物的合成

室溫條件下,將化合物c0.47 g(1.00 mmol)溶解在裝有DMF 3 mL的三頸燒瓶后依次加入Et3N 0.30 g(3.00 mmol), PdCl2(PPh3)20.06 g(0.08 mmol)。在電動攪拌下緩慢加入鹵代苯乙烯(4.00 mmol),滴加完畢后加熱到60 ℃,加熱回流,TCL監(jiān)控,反應(yīng)約24 h后待原料點消失,反應(yīng)結(jié)束。冷卻至室溫并加入10 mL乙酸乙酯攪拌2 h,用飽和NaCl溶液洗滌3次,收集有機相并用無水硫酸鎂干燥,濃縮后得粗產(chǎn)物,再利用無水乙醇重結(jié)晶后得到目標(biāo)化合物[31-33],目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)通式見圖5。

圖5 目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目標(biāo)化合物1: (E)-1-(2-氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率40.6%, m.p.173～174 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.93(s, 1H, H-4), 7.5(s, 1H, H-7), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.59(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.23(d, 1H,J=25.5 Hz, H-13), 7.08(dt, 1H,J=1.8 Hz, 9.6 Hz, H-14), 7.16(dt, 1H,J=1.8 Hz, 9.6 Hz, H-15), 7.66(d, 1H,J=10.5 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.3(C-3a), 125.4(C-4), 120.2(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.7(C-8), 125.3(C-9), 125.6(C-10), 121.6(C-11), 161.1(C-12,JCF=234.0 Hz), 115.9(C-13), 128.5(C-14), 124.2(C-15), 127.0(C-16), 132.6(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 463.1479{[M+H]+}, found 463.1551。

目標(biāo)化合物2: (E)-1-(2-氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率58.4%, m.p.165.3～166 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.94(s, 1H, H-4), 7.5(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.54(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.38(dd, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-13), 7.28(t, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-14), 7.20(t, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-15), 7.75(dd, 1H,J=9.0 Hz, 1.8 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.4(C-3a), 125.2(C-4), 120.3(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.4(C-9), 125.7(C-10), 133.4(C-11), 135.7(C-12), 129.8(C-13), 128.5(C-14), 126.6(C-15), 126.9(C-16), 132.5(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 479.1183{[M+H]+}, found 479.1258。

目標(biāo)化合物3: (E)-1-(2-溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率41.1%, m.p.166.2～168 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 8.08(s, 1H, H-4), 7.51(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.45(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.28(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.66(dd, 1H,J=9.0 Hz, 2.4 Hz, H-13), 7.43(dt, 1H,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, H-14), 7.24(dt, 1H,J=2.4 Hz, 9.0 Hz, H-15), 7.84(dd, 1H,J=9.0 Hz, 2.4 Hz, H-16), 3.79(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.99(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 156.5(C-2), 117.7(C-3), 120.2(C-3a), 123.2(C-4), 119.6(C-5), 152.7(C-6), 95.7(C-7), 158.9(C-7a), 181.2(C-8), 127.0(C-9), 127.3(C-10), 137.1(C-11), 135.7(C-12), 133.4(C-13), 127.0(C-14), 127.4(C-15), 127.3(C-16), 132.6(C-1′), 106.6(C-2′, 6′), 152.7(C-3′, 5′), 142.5(C-4′), 56.1(—2OCH3), 60.1(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 525.0678{[M+H]+}, found 525.0750。

目標(biāo)化合物4: (E)-1-(3-氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率50.3%, m.p.178～179 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.89(s, 1H, H-4), 7.33(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.50(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.06(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.33(d, 1H,J=3.0 Hz, H-12), 6.96(m, 1H, H-14), 7.28(t, 1H,J=10.5 Hz, H-15), 7.49(d, 1H,J=1.8 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.3(C-2), 116.8(C-3), 120.1(C-3a), 122.6(C-4), 120.2(C-5), 152.1(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 124.6(C-9), 125.0(C-10), 140.1(C-11), 112.7(C-12), 164.2(C-13,JCF=294.0 Hz), 114.4(C-14), 130.1(C-15), 128.3(C-16), 132.5(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 463.1479{[M+H]+}, found 463.1553。

目標(biāo)化合物6: (E)-1-(3-氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率60.7%, m.p.155～157 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.88(s, 1H, H-4), 7.33(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.53(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.06(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.50(d, 1H,J=1.8 Hz, H-12), 7.22(d, 1H,J=9.6 Hz, H-14), 7.29(d, 1H,J=9.6 Hz, H-15), 7.40(d, 1H,J=9.6 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.9(C-3), 120.4(C-3a), 125.2(C-4), 120.3(C-5), 152.0(C-6), 94.3(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.7(C-9), 126.9(C-10), 135.7(C-11), 126.6(C-12), 133.4(C-13), 128.5(C-14), 129.8(C-15), 125.4(C-16), 132.5(C-1′), 107.0(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.0(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 479.1183{[M+H]+}, found 479.1257。

目標(biāo)化合物11: (E)-1-(3-溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率46.2%, m.p.172.5～174 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.88(s, 1H, H-4), 7.50(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.52(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.02(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.70(d, 1H,J=2.4 Hz, H-12), 7.38(d, 1H,J=9.6 Hz, H-14), 7.23(t, 1H,J=9.6 Hz, H-15), 7.45(d, 1H,J=9.6 Hz, H-16), 3.98(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.4(C-2), 116.8(C-3), 120.2(C-3a), 124.8(C-4), 120.1(C-5), 152.1(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 125.0(C-9), 125.3(C-10), 139.9(C-11), 130.2(C-12), 122.9(C-13), 130.4(C-14), 129.3(C-15), 127.9(C-16), 132.5(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.0(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 545.0576{[M+Na]+}, found 545.0606。

目標(biāo)化合物12: (E)-1-(3,4-二氯苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率48.5%, m.p.168.2～169 ℃;1H NMRδ: 7.85(s, 1H, H-7), 8.06(s, 1H, H-4), 7.49(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.57(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.24(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.86(d, 1H,J=1.8 Hz, H-12), 7.62(d, 1H,J=10.2 Hz, H-15), 7.61(dd, 1H,J=10.2 Hz, 1.8 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.80(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.5(C-2), 116.7(C-3), 120.4(C-3a), 124.4(C-4), 120.3(C-5), 152.2(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 126.2(C-9), 126.7(C-10), 140.8(C-11), 127.2(C-12), 124.8(C-13), 135.2(C-14), 124.8(C-15), 127.2(C-16), 132.4(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 513.0793{[M+H]+}, found 513.0869。

目標(biāo)化合物18: (E)-1-(3,5-二氟苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率52.9%, m.p.194～196 ℃;1H NMRδ: 7.50(s, 1H, H-7), 8.05(s, 1H, H-4), 7.85(s, 1H, H-3), 7.29(s, 2H, H-2′,6′), 7.57(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 7.25(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.35(s, 1H, H-12), 7.12(s, 1H, H-14), 7.35(s, 1H, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.90(s, 6H, —OCH3), 3.80(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.0(C-2), 117.9(C-3), 121.3(C-3a), 123.7(C-4), 120.1(C-5), 151.3(C-6), 95.1(C-7), 158.8(C-7a), 181.7(C-8), 126.3(C-9), 127.2(C-10), 141.4(C-11), 109.4(C-12), 161.9(C-13,JCF=245.0 Hz), 102.1(C-14), 161.9(C-15,JCF=240.0 Hz), 109.4(C-16), 132.1(C-1′), 106.7(C-2′, 6′), 152.8(C-3′, 5′), 141.6(C-4′), 56.1(—2OCH3), 60.2(—OCH3), 56.4(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 481.1384{[M+H]+}, found 481.1459。

目標(biāo)化合物20: (E)-1-(3,5-二溴苯基)-2-(6-甲氧基-2-(1-(3,4,5-三甲氧基苯基)乙烯基)苯并呋喃-5-基)乙烯,黃色粉末,產(chǎn)率53.8%, m.p.177.5～179 ℃;1H NMRδ: 7.11(s, 1H, H-7), 7.86(s, 1H, H-4), 7.50(s, 1H, H-3), 7.31(s, 2H, H-2′,6′), 7.53(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-9), 6.99(d,J=19.8 Hz, 1H, C=C—H, H-10), 7.40(d, 1H,J=2.4 Hz, H-12), 7.24(d, 1H,J=1.8 Hz, H-14), 7.40(d, 1H,J=2.4 Hz, H-16), 3.99(s, 3H, —OCH3), 3.96(s, 6H, —OCH3), 3.97(s, 3H, —OCH3);13C NMRδ: 157.5(C-2), 116.7(C-3), 120.4(C-3a), 124.4(C-4), 120.3(C-5), 152.2(C-6), 94.4(C-7), 158.9(C-7a), 182.6(C-8), 126.2(C-9), 126.7(C-10), 140.8(C-11), 127.2(C-12, 16), 124.8(C-13), 135.2(C-14), 124.8(C-15), 132.4(C-1′), 107.1(C-2′, 6′), 153.1(C-3′, 5′), 142.4(C-4′), 56.4(—2OCH3), 61.1(—OCH3), 56.1(—OCH3); MS(ESI)m/z: calculated for 600.9783{[M+H]+}, found 600.9858。

1.4 活性測試

分別將MCF-7和MDA-MB-231細胞以5×104個·mL-1的密度接種于96孔板,每孔加量為100 μL,并置于37 ℃、 5% CO2恒溫箱24 h。實驗組為0.1～200.0 μmol·L-1的目標(biāo)化合物,陽性對照組為CA-4和Alpelisib。將實驗組和陽性對照組置于37 ℃、 5% CO2環(huán)境條件下培養(yǎng)48 h后,吸掉孔內(nèi)液體,加入現(xiàn)用現(xiàn)配的含5 mg·mL-1MTT 10%的培養(yǎng)液100 μL,孵育4 h后,棄孔內(nèi)液體,加入150 μL DMSO,振蕩30 s,待紫色結(jié)晶物完全溶解,用酶標(biāo)儀測定570 nm處OD值,計算化合物對細胞生長增殖的抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子對接分析

通過對CA-4進行結(jié)構(gòu)分析,設(shè)計出2類B環(huán)取代化合物,即烯苯鹵素取代和炔苯鹵素取代。為了提高合成的效率,減少盲目化學(xué)合成,本文對原配體、CA-4和Alpelisib等63種化合物進行了微管蛋白和PI3K的雙靶點蛋白結(jié)合自由能分析(表1)。對比發(fā)現(xiàn),該類結(jié)構(gòu)整體上與雙靶點結(jié)合性良好,且烯苯鹵素取代優(yōu)于炔苯鹵素取代。篩選與PI3K對接活性≤-7.9 kcal·mol-1,與微管蛋白對接活性≤-8.9 kcal·mol-1的目標(biāo)化合物1、2、3、4、6、11、12、18和20進行分子對接分析及可視化分析(表2)。氫鍵的鍵能小于共價鍵而大于分子間作用力,在化合物與蛋白分子結(jié)合力中具有重要作用。目標(biāo)化合物1與1sa0蛋白的結(jié)合自由能為-9.5 kcal·mol-1,與CA-4相比,其值更低。目標(biāo)化合物1A環(huán)上甲氧基的氧原子與1sa0蛋白中的THR-353形成3個氫鍵,其中2個為強氫鍵(0.18 nm),另1個為較強氫鍵(0.34 nm);與ASP-329形成1個鍵長為0.25 nm的強氫鍵和1個鍵長為0.35 nm的較強氫鍵。羰基橋上的氧原子分別與LYS-352和PRO-175形成1個強氫鍵(0.19 nm)和1個較強鍵(0.35 nm)。呋喃環(huán)上的氧原子與ASN-349形成1個鍵長為0.19 nm強氫鍵。由于這8個氫鍵的作用使小分子能與1sa0蛋白形成較穩(wěn)定的復(fù)合物,結(jié)合自由能較低,因而結(jié)合效果較好(圖6)。目標(biāo)化合物1與4waf蛋白的結(jié)合自由能為-8.5 kcal·mol-1,與CA-4和Alpelisib相比,結(jié)合自由能較低,其A環(huán)上C-3甲氧基的氧原子與4waf蛋白中的GLN-478形成了1個較強氫鍵(0.33 nm)。呋喃環(huán)C-6的甲氧基上的氧原子分別PRO-5和ARG-4形成2個較強氫鍵,鍵長分別為0.34 nm和0.36 nm(圖7)。綜上所述,目標(biāo)化合物1具有較好的微管蛋白和PI3K雙靶點抑制活性。

表1 設(shè)計的CA-4衍生物與PI3K和微管蛋白雙靶點的結(jié)合自由能

表2 目標(biāo)化合物分子的對接可視化(氫鍵)

2.2 中間體化合物的合成方法分析

中間體化合物a和b是整個反應(yīng)可以順利進行的前期基礎(chǔ),本文各考察了2種合成方法,見表3。中間體化合物a的合成:方法(1)用甲醇作溶劑,常溫反應(yīng),加入液溴,反應(yīng)時間較長,反應(yīng)不完全,且液溴具有毒害性與腐蝕性,安全性較差;方法(2)用無水乙醇作溶劑,加入NBS,反應(yīng)溫度升高,需45 ℃水浴,但反應(yīng)時間縮短,且產(chǎn)物純度較高,經(jīng)重結(jié)晶即可得到,故選方法(2)合成中間體化合物a。中間體化合物b的合成:方法(1)用乙腈作溶劑,常溫反應(yīng),加入碘單質(zhì),反應(yīng)速度較快,4 h即可,但產(chǎn)率較低,不易分離;方法(2)使用了NIS,反應(yīng)時間延長至10 h,但產(chǎn)率較高,經(jīng)硅膠柱層析易得到,故選方法(2)合成中間體化合物b。綜上,相較與單質(zhì)溴和碘,使用的溴代試劑和碘代試劑化學(xué)合成產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少且反應(yīng)過程易于監(jiān)控。

表3 中間體化合物a和b的合成方法考察

2.3 抗腫瘤活性

本實驗測定了目標(biāo)化合物對人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231體外抗增殖的活性,結(jié)果見表4。從整體來看,目標(biāo)化合物對2種腫瘤細胞均有一定抑制作用,但對MCF-7細胞作用較好。其中目標(biāo)化合物18的活性較突出,2個氟原子的引入使該類化合物對MCF-7和MDA-MB-231細胞均具有良好的活性,IC50<10 μM。此外,目標(biāo)化合物4對MCF-7腫瘤細胞也有較好的抑制作用,但對MDA-MB-231細胞的抑制效果不佳。由目標(biāo)化合物3、11和20的的抑制活性可知,溴原子的引入使化合物對腫瘤的抑制作用不佳,可能是溴原子體積大、疏水性強和電負性弱導(dǎo)致。另外,陽性對照CA-4抗瘤效果不理想,可能是因為生成反式CA-4異構(gòu)體,活性降低。

表4 目標(biāo)化合物對MCF-7和MDA-MB-231 腫瘤細胞作用的IC50值

3 結(jié)論

本研究利用SBDD技術(shù),采用活性基團協(xié)作的方法,對CA-4進行秋水仙堿和PI3K雙靶點結(jié)構(gòu)改造,保留A環(huán)及3個甲氧基,以羰基取代連接雙鍵碳以保證順式構(gòu)型。苯并呋喃環(huán)取代B環(huán),B環(huán)側(cè)鏈引入烯苯鹵素增效,篩選出活性自由能≤-7.9 kcal·mol-1的9種雙靶點衍生物,對其進行分子對接分析及可視化分析,并通過碘代、溴代、Rap-Stereomer偶聯(lián)反應(yīng)和Heck偶聯(lián)反應(yīng)進行全合成,期間對關(guān)鍵的中間體化合物a和b的合成方法進行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與單質(zhì)相比,使用溴代試劑和碘代試劑化學(xué)合成產(chǎn)率均在67%以上且副產(chǎn)物較少。本實驗?zāi)壳爸粰z測了目標(biāo)化合物對2種乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖抑制活性,并發(fā)現(xiàn)具有一定的抑制作用,其中目標(biāo)化合物18對2種細胞的IC50<10 μM,揭示該類化合物具有抗腫瘤活性。后期將在多種不同類型腫瘤細胞株上進行進一步試驗,發(fā)現(xiàn)敏感細胞株和活性較優(yōu)化合物,進而開展后續(xù)雙靶點活性檢測試驗。