TurboID技術(shù)在疾病蛋白質(zhì)組學(xué)中的發(fā)展與應(yīng)用

張芷源 綜述,丁 明 審校

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210009)

細(xì)胞是生命的最小單位,而蛋白質(zhì)是生命物質(zhì)的基礎(chǔ)。在細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間通常會(huì)形成復(fù)合物及構(gòu)建對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能完整至關(guān)重要的相互作用網(wǎng)絡(luò)來(lái)控制不同的生理生命過程。為了解釋這些過程,研究蛋白質(zhì)的相互作用、蛋白質(zhì)作用的時(shí)間及空間分布則尤為重要。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用(PPI)與生物功能的執(zhí)行及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。探索隱藏于復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)下的PPI則需要克服諸多傳統(tǒng)方法的技術(shù)缺陷。常見的研究蛋白互作體的方法有親和純化-質(zhì)譜(AP-MS)和酵母雙雜交[1-2]。利用基于AP技術(shù)的方法需要裂解細(xì)胞并且受限于純化方式,即使可以純化也會(huì)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的鑒定污染,并且在蛋白互作體純化過程中由于嚴(yán)格的洗滌,那些短暫而微弱的相互作用可能會(huì)消失[3]。而酵母雙雜交試驗(yàn)只能提示2種蛋白質(zhì)的潛在相互作用,而不是實(shí)際發(fā)生在體內(nèi)的相互作用[3]。

而基于酶的鄰近依賴標(biāo)記技術(shù)是一種新的PPI篩選方法,隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展可以一定程度上彌補(bǔ)傳統(tǒng)手段的不足。鄰近標(biāo)記技術(shù)(PL)通過將具有標(biāo)記功能的工程酶與感興趣蛋白(誘餌蛋白)融合,工程酶就可以將目的蛋白鄰近以及潛在互作的蛋白(獵物蛋白)進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記。目前,工程酶主要有3種:辣根過氧化物酶(HRP)、生物素連接酶(BirA)、工程抗壞血酸過氧化物酶(APEX)[4]。而利用BirA及其突變體的鄰近依賴生物素鑒定(BioID)可以鑒定傳統(tǒng)方法容易忽略的瞬時(shí)、微弱的相互作用。隨著BioID技術(shù)的飛速發(fā)展,應(yīng)用更具有優(yōu)勢(shì)的BirA突變體的技術(shù)例如TurboID、miniTurboID及Split-TurboID,能夠更加快速、簡(jiǎn)單、可靠地了解蛋白質(zhì)相互作用并解釋其分子功能。本文主要對(duì)TurboID鄰近依賴生物素鑒定技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié),闡述其技術(shù)原理和在疾病蛋白質(zhì)組學(xué)中的重要作用。

1 鄰近依賴生物素鑒定技術(shù)的策略

鄰近依賴生物素鑒定技術(shù)是一種基于生物素連接酶(BirA)的鄰近標(biāo)記技術(shù)。BirA是一種保守的酶,相對(duì)分子質(zhì)量大約為35.5 kDa,來(lái)源于大腸桿菌,介導(dǎo)生物素與目標(biāo)蛋白結(jié)合[5]。BirA在ATP存在的情況下,催化生物素形成活性biotinoyl-5′-AMP中間體并將其保持在酶活性中心,活性biotinoyl-5′-AMP從活性位點(diǎn)脫離后轉(zhuǎn)移到靶蛋白的鄰近蛋白表面的伯胺賴氨酸上,實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物素化。由于BirA對(duì)其靶序列有很高的特異性,其已被用于研究特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用:BirA融合到誘餌蛋白上,生物素受體肽(BAP)融合到獵物蛋白上,如果它們之間能夠發(fā)生相互作用,獵物蛋白將因?yàn)樽銐蚪咏T餌蛋白而被生物素化。為了實(shí)現(xiàn)混雜標(biāo)記,對(duì)BirA的活性位點(diǎn)進(jìn)行了突變,使其能夠在沒有BAP的情況下能夠隨機(jī)生物素化鄰近蛋白[4]。而多種相對(duì)于BirA更具優(yōu)勢(shì)突變體的出現(xiàn),也使得BioID技術(shù)不斷發(fā)展。

2 BioID鑒定技術(shù)的發(fā)展與分類

2.1BioID &BioID2 野生型BirA僅能標(biāo)記一個(gè)蛋白,這對(duì)于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用來(lái)說(shuō)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。2012年ROUX等[6]使用了一種高度混雜的突變形式的大腸桿菌生物素連接酶:BirA*,其已經(jīng)成為PL最常用的工程酶之一。BirA*是對(duì)野生型BirA進(jìn)行點(diǎn)突變研究,篩選得到的一種大小為35kDa的突變體BirA*(R118G),依賴BirA*的鄰近標(biāo)記技術(shù)稱為BioID。BirA*的活性比BirA高,并且相對(duì)于BirA其與活性biotinoyl-5′-AMP的親和力更低,能夠更快的釋放biotinoyl-5′-AMP,實(shí)現(xiàn)以時(shí)間依賴性的混雜蛋白質(zhì)生物素化。據(jù)估計(jì),BirA*的有效標(biāo)記半徑為10～15 nm,并且BirA*的緩慢催化動(dòng)力學(xué)通常需要18～24 h來(lái)生成足夠的生物素化材料用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析[6-7],這使得其無(wú)法捕捉到短暫時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用。

2016年KIM等[8]對(duì)BioID方法進(jìn)行了改進(jìn)提出了BioID2。來(lái)源于超嗜熱菌(A.aeolicus)的生物素連接酶與來(lái)源于大腸埃希桿菌的BirA在整體結(jié)構(gòu)上具有相似之處,將其催化域內(nèi)的一個(gè)保守殘基點(diǎn)突變,得到BirA(R40G)。BirA(R40G)自然缺乏DNA結(jié)合域,相對(duì)分子質(zhì)量更小,只有大約27 kDa。較小體積的生物素連接酶對(duì)融合蛋白的破壞較小并且更有利于空間定位靶蛋白。BioID2生物素標(biāo)記時(shí)所需要提供的外源生物素更少、活性更高、時(shí)間更短[8-9]。

2.2TurboID &miniTurboID BioID2相比BioID技術(shù)提高了標(biāo)記效率,但將獵物蛋白生物素化仍需要至少16 h,這對(duì)于捕捉瞬時(shí)動(dòng)態(tài)變化仍然是不夠的。2018年BRANON等[9]以起始模板BirA(R118S)基于易出錯(cuò)的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和第五代酵母展示的定向進(jìn)化技術(shù),工程化篩選出2種更快的混雜連接酶:TurboID(35 kDa)和miniTurboID(28 kDa)。它們催化混雜蛋白質(zhì)賴氨酸殘基生物素化,而生物素化在生物體內(nèi)屬于較罕見的翻譯后修飾,并且有著具有超高親和力的結(jié)合伙伴-鏈霉親和素。在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生物素標(biāo)記后,裂解細(xì)胞并將細(xì)胞裂解物與鏈霉親和素偶聯(lián)珠結(jié)合,經(jīng)過嚴(yán)格的洗滌分離得到標(biāo)記的內(nèi)源性蛋白質(zhì)組。富集后的標(biāo)記蛋白用胰蛋白酶消化得到小肽段,然后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)可與已建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析,鑒定候選蛋白。

TurboID相對(duì)于野生型BirA有15個(gè)突變,具有更好的催化效率和快得多的催化動(dòng)力學(xué)。在ATP與外源生物素存在的條件下,TurboID在10 min就可以獲得BioID/BioID2在18 h內(nèi)相同數(shù)量的生物素化蛋白[7]。miniTurboID則相對(duì)于野生型BirA有13個(gè)突變,并缺少N-末端結(jié)構(gòu),相對(duì)分子質(zhì)量更小,所以可以減少對(duì)于融合蛋白追蹤與功能干擾。miniTurboID的催化活性比TurboID低2倍,在缺乏外源生物素的情況下表現(xiàn)出較低的催化能力,但這可使其背景干擾更小,更適合緊密的控制窗口和對(duì)時(shí)間需要精準(zhǔn)控制的鄰近標(biāo)記[4,7,9]。

不同的細(xì)胞器會(huì)有不同的pH、氧化還原環(huán)境等,這些都可能會(huì)影響PL活性。BRANON等[9]比較了TurboID、miniTurboID和BioID在HEK 293T細(xì)胞的細(xì)胞核、線粒體基質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的作用,評(píng)估得出TurboID在4種細(xì)胞器中信號(hào)強(qiáng)度、標(biāo)記效率均優(yōu)于miniTurboID和BioID。另外,TurboID在蠕蟲[9]、秀麗隱桿線蟲和黑果蠅[10]及植物(包括擬南芥、煙草植物等)[11]中能夠明顯增加生物素標(biāo)記。綜上可得出結(jié)論,TurboID具有高空間分辨率,在標(biāo)記識(shí)別不溶性蛋白、膜相關(guān)蛋白、特殊細(xì)胞類型的罕見蛋白及微弱/短暫的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中具有顯著優(yōu)勢(shì)。

2.3Split-TurboID 為了提高生物素鑒定在PL體系中的空間特異性以及多功能性,拆分PL(Split-PL)體系開始被大眾提及,包括Split-APEX[12]、Split-BioID[13-14]和 Split-TurboID[15]等。將混雜連接酶拆分成2個(gè)本身不具有催化活性的小片段,這2個(gè)片段可因在活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或膜-膜的關(guān)聯(lián)而結(jié)合,發(fā)揮催化活性。Split-PL是繪制細(xì)胞器接觸位點(diǎn)和大分子復(fù)合物蛋白質(zhì)組的一種有價(jià)值的方法。相比Split-APEX而言,Split-TurboID不需要添加氧化劑或輔助因子,而這些往往具有生物毒害。KELVIN CHO等[15]通過SPELL預(yù)測(cè)將酶分成2個(gè)不活躍的部分,分別克隆為FK506結(jié)合蛋白(FKBP)和FKBP12-雷帕霉素復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)(FRB)融合體片段,在雷帕霉素誘導(dǎo)下結(jié)合。這些片段再結(jié)合在不同的亞細(xì)胞室蛋白,則建立了一個(gè)雷帕霉素、生物素雙依賴的PL。例如,KELVIN CHO等[15]研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體體系,在這個(gè)體系中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的緊密結(jié)合使得拆分片段的重建,并在雷帕霉素存在的情況下增強(qiáng)了這種重建,發(fā)揮標(biāo)記作用,探測(cè)接觸位點(diǎn)和特定細(xì)胞類型界面的蛋白質(zhì)組學(xué)繪圖。

重組Split-TurboID活性低于TurboID,但在生物素孵育30 min后就能檢測(cè)到生物素化,并且具有更大的空間特異性。Split-TurboID可以通過設(shè)計(jì)特定的輸入信號(hào)而適用于更多領(lǐng)域的研究,例如免疫學(xué)、神經(jīng)學(xué)及腫瘤等。TAKANO等[16]將TurboID拆分為2個(gè)Split-TurboID片段,并在星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元相互作用的突觸間隙中重構(gòu)為功能性TurboID,提供了一個(gè)新的分子框架,以理解突觸之間的連接界面及這些接觸如何控制突觸的形成和在大腦中的功能[16-17]。細(xì)胞表面的蛋白通常豐度低并具有高疏水性與異質(zhì)性,亞細(xì)胞室蛋白又存在很大的空間特異性,這對(duì)于研究其蛋白質(zhì)組存在很大的挑戰(zhàn)。而Split-TurboID就是一個(gè)新的、有力的工具,相比Split-APEX或Split-BioID具有更強(qiáng)的生物相容性和更小的偏差。同時(shí),Split-TurboID還可以提高有挑戰(zhàn)性的靶向應(yīng)用的信噪比,例如特定基因組位點(diǎn)的dCas9定向PL[18]或特定細(xì)胞RNA的dCas13定向PL[19]。

3 TurboID技術(shù)在疾病蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

p53是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期、凋亡、衰老的腫瘤抑制基因,而p53的突變則成為27種癌癥發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因子。而研究最熱的p53(R175H)突變型與細(xì)胞基因組穩(wěn)定性、腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及耐藥性密切相關(guān)[20-21]。比對(duì)p53(R175H)與野生型p53相互作用的蛋白質(zhì)的差異,有助于理解突變型p53作用分子機(jī)制。HU等[21]利用鄰近標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了miniTurboID與p53(R175H)、野生型p53的融合體,利用LC-MS/MS分析相互作用蛋白,通過GO富集與KEGG分析發(fā)現(xiàn)大部分的互作蛋白都集中在代謝和遺傳信號(hào)處理的通路中,而剪接體為最顯著富集的途徑。

胃癌是世界上發(fā)病率、死亡率最高的惡性癌癥之一,探索腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與凋亡的分子機(jī)制對(duì)發(fā)現(xiàn)靶向藥物至關(guān)重要。吲地磺胺對(duì)多種腫瘤都具有抑制作用,并已有研究證明吲地磺胺能與DCAF15(DDB1與CUL4相關(guān)因子15)相互作用,誘導(dǎo)下游底物降解,從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[22]。LU等[23]將TurboID與DCAF15融合,誘導(dǎo)生物素化標(biāo)記鄰近蛋白,通過鄰近標(biāo)記技術(shù)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明了吲地磺胺抑制胃癌細(xì)胞的增殖的作用機(jī)制。利用PL技術(shù)分析腫瘤相關(guān)蛋白或藥物在體內(nèi)的相互作用網(wǎng)絡(luò),分析其作用機(jī)制,有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)與腫瘤治療靶點(diǎn)。

細(xì)胞質(zhì)中存在病原性或自身DNA會(huì)觸發(fā)天然免疫系統(tǒng),產(chǎn)生的危險(xiǎn)信號(hào)會(huì)刺激cGAS-STING信號(hào)通路,誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素而發(fā)揮非特異性免疫作用。MOTANI等[24]融合STING與TurboID,尋找STING可能的互作蛋白。利用鄰近標(biāo)記研究發(fā)現(xiàn)STING的激活會(huì)導(dǎo)致高爾基體和核內(nèi)體中許多蛋白的生物素化,干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白(IFITM3)就是其中一個(gè),更具進(jìn)一步研究證明IFITM3的確是STING的新互作體[24]。IFITM3是一種病毒限制性因子,尤其是針對(duì)RNA病毒,例如A型流感病毒、西尼羅病毒、登革病毒等[25]。有趣的是,也有研究表明STING也對(duì)這類病毒具有抑制作用,所以STING 可能是參與對(duì)IFITM3的調(diào)控而起到抗病毒活性。STING在天然免疫包括抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用,維持生命體的健康,但是STING的過度活化也會(huì)導(dǎo)致很多自身免疫疾病的產(chǎn)生,所以利用TurboID研究STING的相互作用蛋白尤為重要。

2019年新型冠狀病毒(COVID-19)首次出現(xiàn)并迅速席卷全球,這場(chǎng)全球流行病的病原體冠狀病毒被稱為SARS-CoV-2,其肆虐已導(dǎo)致超5億人感染。而研究SARS-CoV-2的病毒蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的行為可以揭示潛在的發(fā)病機(jī)制,并幫助治療藥物、疫苗的開發(fā)。通過鄰近標(biāo)記技術(shù)探索病毒-宿主互作體為了解病毒蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的直接影響提供了新途徑。MAY等[26]利用PL技術(shù),將單個(gè)的SARS-CoV-2蛋白與TurboID融合并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,然后進(jìn)行全細(xì)胞蛋白質(zhì)組的組學(xué)分析和生物素化蛋白的親和純化,再通過質(zhì)譜鑒定PPIs。識(shí)別由于病毒蛋白表達(dá)而受影響的全細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)變化,并識(shí)別單獨(dú)的病毒蛋白-宿主細(xì)胞蛋白之間的特異的相互作用。將最后得到的BioID數(shù)據(jù)集與CLUE臨床藥物庫(kù)和FDA批準(zhǔn)的藥物進(jìn)行交叉引用,以確定對(duì)COVID-19相關(guān)治療可能有益的藥物,也為揭示SARS-CoV-2的生物學(xué)特性和研發(fā)抗病毒藥物提供了寶貴的資源[26-27]。

鄰近標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于癌癥、免疫、神經(jīng)等領(lǐng)域,為疾病產(chǎn)生的生理病理過程機(jī)制、藥物發(fā)現(xiàn)、靶向性治療提供了不可磨滅的貢獻(xiàn)。在人體內(nèi)大腦猶如一個(gè)精密的儀器控制著人體的生命活動(dòng),而神經(jīng)元、突觸就相當(dāng)于這個(gè)精密儀器中至關(guān)重要的作用元件。有研究證明,星形膠質(zhì)細(xì)胞-突觸相互作用的功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致精神和神經(jīng)發(fā)育障礙[28]。TAKANO等[16]將TurboID拆分為2個(gè)低活性片段(split-turboID),分別融合表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元突觸表面,而通過突觸間隙重構(gòu)為有活性的TurboID酶。而利用的Split-TurboID技術(shù)的確高度標(biāo)記出了大腦皮層神經(jīng)興奮性、抑制性神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞之間間隙中的蛋白質(zhì),而識(shí)別的蛋白質(zhì)多數(shù)上都是獨(dú)一無(wú)二。星形膠質(zhì)細(xì)胞中信號(hào)通路的異常與多種綜合征、疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān),例如慢性神經(jīng)性疼痛、自閉癥和癲癇等[16-17,29]。TurboID技術(shù)在其他多種疾病中也可運(yùn)用,為發(fā)現(xiàn)多種疾病的發(fā)病機(jī)制、治療方案與治療靶標(biāo)提供了新的有力手段,極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4 小 結(jié)

隨著對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究愈發(fā)深入,鄰近標(biāo)記技術(shù)也被越來(lái)越多的研究者應(yīng)用在各種領(lǐng)域,比如蠕蟲、秀麗隱桿線蟲和黑果蠅及植物中。同時(shí)也給研究腫瘤等各種疾病的生理病理機(jī)制與治療提供了新思路。PL技術(shù)主要為3種,依賴?yán)备^氧化物酶(HRP)的生物素標(biāo)記、依賴生物素連接酶(BirA)的生物素標(biāo)記及依賴工程抗壞血酸過氧化物酶(APEX)的生物素標(biāo)記,但HRP由于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中催化活性低且結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,逐漸在研究PPI的洪流中退出。而BioID技術(shù)相對(duì)于APEX2而言,其不需要額外的催化因子或助氧化劑,這些往往具有生物毒害性并且可能使細(xì)胞為響應(yīng)氧化應(yīng)激而改變?nèi)?xì)胞蛋白質(zhì)組的相互作用,從而改變細(xì)胞的生理機(jī)能,出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。BioID也存在很多不足,例如慢催化動(dòng)力學(xué)、BirA*酶本身具有一定大小、催化半徑小于APEX2等。因此,這也促使研究者們不斷地探索,使得BioID技術(shù)不斷的優(yōu)化。

2018年BRANON等[9]提出了TurboID和miniTurboID的概念,有效解決了BioID的慢催化動(dòng)力學(xué)問題,將生物素標(biāo)記時(shí)間縮短到10 min,并且證明了TurboID的高空間分辨率特性,在標(biāo)記識(shí)別不溶性蛋白、膜相關(guān)蛋白、特殊細(xì)胞類型的罕見蛋白及微弱/短暫蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中具有顯著優(yōu)勢(shì)。對(duì)于酶催化PL中存在的空間限制,TAKANO等[16]將TurboID進(jìn)行了拆分,得到了Split-TurboID。若將Split-TurboID片段融合在不同細(xì)胞或亞細(xì)胞室表面蛋白上,蛋白質(zhì)之間的相互作用能夠重構(gòu)有催化活性的TurboID,然后分析生物素化蛋白,則可以探測(cè)接觸位點(diǎn)和特定細(xì)胞類型界面的蛋白質(zhì)組學(xué)。隨著TurboID技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新,逐漸成為一種有效的PL技術(shù),在不同領(lǐng)域發(fā)揮作用,并廣泛應(yīng)用于PPI的鑒定、疾病發(fā)生機(jī)制研究與藥物靶點(diǎn)的篩選,為廣大科研工作者提供了新的思路和研究手段,推動(dòng)生命科學(xué)的不斷進(jìn)步。