劉里,何美玲
(曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南 曲靖 655011)
蘇木精又稱蘇木素,是從一種原產(chǎn)于中美洲和南美洲熱帶雨林的樹(shù)種心材中提取的具有生物活性的黃酮類化合物[1-2],是一種廣泛分布于各種植物中重要的生物分子[3]。從蘇木精的結(jié)構(gòu)(圖1)可知,其是一種具有生物活性的三環(huán)類黃酮分子[4],是兒茶酚的衍生物,又稱雙兒茶酚。
圖1 蘇木精的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of hematoxylin
由于蘇木精是組織學(xué)和組織病理學(xué)診斷中最常用的染色劑之一,所以全球內(nèi)對(duì)蘇木精的需求是驚人的:僅在組織學(xué)準(zhǔn)備中,每天就生產(chǎn)250~300 萬(wàn)張外科載玻片,僅1年就消耗了大約7萬(wàn)噸蘇木精染色液。由于人口的增長(zhǎng)和衛(wèi)生保健的普及,以及對(duì)組織細(xì)胞技術(shù)方法的顯微診斷研究和外科手術(shù)需求的增加,世界每年對(duì)蘇木精的需求日益增強(qiáng)。自十九世紀(jì)中期蘇木精被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已經(jīng)有超過(guò)50 種不同的蘇木精配方被開(kāi)發(fā)出來(lái)并用于組織技術(shù)。蘇木精相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)申請(qǐng)了約900項(xiàng)專利[1]。通過(guò)查閱近34年來(lái)國(guó)內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)目前蘇木素的應(yīng)用主要是作為一種生物著色劑,因在醫(yī)藥生產(chǎn)中起著至關(guān)重要的作用,使其成為史上最常用和最有價(jià)值的天然化合物。令人惋惜的是,蘇木精在癌組織病理學(xué)診斷中應(yīng)用得較少,用于各類生物分析的也不多,總之,蘇木精的應(yīng)用還需進(jìn)一步拓展。相關(guān)蘇木精含量的測(cè)定方法更是很少報(bào)道,這也限制了其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。本文從蘇木精的應(yīng)用和含量測(cè)定方法兩方面進(jìn)行綜述,一是引起研究學(xué)者的更多關(guān)注;二是為其進(jìn)一步發(fā)展提供參考;三是促進(jìn)蘇木素研究領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展,使其在農(nóng)業(yè)、食品和環(huán)境等更多的領(lǐng)域大放光彩,為人類健康和美好生活提供有利保障。
蘇木精是最古老、使用最廣泛的生物染色劑之一,它也是組織化學(xué)中最重要的天然染色劑[5]。蘇木精最早的組織學(xué)應(yīng)用是在十九世紀(jì)60年代,由德國(guó)解剖學(xué)家Wilhelm Waldeyer 提出的[6]。Wilhelm Waldeyer 使用一種蘇木的粗水提取物,試圖鑒定神經(jīng)元軸突,但結(jié)果并不令人滿意[5-6]。Franz Bohmer第一次成功地使用了蘇木精,他在1865年認(rèn)識(shí)到,蘇木精需要一種媒染劑才能使顏色持久,這使它從一種染料變成一種染色劑。Franz Bohmer試了幾種金屬鹽作為媒染劑,最后選定了明礬(硫酸鋁鉀)。金屬鹽能將蘇木精氧化成蘇木紅(與微粒血色素?zé)o關(guān)),這種化學(xué)物質(zhì)會(huì)永久性地染色組織[5]。生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室模擬廢水的光催化脫色與氧化,以蘇木精為模型染料,使其成為世界上應(yīng)用最廣泛的組織切片常規(guī)染色的復(fù)染劑[7]。蘇木精是一種堿性染料,它可以染色細(xì)胞的酸性成分,包括核酸、糖胺聚糖和酸性糖蛋白,使它們呈現(xiàn)藍(lán)紫色[8]。
蘇木精[IUPAC 名稱:7,11b-Dihydroindeno[2,1-c]chromene-3,4,6a,9,10(6H)-pentol,HX]是鄰苯二酚的衍生物,被稱為雙鄰苯二酚,此外,蘇木精還具有3,4-環(huán)烷基熔融苯并吡喃單元。由于這種活性成分HX具有抗炎活性,能抑制晶狀體醛糖還原酶,降低血糖水平。此外,HX中的活性雙鄰苯二酚部分(非鄰接苯環(huán)上的兩對(duì)鄰接羥基)對(duì)HIV-I的整合具有合理的抑制作用。
世界范圍內(nèi)幾乎全部的病理診斷和需要顯微鏡分析的常規(guī)外科評(píng)估都依賴于蘇木精核染料[1]。這種具有150年歷史的分子不僅來(lái)源有限,而且市場(chǎng)動(dòng)態(tài)也不穩(wěn)定。目前為止,對(duì)于這個(gè)行業(yè)來(lái)說(shuō),還沒(méi)有比這種分子更好、更方便的替代品。核染色改變了組織技術(shù)診斷在醫(yī)學(xué)上的常規(guī)應(yīng)用。該分子高度復(fù)雜,但能顯示染色切片的細(xì)節(jié)。蘇木精是一種較好的核著色劑,本質(zhì)上是堿性的,能染色組織、細(xì)胞核、線粒體等的酸性成分[4]。由于蘇木精含有活性成分,其具有抗炎活性,抑制晶狀體醛糖還原酶,降低血糖水平[4,9]。此外,蘇木精中活躍的雙兒茶酚片斷即非相鄰苯環(huán)上的兩對(duì)相鄰羥基對(duì)HIVI 整合酶有一定的抑制作用[4]。從蘇木中提取的蘇木精是Aβ42 纖維形成的有力抑制劑。它是一種潛在的抗Aβ 纖維生成和細(xì)胞毒性的藥物,這就表明蘇木精是一種潛在的治療阿爾茨海默病的化合物[10]。
蘇木精也可用于前列腺癌組織病理學(xué)診斷[11-12]。蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制劑是一種新興的腫瘤化療藥物。在Lin 等的研究中,蘇木素通過(guò)采用基于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的自動(dòng)高通量篩選(HTS)策略,在正交化合物混合文庫(kù)(32 200個(gè)化合物)中被鑒定為有效的c-Src抑制劑之一[13]。在體外其是一種具有ATP競(jìng)爭(zhēng)性的廣譜PTK抑制劑,在酶和細(xì)胞水平上是c-Src 的有效抑制劑和廣譜PTK抑制劑。蘇木精具有抑制多種類型PTK和阻斷下游信號(hào)分子的能力,也是PTK抑制劑研究中有用的探針。皮膚病理的染色也常用蘇木精,它可揭示豐富的結(jié)構(gòu)信息,從形態(tài)結(jié)構(gòu)揭示病癥,如炎癥[14]。采用蘇木精對(duì)膜性腎病大鼠進(jìn)行血、尿試驗(yàn)均有改善趨勢(shì),大鼠臨床表現(xiàn)的改善,揭示蘇木精對(duì)膜性腎病大鼠有明顯的治療作用[15]。
由于蘇木精結(jié)構(gòu)中的羥基可以與各種金屬離子形成絡(luò)合物[2],利用其電化學(xué)行為用作檢測(cè)還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和肼的電化學(xué)標(biāo)簽[16]。此外,已有蘇木精修飾玻碳電極的制備及其在肼電催化氧化及某些生物化合物測(cè)定中的應(yīng)用[12]。Harisha K. V.等用蘇木精修飾碳糊電極(CPE)用于差分伏安脈沖法(DPV)同時(shí)測(cè)定去甲腎上腺素和對(duì)乙酰氨基酚[4]。蘇木精在含氧溶液中的光氧化以及蘇木精與不同金屬離子的相互作用的研究也已發(fā)表[12]。Nasirizadeh和他的同事在2011 年發(fā)表的一項(xiàng)研究中,首次將其用作DNA 電化學(xué)生物傳感器的電活性標(biāo)簽[16]。利用蘇木精作為絲網(wǎng)印刷金電極上的敏感電化學(xué)標(biāo)簽,得到了一個(gè)簡(jiǎn)單用硫代化探針修飾的穩(wěn)定、靈敏的平臺(tái)。雖然結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,但是大大降低了最終價(jià)格,生物傳感裝置顯示出對(duì)目標(biāo)DNA檢測(cè)的高度敏感性和選擇性。
1.3.1 NADH檢測(cè)
NADH 是一種存在于所有活細(xì)胞中的重要生物分子,是脫氫酶在體內(nèi)產(chǎn)生的重要輔酶[16-18]。蘇木精修飾碳糊電極(HMCPE)對(duì)NADH氧化具有良好的電催化活性。將蘇木精電沉積固定在玻碳電極表面的多壁碳納米管(MWCNT)上,可用于同時(shí)或單獨(dú)測(cè)定腎上腺素、抗壞血酸和尿酸[17]。2011 年Didem Giray Dilgin 等[19]通過(guò)在玻碳電極(GCE)上電聚合蘇木精,得到了一種用于測(cè)定NADH 的光電催化氧化修飾電極。圖2 是蘇木精電聚合機(jī)理的圖解。文章優(yōu)化了負(fù)載電解質(zhì)、單體濃度、循環(huán)次數(shù)、陽(yáng)極上電位極限等電聚合條件。在流動(dòng)注射分析(FIA)體系中,采用一種新型的自制流動(dòng)單元,通過(guò)透明窗口照射電極表面,進(jìn)行了NADH 的光電催化測(cè)定。在含0.1 M NaNO3的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中,在-0.5 至+2.0 V vs. Ag/AgCl 的電位范圍內(nèi),在GCE 表面連續(xù)記錄0.3 mM 蘇木精的循環(huán)伏安圖,成功制備了穩(wěn)定的聚蘇木精(poly-HT)電活性薄膜。聚蘇木精修飾電極在pH 值為7.0 的磷酸鹽緩沖溶液中對(duì)NADH 的氧化具有良好的電催化活性,與未修飾電極相比,其過(guò)電位顯著降低了320 mV 以上。在最佳條件下,在FIA 系統(tǒng)中分別用安培和光電安培進(jìn)行NADH 的光電催化測(cè)定,電流與NADH 濃度呈良好的線性關(guān)系,線性范圍分別為1.0×10-7~1.5×10-4M 和1.0×10-7~2.5×10-4M。光電安培法測(cè)定NADH的檢出限為3.0×10-8M。
圖2 蘇木精電聚合機(jī)理的圖解Fig.2 The illustration of electropolymerization mechanism of hematoxylin
1.3.2 硫化物檢測(cè)
眾所周知,硫化物污染是所有水源面臨的最重要的問(wèn)題,其對(duì)許多生物都能產(chǎn)生危害[20]。硫化物可以通過(guò)厭氧降解含硫的蛋白質(zhì)、氨基酸或其他類型的有機(jī)成分釋放到水環(huán)境中。硫化物常用于工業(yè)廢水中,以減少汞和鉛等有毒金屬通過(guò)沉淀反應(yīng)進(jìn)入環(huán)境的可能性[21]。低濃度的硫化物會(huì)使人痛苦,而高濃度的硫化物會(huì)導(dǎo)致意識(shí)喪失、永久性腦損傷甚至死亡。現(xiàn)已經(jīng)發(fā)展了幾種測(cè)定天然水中和廢水中硫化物的技術(shù),如滴定法、光譜法和色譜法等。然而,這些方法需要特定的昂貴設(shè)備且非常耗時(shí),因而需要一種快速、靈敏和廉價(jià)的方法來(lái)檢測(cè)硫化物,用傳感器代替分析方法,有望實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)[22]。2012 年Yusuf Dilgin 等[21]介紹了一種用蘇木精修飾的鉛筆石墨電極(PGE/HMT)研究硫化物電催化氧化的新方法。它用良好的氧化還原介質(zhì)蘇木精(HMT)修飾的電極(PGE)對(duì)硫化物進(jìn)行電催化測(cè)定。HMT 的電化學(xué)氧化和硫化物在PGE/HMT 上的電催化氧化機(jī)理如圖3 所示。采用吸附法制備修飾電極,PGE/HMT 對(duì)硫化物氧化具有明顯的電催化活性,電催化電流與硫化物濃度呈線性關(guān)系,線性范圍為1~200 μM,檢出限為0.4 μM。該方法成功地應(yīng)用于廢水中硫化物的測(cè)定。
2013 年Dai 等[22]研究了一種用蘇木精多壁碳納米管修飾碳糊電極(HM-MWCNTs/CPE)測(cè)定硫化物的新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HM-MWCNTs/CPE 對(duì)硫化物氧化具有顯著的電催化活性。在最佳條件下的電流與硫化物濃度呈線性相關(guān),校準(zhǔn)曲線方程為Ip(μA)=0.102 6×c(10-6mol·L-1)+0.756 9,相關(guān)系數(shù)R2=0.999,線性范圍在0.5×10-6~150×10-6mol·L-1,安培法檢出限為0.2×10-6mol·L-1。這種HM-MWCNTs/CPE 電化學(xué)傳感器非常靈敏、簡(jiǎn)單,可以再生,易于制備和儲(chǔ)存。在室溫下儲(chǔ)存60 天后,5 μM 硫化物濃度下的硫化物的安培反應(yīng)與新鮮硫化物的安培反應(yīng)差異不大,表明HM-MWCNTs/CPE 易于保存,重現(xiàn)性好,穩(wěn)定性高。該方法已成功地應(yīng)用于捷克共和國(guó)帕杜比斯市的河流水樣。
1.3.3 肼檢測(cè)
肼及其衍生物在化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,包括高能推進(jìn)劑、燃料電池、除氧劑、照相顯影劑、除草劑、農(nóng)藥等。然而,因?yàn)樗母叨拘院痛碳ば?,肼也被認(rèn)為是一種環(huán)境污染物。此外,肼作為一種致癌和致突變物質(zhì),對(duì)人體健康有不良影響,特別是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此,準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)肼是非常重要的[23]。肼是一種優(yōu)良的還原劑,由于其工業(yè)和藥理意義,需要一種高靈敏度的方法才能可靠地測(cè)定其含量。電化學(xué)測(cè)量技術(shù)已被證明其為許多化合物的檢測(cè)提供了一種靈敏和選擇性的方法。雖然金屬如鉑、金和銀在肼的陽(yáng)極氧化中非?;钴S,但它們的實(shí)際應(yīng)用成本太高,而且令人遺憾地是,在普通碳電極上具有較大氧化性過(guò)電位的肼不適合通過(guò)傳統(tǒng)的電化學(xué)方法進(jìn)行定量[24]。
2007年Hamid R. Zare 等[24]報(bào)道了蘇木精多壁碳納米管(HMWCNT)修飾玻碳電極(GCE)的制備及其在肼電催化氧化中的應(yīng)用。采用多壁碳納米管修飾的GCE表面固定化蘇木精,制備了一種新型肼傳感器。HMWCNT 修飾GCE 的制備方法是將MWCNT 修飾的GCE 浸泡在1.0 mM蘇木精溶液中,在100 mVs-1下進(jìn)行-100~500 mV 的8 次電位掃描,制備了HMWCNT 修飾的GCE。在多壁碳納米管表面形成蘇木精膜后,用水沖洗修飾電極并浸入緩沖溶液中測(cè)試其電化學(xué)行為。研究表明,蘇木精薄膜在MWCNT 修飾的GCE 上的吸附表現(xiàn)出一對(duì)特征峰。HMWCNT 改性GCE 對(duì)肼的電化學(xué)氧化具有較高的催化活性。MWCNT 與活化改性GCE 表面相比,HMWCNT 修飾GCE 表面的肼峰電位分別向負(fù)值移動(dòng)了約167 mV 和255 mV。此外,HMWCNT 修飾電極表面顯著提高了肼測(cè)定的靈敏度,肼的線性響應(yīng)范圍為2.0~122.8 μM,檢測(cè)限為0.68 μM,靈敏度為0.020 8 μA μM-1。最后,測(cè)定肼的安培反應(yīng)是可重復(fù)、快速和非常穩(wěn)定的,在連續(xù)的400 s 操作中靈敏度沒(méi)有損失。
1.3.4 去甲腎上腺素和對(duì)乙酰氨基酚檢測(cè)
電化學(xué)測(cè)定生物分子是近二十年來(lái)研究的熱點(diǎn)。去甲腎上腺素(NA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種非常重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)。許多疾病都與NA 濃度的變化有關(guān)。因此,測(cè)定其在生物系統(tǒng)中的濃度能提供有用的信息[25]。此外,對(duì)乙酰氨基酚(AC)是一種廣泛使用的鎮(zhèn)痛解熱藥物,其作用類似于阿司匹林,對(duì)阿司匹林敏感且在治療劑量下安全的患者,它是合適的替代品。2009 年Navid Nasirizadeh 等[25]以蘇木精為電極,在GCE 玻碳電極上制備了高效NA 生物傳感器。使用了蘇木素生物傳感器進(jìn)行NA電催化氧化,并同時(shí)測(cè)定生理pH值下的NA和AC。在生理pH值下,蘇木素生物傳感器表面NA 和AC 氧化的微分脈沖伏安法(DPV)的峰出現(xiàn)明顯分離。因此,可以在蘇木精生物傳感器上同時(shí)測(cè)定樣品中的NA 和AC。圖4 是蘇木精生物傳感器在含有不同濃度NA 在0.15 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中的微分脈沖伏安圖。1~30 的數(shù)字對(duì)應(yīng)于5.0×10-1至65.40 μmol·L-1的NA。插圖:(A)蘇木精生物傳感器在含有65.40~274.20 μmol·L-1NA 的溶液中的DPV;(B)和(C)分別顯示了在NA 的5.0×10-1~65.40 μmol·L-1和65.40~274.20 μmol·L-1范圍內(nèi)作為NA濃度函數(shù)的電催化峰值電流圖。對(duì)于5.0×10-1~65.40 μmol·L-1和65.40~274.20 μmol·L-1的NA,以及12.00~59.10 μmol·L-1和59.10~261.70 μmol·L-1的AC,獲得線性校準(zhǔn)曲線。在不存在和存在AC的情況下,生物傳感器對(duì)NA的敏感性幾乎相同,這表明NA的電催化氧化過(guò)程與AC無(wú)關(guān),因此,可以在沒(méi)有任何干擾的情況下同時(shí)或獨(dú)立測(cè)量?jī)煞N分析物(NA和AC)。結(jié)果表明,蘇木精生物傳感器具有穩(wěn)定性好、表面電荷轉(zhuǎn)移速率常數(shù)高、NA檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。用DPV 研究了該傳感器在AC 存在下對(duì)NA的定量分析性能。
圖4 蘇木精生物傳感器在含有不同濃度NA 的0.15 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)中的微分脈沖伏安圖[25]Fig.4 Differential pulse voltammograms of the hematoxylin biosensor in a 0.15 mol L-1 phosphate buffer solution(pH 7.0)containing different concentrations of NA[25]
1.3.5 抗壞血酸、腎上腺素和尿酸檢測(cè)
抗壞血酸(AA)、腎上腺素(AD)和尿酸(UA)是在各種生物過(guò)程中起重要作用的生化物質(zhì)。抗壞血酸(AA)又稱維生素C,具有多種生理和藥理功能,如膠原蛋白合成、腸道鐵吸收、藥物代謝等。腎上腺素(AD)是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,它以有機(jī)陽(yáng)離子的形式存在于神經(jīng)組織和生物體液中,許多疾病與它在體液中濃度的變化有關(guān)。此外,許多現(xiàn)象與血液和尿液中AD的濃度有關(guān)。UA 是嘌呤在人體內(nèi)代謝的最終產(chǎn)物,它是監(jiān)測(cè)尿液和血液的主要參數(shù)之一。尿酸濃度的變化與嘌呤代謝的改變有關(guān),嘌呤代謝與許多疾病和生理障礙有關(guān)。因此,在痛風(fēng)、高尿酸血癥、重型肝炎、Lesch-Nyhan綜合征等疾病的診斷和治療中,在生理體液中測(cè)定其含量是必要的[3]。2010年Hamid R. Zare等[3]研究了蘇木精多壁碳納米管修飾玻碳電極(HMWCNT-GCE)同時(shí)測(cè)定抗壞血酸、腎上腺素和尿酸。在該研究中,在玻碳電極(GCE)表面固定的多壁碳納米管上電沉積蘇木精,與單獨(dú)的GCE相比,MWCNT修飾的GCE顯著改善了蘇木精的可逆性。HMWCNT-GCE不僅對(duì)AD的氧化有很強(qiáng)的催化活性,而且還將AA、AD和UA化合物的伏安響應(yīng)分解為單個(gè)信號(hào)。HMWCNT-GCE 具有穩(wěn)定性好和重現(xiàn)性佳、線性濃度范圍寬、工藝簡(jiǎn)單、表面電荷轉(zhuǎn)移速率常數(shù)高、對(duì)AD 的檢出限低等顯著優(yōu)點(diǎn),并且修飾電極具有優(yōu)良的同時(shí)測(cè)定實(shí)際樣本中AA、AD 和UA 的能力。
有關(guān)測(cè)定蘇木精含量的方法相關(guān)文獻(xiàn)較少,主要包括電化學(xué)分析法[4,12,26]、高效液相色譜法(HPLC)[27]和薄層層析光密度法[28],現(xiàn)將不同方法檢測(cè)蘇木精的對(duì)比匯總于表1中。
表1 檢測(cè)蘇木精的不同方法比較Tab.1 Comparison of different methods for hematoxylin detection
2.1.1 循環(huán)伏安法
2011年Hamid R. Zare 等[12]對(duì)蘇木精在水溶液中的電化學(xué)行為進(jìn)行研究,考慮了pH、蘇木精濃度、選擇的電化學(xué)方法的時(shí)間窗等不同參數(shù)的影響,以了解蘇木精的氧化機(jī)理。蘇木精的結(jié)構(gòu)和蘇木精的電化學(xué)氧化機(jī)理如圖5所示。利用循環(huán)伏安法研究蘇木精作為重要生物分子的電化學(xué)氧化過(guò)程。在pH 7.0使用0.1 M磷酸鹽緩沖溶液作為電解質(zhì),在玻碳電極上構(gòu)建了檢測(cè)蘇木精的循環(huán)伏安法,其檢測(cè)的線性范圍是0.020~0.385 mM。
圖5 (a)蘇木精的結(jié)構(gòu);(b)蘇木精的電化學(xué)氧化機(jī)理[12]Fig.5 (a)Structure of hematoxylin;(b)Proposed electrochemical oxidation mechanism for hematoxylin[12]
2018年K. V. Harisha等[4]用循環(huán)伏安法研究了聚丙氨酸修飾碳糊電極上蘇木精的電化學(xué)氧化行為。在pH 7.4將0.2 M PBS緩沖溶液(0.2 M NaH2PO4·H2O和0.2 M Na2HPO4儲(chǔ)備溶液混合得到磷酸鹽緩沖液)作為電解質(zhì),采用循環(huán)伏安法研究了具有生物活性的雙兒茶酚分子蘇木精在聚丙氨酸修飾碳糊電極(CPE)上的電化學(xué)氧化,并對(duì)其電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了表征。聚丙氨酸改性CPE對(duì)蘇木精的氧化反應(yīng)具有較高的敏感性,掃描速率的影響受吸附控制。圖6展示了DL-丙氨酸在碳糊電極表面可能的電聚合機(jī)理。從自由基機(jī)理觀察到蘇木精分子(苯甲酸形式)失去電子和質(zhì)子后形成活性基團(tuán)(I),可以寫(xiě)成共振結(jié)構(gòu)。在自由基I重排后的第二氧化步驟中形成蘇木紅(醌形式),這是穩(wěn)定的蘇木精氧化形式,其結(jié)構(gòu)多一個(gè)共軛雙鍵。圖7A 是聚丙氨酸修飾的CPE,在0.2 M PBS(pH 7.4)中以50 mVs-1掃描速率,不同蘇木精濃度的循環(huán)伏安圖;圖7B是陽(yáng)極峰值電流與蘇木精濃度的關(guān)系圖。該方法的線性范圍為20~160 μM,檢測(cè)限(3S/M)為0.102 μM,定量限(10S/M)為0.34 μM。由于制備的聚丙氨酸改性CPE具有較高的靈敏度,可以作為一種很有前途的電化學(xué)傳感器用于蘇木精的測(cè)定。
圖6 DL-丙氨酸在碳糊電極表面可能的電聚合機(jī)理圖[4]Fig.6 Probable electropolymerisation mechanism of DL-alanine on the surface of carbon paste electrode[4]
圖7 (A)不同濃度蘇木精在聚(丙氨酸)MCPE中在0.2 M PBS(pH 7.4)中掃描速度為50 mVs-1時(shí)20~160 μM 線性范圍內(nèi)的循環(huán)伏安圖;(B)陽(yáng)極峰值電流與蘇木精濃度的關(guān)系圖[4]Fig.7(A)Cyclic voltammograms of different concentration of hematoxylin at poly(alanine)MCPE in 0.2 M PBS(pH 7.4)in the linear range of 20~160 μM at scan rates 50 mVs-1;(B)Plot of anodic peak current versus concentration of hematoxylin[4]
2.1.2 線性掃描伏安法
2012年仇小飛等[26]使用pH 5.0的B-R 緩沖溶液作為電解質(zhì),采用線性掃描伏安法研究了蘇木精在玻碳電極上的電化學(xué)行為。對(duì)不同濃度蘇木精標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性掃描伏安測(cè)定,蘇木精溶液濃度在2.24×10-6~1.05×10-4mol·L-1范圍內(nèi)與峰電流呈線性關(guān)系,線性回歸方程為ip= 5.281×10-7+0.287c,相關(guān)系數(shù)為0.998 0,其中檢出限(3S/N)為7.4×10-7mol·L-1。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法得出回收試驗(yàn)結(jié)果,回收率在95.2%~104.0%之間。應(yīng)用線性掃描伏安法用于蘇木提取液中蘇木精的測(cè)定。取少量蘇木心材的水提液加入到pH 5.0 的B-R緩沖溶液中,按照試驗(yàn)方法通過(guò)線性掃描伏安法測(cè)得響應(yīng)峰電流,再根據(jù)所得的工作曲線換算成樣品量。此法測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法測(cè)定值之間的相對(duì)偏差在-3.6%~3.2%之間。采用線性掃描伏安法用于蘇木中蘇木精的測(cè)定具有時(shí)間短、快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)。
2014年王睿等[27]利用HPLC對(duì)國(guó)產(chǎn)和國(guó)外產(chǎn)蘇木藥材中蘇木精含量進(jìn)行檢測(cè)。采用HPLC法的色譜條件:Hypersil ODS2 色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(體積比為20∶80);柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):296 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。以蘇木精作為對(duì)照品,用HPLC法測(cè)定蘇木精含量的結(jié)果表明,國(guó)外蘇木藥材中蘇木精的含量高,均值達(dá)3.67%;國(guó)內(nèi)蘇木藥才蘇木精含量?jī)H為0.33%。蘇木精的線性回歸方程Y=696 275.34X-20 637.23,R2=0.999 9(n=6),蘇木精在0.200~2.000 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,同時(shí)進(jìn)行了穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn),各項(xiàng)結(jié)果均良好,符合含量分析的測(cè)試要求,操作簡(jiǎn)便易行。
1986 年曾紀(jì)琰等[28]采用薄層層析光密度法測(cè)定洋蘇木中的蘇木精。圖8 是洋蘇木提取液的TLC 圖。測(cè)定使用氧化鋁-硅膠H 薄層,并將液樣點(diǎn)成條狀,以氯仿-甲醇-甲酸(85∶13∶2)作展開(kāi)劑,直立上行展開(kāi),蘇木精與其他成分分離良好,斑點(diǎn)集中。蘇木精重量在1.6~4.0 μg 內(nèi)可以得到一條通過(guò)原點(diǎn)的直線,線性范圍為1.6~4.0 μg/mL。薄層層析光密度法標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別為±0.009 1%和±2.3%,精密度良好。
圖8 洋蘇木提取液的TLC圖Fig.8 TLC diagram of haematoxylon extract
本文綜述了1986-2020 年報(bào)道的蘇木精在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用及分析方法。通過(guò)調(diào)研文獻(xiàn),我們發(fā)現(xiàn)蘇木精除了傳統(tǒng)的應(yīng)用以外,只局限在前列腺癌組織病理學(xué)診斷和生物分子的檢測(cè),其應(yīng)用范圍有待進(jìn)一步擴(kuò)展。測(cè)定蘇木精含量的分析方法較少,最新并用得最多的是電化學(xué)方法。因?yàn)殡娀瘜W(xué)方法檢測(cè)蘇木精具有簡(jiǎn)便、分析響應(yīng)快、操作簡(jiǎn)單、檢出限低、選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。除此之外,還有高效液相色譜法和薄層層析光密度法。HPLC 法雖然準(zhǔn)確,但無(wú)市售的標(biāo)準(zhǔn)品,薄層色譜法繁瑣。由于蘇木精的分析方法單一,且各有局限性,有必要開(kāi)發(fā)其他方法,發(fā)展起來(lái)的新方法應(yīng)該更環(huán)保、更小型化和自動(dòng)化,并具備現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的能力。為了進(jìn)一步提高方法的準(zhǔn)確性、可靠性和檢測(cè)速度,可加入有效的化學(xué)計(jì)量學(xué)算法。此外,不同技術(shù)的組合也可以很好地克服單一技術(shù)的缺點(diǎn)。隨著現(xiàn)代軟件和硬件技術(shù)的高速發(fā)展,應(yīng)努力開(kāi)發(fā)更高分辨率和穩(wěn)定性、使用簡(jiǎn)單和低成本的儀器。