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    燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他對(duì)糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中CAT、SOD、MDA表達(dá)的影響

    2023-10-29 06:50:54屈雅娟張敬芳孫旗王雄易文媛陳賁彭攀郭承熙
    中醫(yī)藥信息 2023年10期
    關(guān)鍵詞:依帕司燈盞造模

    屈雅娟,張敬芳,孫旗,王雄,易文媛,陳賁,彭攀,郭承熙

    (長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410219)

    糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy,DN)是糖尿病發(fā)展形成的最常見(jiàn)的慢性微血管并發(fā)癥之一,主要表現(xiàn)為24 h 尿微量白蛋白升高,也是導(dǎo)致終末期腎病最重要的病因[1]。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,氧化應(yīng)激和糖代謝紊亂是導(dǎo)致DN病情發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。

    中藥具有多靶點(diǎn)、作用協(xié)同等優(yōu)勢(shì),對(duì)DN治療效果顯著。燈盞細(xì)辛為菊科短葶飛蓬(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz)的干燥全草,具有益氣化陰、活血化瘀的作用,可改善DN糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激以及尿蛋白排泄率等[3-5]。依帕司他主要通過(guò)降低醛糖還原酶活性降低血糖水平,進(jìn)而延緩DN病情進(jìn)展以及改腎臟損傷,但其治療糖尿病腎病尚具有爭(zhēng)議,對(duì)腎臟具體的保護(hù)機(jī)制也尚不明確[4]。目前臨床上藥物治療DN時(shí)易受多種因素影響,且單一的用藥方案臨床治療效果尚有待提高,而中西醫(yī)結(jié)合治療方案治療糖尿病及其并發(fā)癥,可發(fā)揮其各自的優(yōu)勢(shì),降低西藥毒副作用,延緩DN病情的發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他對(duì)糖尿病腎病大鼠腎皮質(zhì)中過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)表達(dá)的影響,深入探討燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控作用。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物

    SPF 級(jí)SD 大鼠,雄性,50 只,體質(zhì)量180~220 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,合格證號(hào):SCXK(湘)2019-0004。飼養(yǎng)室環(huán)境溫度22~26 ℃,濕度40%~70%,明暗交替各12 h,實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水、攝食。

    1.2 試劑及藥物

    高脂高糖飼料(南京盛民科研動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng));鏈脲佐菌素(STZ)(北京白鯊易科技有限公司,批號(hào):BS185);燈盞細(xì)辛提取物(燈盞花素)(云南生物谷藥業(yè)股份有限公司,批號(hào):20210601);依帕司他(南京海陵藥業(yè)有限公司,批號(hào):21080045);大鼠尿微量白蛋白(24 h UmAlb)試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司批號(hào):20211127);過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)(南京建成生物工程研究所,批號(hào):20211127、20210909、20210916)。

    1.3 方法

    SD 雄性大鼠40 只,適應(yīng)性喂養(yǎng)高脂高糖飲食1 周后,隨機(jī)分為模型組、依帕司他組、燈盞細(xì)辛組和聯(lián)合組,于左下腹單次注射1% STZ 55 mg/kg,注射后3 d于尾靜脈用血糖儀測(cè)空腹血糖值,若血糖值≥ 16.7 mmol/L,表示糖尿病模型建立完成。之后再給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)2 周,同時(shí)收集24 h 尿液,24 h UmAlb 為30~300 mg/24 h之間表示DN大鼠模型建立。依帕司他組在造模成功后灌胃依帕司他(100 mg/kg),給藥體積為10 mL/kg,給藥濃度為10 g/L,1次/d。燈盞細(xì)辛組在造模成功后灌胃燈盞細(xì)辛(200 mg/kg),給藥體積為10 mL/kg,給藥濃度為20 g/L,1次/d。聯(lián)合組在造模成功后灌胃同等劑量的依帕司他和燈盞細(xì)辛,1次/d。另選10只大鼠作為正常對(duì)照組,模型組和正常對(duì)照組給予5% CMCNa混懸液10 mL/kg灌胃,1次/d,連續(xù)6周。

    1.4 觀察指標(biāo)以及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

    ①記錄造模前,造模后2、4、6 周末大鼠的體質(zhì)量和空腹血糖。禁食不禁水12 h后,測(cè)定大鼠體質(zhì)量,于大鼠尾靜脈用采血針扎取血液,測(cè)空腹血糖水平。②在造模前、造模后2 周、治療后4、6 周末收集大鼠24 h尿液,尿液樣本離心后移取其上清液后,嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書方法測(cè)量每組大鼠的24 h UmAlb。③在治療后6 周末,將大鼠處死,取腎組織進(jìn)行稱重,冷生理鹽水按1∶9 的質(zhì)量體積比進(jìn)行量取,再用勻漿機(jī)對(duì)組織勻漿繼續(xù)充分研碎,制成10%的腎組織勻漿,將獲得的組織勻漿離心后移取上清液,采用鉬酸銨法檢測(cè)腎皮質(zhì)中過(guò)氧化氫酶(CAT)活性,WST1法檢測(cè)大鼠腎皮質(zhì)中超氧化物歧化酶(SOD)活性,TBA法檢測(cè)腎皮質(zhì)中丙二醛(MDA)含量,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    計(jì)量資料采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析,并用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間平均值的差異采用單因素方差法分析,組間的兩兩比較采用LSD 和SNK法分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化情況比較

    造模后,模型組大鼠體質(zhì)量有明顯的下降趨勢(shì),治療后2、4、6 周末模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于造模前(P<0.01);在治療后4 周末,各給藥組體質(zhì)量均顯著高于模型組(P<0.05,P<0.01),而聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量均高于依帕司他組和燈盞細(xì)辛組(P<0.05,P<0.01);治療后6 周末,各給藥組體質(zhì)量均顯著高于模型組(P<0.01),聯(lián)合組大鼠體質(zhì)量均高于依帕司他組和燈盞細(xì)辛組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1。

    表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化情況比較(±s,g)

    表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量的變化情況比較(±s,g)

    注:與本組造模前比較,△△P<0.01;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較,☆P<0.05,☆☆P<0.01;與依帕司他組同時(shí)間點(diǎn)比較,◇P<0.05,◇◇P<0.01;與燈盞細(xì)辛組同時(shí)間點(diǎn)比較,□□P<0.01。

    治療后6周末493.3±28.2 308.9±20.6△△389.0±23.3☆☆348.5±19.6☆☆412.1±10.2☆☆◇□□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模前357.2±23.1 367.1±17.4 358.0±26.3 361.8±30.1 383.2±25.0治療后2周末403.9±18.8 340.5±13.7△△363.8±23.8 360.5±27.6 392.1±11.8治療后4周末435.7±19.4 324.2±8.2△△373.9±20.7☆344.9±20.5☆401.4±14.5☆◇◇□□

    2.2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖的變化情況比較

    單次注射STZ 后,模型組和各給藥組的血糖值均>16.7 mmol/L 且均顯著高于空白組(P<0.01),提示糖尿病模型造模成功。治療后4、6 周末檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各給藥組大鼠血糖呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。治療后4 周末,各給藥組血糖水平顯著低于模型組(P<0.01),聯(lián)合組血糖水平顯著低于依帕司他帕司組和燈盞細(xì)辛組(P<0.05)。治療后6 周末,各給藥組血糖水平顯著低于模型組(P<0.01),聯(lián)合組大鼠血糖水平顯著低于依帕司他組和燈盞細(xì)辛組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表2。

    表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖的變化情況比較(±s,mmol/L)

    表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血糖的變化情況比較(±s,mmol/L)

    注:與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較,△△P<0.01;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較,☆☆P<0.01;與依帕司他組同時(shí)間點(diǎn)比較,◇P<0.05;與燈盞細(xì)辛組同時(shí)間點(diǎn)比較,□P<0.05,□□P<0.01。

    治療后6周末5.8±0.5 29.1±2.9 13.5±3.1☆☆19.0±3.0☆☆11.3±3.3☆☆◇□□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模后3 d 5.2±0.2 28.8±1.6△△29.2±3.2△△31.6±1.3△△27.6±3.1△△治療后2周末5.2±1.1 27.3±3.3 17.9±4.1 21.4±2.5 17.0±1.1治療后4周末5.6±1.3 29.2±3.4 14.5±3.1☆☆20.5±3.2☆☆13.6±3.4☆☆◇□

    2.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24h UmAlb的變化情況比較

    在糖尿病模型造模后2周,模型組和各給藥組大鼠24 h UmAlb均顯著高于空白組(P<0.01),再結(jié)合模型組和各給藥組大鼠血糖均>16.7 mmol/L,提示糖尿病腎病模型造模成功。治療后4周、6周末檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的24 h UmAlb有上升的趨勢(shì),各給藥組有下降的趨勢(shì)。治療后6周末,聯(lián)合組大鼠24 h UmAlb顯著低于模型組、依帕司他組和燈盞細(xì)辛組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表3。

    表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h UmAlb的變化情況比較(±s,mg)

    表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h UmAlb的變化情況比較(±s,mg)

    注:與正常對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較,△△P<0.01;與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較,☆☆P<0.01;與依帕司他組同時(shí)間點(diǎn)比較,◇P<0.05;與燈盞細(xì)辛組同時(shí)間點(diǎn)比較,□P<0.05。

    治療后6周末6.8±1.0 56.9±6.0 21.3±4.8 30.2±5.2 17.3±3.6☆☆◇□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10造模前5.8±0.9 5.7±0.9 5.6±1.0 5.7±0.9 5.4±0.8造模后2周末5.5±0.6 36.1±5.7△△35.4±4.2△△36.1±3.0△△25.5±2.5△△治療后4周末5.4±1.1 51.3±6.2 27.1±3.3 33.4±2.7 17.9±3.1

    2.4 各組大鼠CAT水平比較

    CAT 是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo),其水平可反映機(jī)體對(duì)氧自由基清除的能力[7]。與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠和各給藥組腎組織CAT 水平降低(P<0.01);與模型組比較,依帕司他組和聯(lián)合組大鼠腎組織CAT 水平顯著上升(P<0.05,P<0.01),燈盞細(xì)辛組雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但呈上升趨勢(shì)。聯(lián)合組大鼠腎組織CAT 水平比依帕司他組、燈盞細(xì)辛組顯著上升(P<0.01)。見(jiàn)表4。

    表4 各組大鼠CAT水平比較(±s,U/mg)

    表4 各組大鼠CAT水平比較(±s,U/mg)

    注:與正常對(duì)照組比較,△△P<0.01;與模型組比較,☆P<0.05,☆☆P<0.01;與依帕司他組比較,◇◇P<0.01;與燈盞細(xì)辛組比較,□□P<0.01。

    CAT 54.3±3.6 18.6±2.6△△25.7±7.2△△☆25.6±5.0△△40.2±9.3△△☆☆◇◇□□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

    2.5 各組大鼠SOD水平比較

    SOD 是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo),其水平可反映機(jī)體對(duì)氧自由基清除的能力[8]。與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠和各給藥組腎組織SOD 水平降低(P<0.01);與模型組比較,依帕司他組、燈盞細(xì)辛組和聯(lián)合組大鼠腎組織SOD 水平顯著上升(P<0.01);聯(lián)合組大鼠腎組織SOD 水平比依帕司他組、燈盞細(xì)辛組顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表5。

    表5 各組大鼠SOD水平比較(±s,U/mg)

    表5 各組大鼠SOD水平比較(±s,U/mg)

    注:與正常對(duì)照組比較,△△P<0.01;與模型組比較,☆☆P<0.01;與依帕司他組比較,◇P<0.05;與燈盞細(xì)辛組比較,□P<0.05。

    SOD 128.1±4.3 50.9±3.7△△87.7±5.7△△☆☆73.3±7.4△△☆☆109.1±7.5△△☆☆◇□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

    2.6 各組大鼠MDA水平比較

    MDA 含量與腎組織損傷程度呈正相關(guān),是典型的過(guò)氧化代謝產(chǎn)物[9]。與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠和各給藥組腎組織MDA 水平上升(P<0.01);與模型組比較,依帕司他組、燈盞細(xì)辛組和聯(lián)合組大鼠腎組織MDA 水平顯著下降(P<0.01);聯(lián)合組大鼠腎組織MDA 水平比依帕司他組、燈盞細(xì)辛組顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表6。

    表6 各組大鼠MDA水平比較(±s,nmol/mg)

    表6 各組大鼠MDA水平比較(±s,nmol/mg)

    注:與正常對(duì)照組比較,△△P<0.01;與模型組比較,☆☆P<0.01;與依帕司他組比較,◇P<0.05;與燈盞細(xì)辛組比較,□P<0.05。

    MDA 1.4±0.3 4.0±0.5△△3.0±0.3△△☆☆3.2±0.3△△☆☆2.0±0.7△△☆☆◇□組別正常對(duì)照組模型組依帕司他組燈盞細(xì)辛組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10

    3 討論

    氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)病的主要作用機(jī)制,體內(nèi)蓄積大量的氧化應(yīng)激產(chǎn)物損傷了臟器[10-11]。氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)包括CAT、SOD 和MDA,其中SOD可調(diào)節(jié)機(jī)體氧化與抗氧化的平衡,避免細(xì)胞發(fā)生損傷,其活性的下降是機(jī)體氧化應(yīng)激的主要生物指標(biāo)[8];CAT 是機(jī)體防御系統(tǒng)的主要自由基清除劑,其主要能夠清除過(guò)氧化氫,達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[7];MDA是臨床上常用來(lái)反映機(jī)體氧化應(yīng)激程度的標(biāo)志物,其含量的升高會(huì)導(dǎo)細(xì)胞損傷加重[9]。本研究結(jié)果表明,模型組大鼠腎組織CAT和SOD活性顯著下降,MDA 含量顯著上升,提示模型組大鼠腎功能出現(xiàn)了明顯損傷。給予燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他治療后,腎組織SOD、CAT活性升高,MDA 含量下降,且作用效果顯著優(yōu)于單一給藥治療,表明燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他可上調(diào)CAT、SOD水平,降低MDA 含量,提示其可減輕糖尿病腎病大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激,發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

    氧化應(yīng)激與高血糖、腎功能均緊密相連[12],有研究表明CAT 活性表達(dá)與血糖水平密切相關(guān)[13-14],且高血糖是糖尿病腎病早期常見(jiàn)的并發(fā)癥,尿液出現(xiàn)微量白蛋白是糖尿病早期可能出現(xiàn)的特征性癥狀,及時(shí)控制糖尿病腎病高血糖和微量白蛋白含量是延緩糖尿病腎病病情發(fā)展的最重要環(huán)節(jié)[12,15-16]。本研究表明,糖尿病模型造模成功后2 周,模型組和各給藥組大鼠的血糖值均>16.7 mmol/L 且24 h UmAlb 均大于30 mg,提示發(fā)生了糖尿病腎病。治療過(guò)程中,聯(lián)合組大鼠空腹血糖和24 h UmAlb 水平呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì),體質(zhì)量呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì),且與正常大鼠的水平最接近。聯(lián)合給藥的降糖、減少尿蛋白的效果顯著強(qiáng)于單一給藥組。提示燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他可發(fā)揮協(xié)同作用,降低大鼠的空腹血糖和提高腎功能,對(duì)糖尿病腎病有一定的干預(yù)作用。

    4 結(jié)論

    綜上所述,燈盞細(xì)辛聯(lián)合依帕司他能明顯改善糖尿病腎病大鼠CAT、SOD、MDA 水平,提示其可能通過(guò)上調(diào)CAT、SOD 表達(dá),降低MDA 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控糖尿病腎病氧化應(yīng)激,改善機(jī)體血糖水平和腎臟功能,延緩病情發(fā)展,保護(hù)腎臟。

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