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    加味二陳湯誘導(dǎo)肺癌A549移植瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

    2023-10-29 06:50:50吳國玉何粒芳柯見龍熊紹權(quán)
    中醫(yī)藥信息 2023年10期
    關(guān)鍵詞:二陳湯內(nèi)質(zhì)網(wǎng)低劑量

    吳國玉,何粒芳,柯見龍,熊紹權(quán)

    (成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610072)

    肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[1],其中非小細(xì)胞肺癌是最常見的病理類型。中醫(yī)藥治療肺癌有著扶正抑瘤并且無明顯毒副作用的優(yōu)勢。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌多有痰濕之證,如痰濁滯肺、痰瘀阻肺、痰熱壅肺等[2-3]。有研究認(rèn)為,痰證是肺癌最主要的中醫(yī)證型[4]。臨床常以二陳湯基于理氣化痰理論來治療肺癌,或以該方為基礎(chǔ)方進(jìn)行化裁,對晚期肺癌具有較好的治療效果[5-6]。因此,本研究采用動物實(shí)驗(yàn)研究加味二陳湯抗腫瘤的效果,并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

    腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有著十分密切的關(guān)系,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶高表達(dá)是腫瘤發(fā)生的早期事件[7];過強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,會損害UPR 機(jī)制,調(diào)控分子伴侶蛋白,而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR 機(jī)制,可啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡信號,起到逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,增強(qiáng)腫瘤治療的療效[8]。因此,加味二陳湯的抗肺癌作用是否與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑有關(guān)?本研究對加味二陳湯可能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)也做了初步探討。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物和細(xì)胞株

    SPF 級雄性BALB/C 裸鼠[四川科倫藥物研究院有限公司,合格證號:SYXK(川)2013-184],18 只,5 周齡,體質(zhì)量(20±2)g,飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(溫度20 ℃、濕度40%)。肺腺癌A549 細(xì)胞株由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

    加味二陳湯組方:陳皮15 g,生姜10 g,天南星15 g,甘草5 g,川芎10 g,法半夏10 g,茯苓10 g;藥材由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。將藥物放入砂鍋中,用清水浸泡半小時以上,煎煮20 min,煎好的藥汁倒入碗中備用,用同樣的方法再煎煮一次,然后將兩次煎液混勻、過濾,經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至濃度為4 g/mL,4 ℃保存?zhèn)溆?。中藥低劑量組以成人每日常規(guī)劑量為準(zhǔn),高劑量組以成人每日常規(guī)劑量的2 倍為準(zhǔn)(依據(jù)“人與動物體表面積折算表”計(jì)算裸鼠的等效劑量)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

    ATF4、CHOP、GAPDH 一抗(Sigma 公司,產(chǎn)品批號SAB2105294、SAB4500631、G9295)濃度分別為1∶500、1∶500、1∶50 000;水合氯醛(上海凌峰化學(xué)有限公司);TUNEL 試劑盒(羅氏公司,批號:11767291910);SDSPAGE凝膠快速制備試劑盒;BCA蛋白濃度測定試劑盒。

    1.4 實(shí)驗(yàn)器材及耗材

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);DH36001B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司);Pipet-Lite XLS + 手動單道移液器(RAININ 瑞寧);AXTDL5M-Ⅱ臺式低速冷凍離心機(jī)(鹽城市安信實(shí)驗(yàn)器械有限公司);水域恒溫振蕩器(上海天進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);酶標(biāo)儀(美國biotek 公司);MILLED 型普通光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)。

    2 方法

    2.1 構(gòu)建A549肺腺癌移植瘤裸鼠模型

    將DMEM 培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,并將人肺腺癌A549細(xì)胞加入培養(yǎng)液。待A549細(xì)胞融合度達(dá)80%~90%,按 1∶3 分瓶傳代培養(yǎng),制備單細(xì)胞懸液。取處于對數(shù)生長期的A549肺癌細(xì)胞,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,以臺盼蘭檢測確保死細(xì)胞數(shù)<5%。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個/mL,于裸鼠于右腋皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液(接種量1×106個/mL)。

    2.2 分組及給藥

    所有裸鼠接種4 d后均成瘤,10 d后裸鼠皮下瘤結(jié)節(jié)達(dá)3~4 mm。將18 只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為對照組、加味二陳湯低劑量組(簡稱中藥低劑量組)、加味二陳湯高劑量組(簡稱中藥高劑量組),每日灌胃0.2 mL 生理鹽水和13、26 g/(kg·d)二陳湯水煎液,每天1 次,連續(xù)給藥21 d。

    2.3 檢測指標(biāo)

    單細(xì)胞混懸液皮下注射成功后,用游標(biāo)卡尺每隔4 d 測量裸鼠皮下瘤結(jié)節(jié),即分別于第1、5、9、13、17、21天測量腫瘤長徑(a)、短徑(b)。

    瘤重:給藥21 d后,處死裸鼠,剝離腫瘤稱取瘤重。

    腫瘤生長抑制率(%)=(對照組平均瘤重 -治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%

    腫瘤體積V=1/2×a×b2

    2.4 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)

    腫瘤組織解凍裂解,離心取上清,提取總蛋白,測定待測樣品蛋白濃度,各組蛋白溶液按順序每孔上樣,電泳分離切割目標(biāo)蛋白,將PVDF 膜浸入甲醇中,將目標(biāo)蛋白和PVDF 膜疊放到一起,搖床緩慢搖動1 h;加入一抗(ATF4 1∶500;CHOP 1∶500),24 ℃孵育2 h;脫色搖床浸洗,二抗孵育37 ℃孵育;ECL 底物發(fā)光;暗室中曝光,掃描膠片,用凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描分析,以GAPDH內(nèi)參為對照。

    2.5 TUNEL法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡率

    將腫瘤組織置入胰蛋白酶K中固定后脫水、包埋、切片,分別加入TUNEL混合液、3號液反應(yīng),DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫脂、封片,每張切片選取5個400倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。

    凋亡率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPrism6.0、SPSS21.0、ImageJ 等軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。資料采用±s表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較用LSD 法。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 各組小鼠腫瘤生長曲線、瘤重、抑瘤率的比較

    中藥低劑量組和中藥高劑量組裸鼠腫瘤的生長速度、腫瘤體積、瘤重,與對照組比較均顯著改善。中藥低劑量組與中藥高劑量組抑瘤率分別為21.4%、37%,表明加味二陳湯能明顯抑制A549腫瘤生長及瘤重,且與劑量存在量效關(guān)系。結(jié)果見圖1和表1。

    表1 各組腫瘤體積、腫瘤瘤重、抑瘤率的比較(±s,n =6)

    表1 各組腫瘤體積、腫瘤瘤重、抑瘤率的比較(±s,n =6)

    注:與中藥低劑量組比較,#P<0.05;與對照組比較,*P<0.05。

    組別對照組中藥低劑量組中藥高劑量組腫瘤體積/mm3 1 450.90±319.20 1 166.20±363.90 889.60±280.60#瘤重/g 1.03±0.14 0.81±0.09*0.68±0.08*抑瘤率/%0.00 21.40 37.00

    圖1 各組裸鼠腫瘤生長曲線

    3.2 各組小鼠腫瘤凋亡率,ATF4、CHOP 蛋白相對表達(dá)量的比較

    中藥高劑量組和中藥低劑量組腫瘤凋亡率,ATF4、CHOP蛋白相對表達(dá)量均較對照組改善,且中藥高劑量組的改善情況優(yōu)于中藥低劑量組。結(jié)果見表2~3,圖2。

    表2 各組腫瘤凋亡率比較(±s)

    表2 各組腫瘤凋亡率比較(±s)

    注:與對照組比較,*P<0.05。

    組別對照組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6凋亡率/%23±5 29±5 35±6*

    表3 各組ATF4、CHOP蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    表3 各組ATF4、CHOP蛋白相對表達(dá)量比較(±s)

    注:與對照組比較,*P<0.05。

    組別對照組中藥低劑量組中藥高劑量組CHOP 0.39±0.08 0.53±0.08*0.82±0.09*n6 6 6 ATF4 0.35±0.06 0.52±0.08*0.73±0.06*

    圖2 各組ATF4、CHOP蛋白表達(dá)水平

    TUNEL 法檢測裸鼠腫瘤組織,凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕色,為陽性細(xì)胞,非凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)色,見圖3。

    圖3 各組裸鼠腫瘤組織原位細(xì)胞凋亡檢測

    4 討論

    在肺癌治療中,中醫(yī)藥治療有扶正抑瘤、降低放化療毒副作用、改善患者生活質(zhì)量等優(yōu)勢[9]。研究證實(shí),中醫(yī)藥可以通過多種途徑,抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,并且可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[10-11]。中晚期肺癌屬本虛標(biāo)實(shí),本虛多為氣虛為主,標(biāo)實(shí)以痰濕多見。百病皆因痰起,故肺癌治療中化濕祛痰尤為重要。國醫(yī)大師周岱翰教授[12]認(rèn)為,癌腫發(fā)生,皆因痰作祟。臨床上肺癌患者痰瘀搏結(jié)則常常表現(xiàn)為咯血胸痛、咳嗽氣促;痰濁蒙蔽清竅則容易發(fā)生肺癌腦轉(zhuǎn)移。諸多研究表明,化痰之品能增加腫瘤細(xì)胞間的黏附能力,抑制腫瘤細(xì)胞向基質(zhì)及血管侵襲,通過影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[13-14]。

    二陳湯常被稱為祛痰之通劑,可通過健脾和胃、理氣以化痰。臨床以二陳湯化裁,治療因“痰”引起的各種病癥,包括肺癌[15-16]。加味二陳湯在原方基礎(chǔ)上加用川芎、天南星和生姜,為治療濕痰流注之主方。該方以半夏、南星為君,化痰散結(jié);陳皮、川芎理氣化痰;茯苓健脾去濕,濕去則脾旺,脾旺則痰無由以生;炙甘草調(diào)和諸藥,兼潤肺和中。全方標(biāo)本兼治,共奏理氣健脾、化痰散結(jié)之功效。有研究報(bào)道,二陳湯聯(lián)合鉑類化療不僅可以直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖,還可通過干預(yù)VEGF/VEGFR-2 分子影響血管生成因子而間接抑制腫瘤細(xì)胞生長[17]。還有研究將二陳湯分別與不同療效的中藥聯(lián)用后發(fā)現(xiàn),二陳湯可增高脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、外周血細(xì)胞及免疫細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+[18]。林洪生教授[19]認(rèn)為痰與瘀邪毒侵肺是導(dǎo)致癌癥的病理產(chǎn)物,痰瘀互結(jié),脈絡(luò)瘀阻,血不循經(jīng)從而溢于脈外,肺失宣發(fā)肅降、痰濕阻肺,故臨證可見咳嗽氣促、痰中帶血等,并擅長使用二陳湯作為底方加減運(yùn)用治療并取得較好效果。二陳湯加減方聯(lián)合鉑類化療可改善患者肺癌相關(guān)癥狀如咳嗽、咯血等,還可以緩解疲倦、失眠、脫發(fā)等其他癥狀,修復(fù)化療引起的免疫損傷[20]。

    本研究結(jié)果顯示,加味二陳湯可誘導(dǎo)人肺腺癌A549 細(xì)胞的凋亡,且呈濃度及時間依賴性,在中藥高劑量組更加明顯,且隨著藥物作用時間延長誘導(dǎo)肺腺癌A549 細(xì)胞的凋亡的效果更加明顯。為進(jìn)一步探究其機(jī)制,筆者采用Western blot 檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),加味二陳湯低劑量組和高劑量組ATF4、CHOP 蛋白相對表達(dá)量較對照組均增高,且呈劑量正相關(guān)關(guān)系。由此可見,加味二陳湯抑制肺癌移植瘤生長,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡其機(jī)制可能與誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ATF4、CHOP 蛋白的上調(diào)機(jī)制從而完成其體外抗癌的作用有關(guān)。TUNEL 檢測實(shí)驗(yàn)中對照組亦呈現(xiàn)一定程度的凋亡率,當(dāng)然這并不排除TUNEL 在檢測過程中,操作損傷細(xì)胞和壞死細(xì)胞當(dāng)作了凋亡細(xì)胞,此外腫瘤細(xì)胞自我更新快,生長繁殖活躍,也存在一定數(shù)量的凋亡率。

    5 結(jié)論

    加味二陳湯可能通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白ATF4、CHOP 的表達(dá)而有效肺腺癌A549 移植瘤的生長并誘導(dǎo)其凋亡,且加味二陳湯抑制肺腺癌A549移植瘤的強(qiáng)度可能與中藥的藥物濃度呈正相關(guān)。

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