紫羅蘭基因組DNA 快速提取方法的研究

張海梅, 陳道宗, 譚晨

(贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江西 贛州 341000)

紫羅蘭 [Matthiolaincana(L.) R.Br.] 是十字花科紫羅蘭族紫羅蘭屬植物, 原產(chǎn)于歐洲大陸地中海沿岸, 其花色豐富、花量大、花期長(zhǎng)、株型多樣、耐低溫、應(yīng)用場(chǎng)景多樣[1-2], 是一種市場(chǎng)前景良好的觀賞植物。目前, 紫羅蘭的優(yōu)良品種主要依賴進(jìn)口, 國(guó)產(chǎn)優(yōu)良品種極少。因此, 國(guó)產(chǎn)紫羅蘭新品種的培育亟待加強(qiáng)。

紫羅蘭的現(xiàn)代化遺傳育種研究離不開基因組DNA 的提取, 比如分子標(biāo)記定位、分子標(biāo)記輔助選擇、遺傳多樣性研究等。根據(jù)研究目的不同, 對(duì)基因組DNA 的質(zhì)量和數(shù)量要求也不同, 常用的DNA 基因組的提取方法有十六烷基三甲基溴化銨法 (CTAB 法)[3-4]、十 二 烷 基 苯 磺 酸 鈉 (SDS)法[5-6]、堿 處 理 法[7]、高 溫 水 煮 法[8-9]等, 其 中,CTAB 法因其提取的DNA 產(chǎn)量高、純度好而被廣泛使用, 但其提取過(guò)程繁瑣、耗時(shí)耗力, 且用到了氯仿等有毒有害試劑, 不能滿足育種實(shí)踐中大樣本量的實(shí)驗(yàn)需求?，F(xiàn)已報(bào)道了在擬南芥、水稻、玉米、小麥等植物中的快速基因組提取方法[9-14], 可以用于大規(guī)?；蚪MDNA 的提取。

借鑒已有的快速提取植物基因組DNA 的方法[8-10], 本研究對(duì)高溫水煮法進(jìn)行了簡(jiǎn)化處理, 建立了一種適用于紫羅蘭基因組DNA 快速提取的方法 (即快速法), 可以簡(jiǎn)單、快速地大規(guī)模提取可高效擴(kuò)增的紫羅蘭基因組DNA, 為紫羅蘭分子育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用材料有和諧系列紫羅蘭色紫羅蘭(樣品1)、輝煌系列桃粉色紫羅蘭 (樣品2) 和凱斯系列紫色紫羅蘭 (樣品3), 3 個(gè)實(shí)驗(yàn)材料均在植物光照培養(yǎng)箱種植 (溫度: 23 ℃; 光照: 16 h;黑暗: 8 h), 播種后約3 周取幼嫩的真葉為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 紫羅蘭基因組DNA 提取方法

1.2.1 CTAB 法

取0.1 g 新鮮的葉片于2.0 mL 離心管中, 加600 μL 2% CTAB 提取液 [NaCl 81.9 g, Tris-HCl(1.0 mol·L-1, pH 值 為8.0) 100 mL, EDTA(0.5 mol·L-1, pH 值為8.0) 40 mL 和20 g CTAB定容至1 000 mL] 充分研磨; 于65 ℃水浴鍋中水浴60 min, 每10～15 min 輕輕搖晃一次; 冷卻后加入600 μL 體積比為24 ∶1 的氯仿/異戊醇, 輕輕搖勻, 12 000 r·min-1離心10 min; 吸取300 mL上清液于1.5 mL 的離心管中, 加600 μL 的冰乙醇,-20 ℃靜置30 min, 12 000 r·min-1離心5 min, 棄上清; 加500 μL 75%的乙醇漂洗, 12 000 r·min-1離心5 min, 重復(fù)3 次, 棄上清, 晾干; 加100 μL 1% RNA 酶溶液溶解, 置于37 ℃恒溫箱中1 h 以上, 其間時(shí)常搖晃, 測(cè)其濃度以及用瓊脂糖凝膠電泳檢查基因組DNA。

1.2.2 高溫水煮法

參照許明等[9]介紹方法, 并作部分改動(dòng)。取0.1 g 新鮮的葉片于2.0 mL 離心管中, 加600 μL DNA 提 取 緩 沖 液 (100 mmol·L-1Tris, pH 值 為8.0; 50 mmol·L-1EDTA; 500 mmol·L-1NaCl)充分研磨; 沸水煮10 min, 12 000 r·min-1離心10 min; 吸取300 μL 上清液于1.5 mL 的離心管中, 加600 μL 的冰乙醇, -20 ℃靜置30 min,12 000 r·min-1離心5 min, 棄上清; 加500 μL 75%的乙醇漂洗, 12 000 r·min-1離心5 min, 重復(fù)3次, 棄上清, 晾干; 加100 μL 1% RNA 酶溶液溶解, 置于37 ℃恒溫箱中1 h 以上, 期間時(shí)常搖晃,測(cè)其濃度以及用瓊脂糖凝膠電泳檢查所提DNA。

1.2.3 快速法

取0.1 g 新鮮的葉片于2.0 mL 離心管中, 加600 μL DNA 提取緩沖液 (100 mmol·L-1Tris, pH值為8.0; 50 mmol·L-1EDTA; 500 mmol·L-1NaCl) 充分研磨; 沸水煮10 min, 12 000 r·min-1離心10 min; 吸取100 μL 上清液于1.5 mL 的離心管中, 稀釋20 倍, 即可用作PCR 反應(yīng)的DNA模板。

1.3 DNA 質(zhì)量檢測(cè)方法

1.3.1 DNA 濃度及純度測(cè)定

用超微量分光光度計(jì) (Nanodrop 2 000 C) 測(cè)定提取的紫羅蘭基因組DNA 的濃度和光譜數(shù)據(jù)。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

CTAB 法和高溫水煮法提取的紫羅蘭基因組DNA, 樣品1、樣品2 和樣品3 各取4 μL, 加2 μL Loading buffer, 用1%的瓊脂糖凝膠電泳, 通過(guò)凝膠成像儀觀測(cè)結(jié)果。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增

采用10 μL 的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 反應(yīng)體系中: 2×Taqmaster mix (Vazyme) 5 μL、DNA 模板DNA (約50 ng·μL-1) 2 μL、紫 羅 蘭 內(nèi) 參 基 因Actin引物[15]上游引物 (5′-GTGAGATACACCATCAC CAGAATC-3′) 和 下 游 引 物 (5′-TAAAGTATCCAA TCGAGCATGGTA-3′) 各0.5 μL (10 μmol·L-1),ddH2O 2 μL。擴(kuò)增體系為: 95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,35 個(gè)循環(huán); 最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳, 凝膠成像儀下觀測(cè)結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫水煮法提取的DNA 產(chǎn)量和純度分析

為了探究高溫水煮法提取的紫羅蘭DNA 產(chǎn)量和純度, 以CTAB 法為對(duì)照進(jìn)行了比較, 兩種方法提取的紫羅蘭基因組DNA 的濃度和光譜數(shù)據(jù)如表1 所示, 盡管實(shí)驗(yàn)組高溫水煮法提取的DNA 濃度顯著低于對(duì)照組CTAB 法提取的 (P<0.05), 但其濃度也均大于1 000 ng·μL-1, 平均達(dá)到1 982.3 ng·μL-1, 能夠滿足一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果顯示, 對(duì)照組CTAB 法提取的紫羅蘭基因組DNA 的D260/D280均大于1.8,D260/D230均在2.00～2.20, 說(shuō)明DNA 純度高。高溫水煮法提取的DNA 光譜數(shù)據(jù)與對(duì)照組相當(dāng), 表明所獲得的DNA 沒(méi)有蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的影響,也沒(méi)有碳水化合物、鹽 (胍鹽) 等污染物。

表1 紫羅蘭基因組DNA 檢測(cè)結(jié)果

2.2 DNA 質(zhì)量分析

將提取的紫羅蘭基因組DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果如圖1 所示。從圖中可以看出, 對(duì)照組CTAB 法提取的紫羅蘭基因組DNA 中, 條帶清晰, 無(wú)明顯拖帶現(xiàn)象, 表明DNA 完整性較好。實(shí)驗(yàn)組高溫水煮法提取的DNA 中, 條帶4 和5 明亮清晰, 表明DNA 濃度較高; 無(wú)明顯拖帶現(xiàn)象,表明完整性好; 條帶6 較暗, 可能是DNA 濃度較低, 與表1 濃度結(jié)果一致, 也無(wú)明顯拖帶現(xiàn)象, 表明完整性也較好。因此, 高溫水解法提取的基因組DNA 完整性與對(duì)照組CTAB 法相當(dāng)。

圖1 CTAB 法與高溫水煮法提取物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 PCR 分析

將提取的紫羅蘭基因組DNA 稀釋至50 ng·μL-1后, 采用紫羅蘭內(nèi)參基因Actin引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2 所示。從圖中可以看出, 實(shí)驗(yàn)組高溫水煮法和對(duì)照組CTAB 法提取的DNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果相同, 電泳條帶均清晰、穩(wěn)定, 條帶大小均在250～500 bp,與預(yù)期片段大小一致, 表明高溫水煮法提取的DNA 成功用于PCR 反應(yīng)。

圖2 CTAB 法與高溫水煮法提取DNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以上結(jié)果表明, 與對(duì)照組CTAB 法相比, 實(shí)驗(yàn)組高溫水煮法能夠獲得產(chǎn)量足夠, 且質(zhì)量相當(dāng)?shù)淖狭_蘭基因組DNA。此外, 在操作步驟上, 高溫水煮法只需沸水浴10 min 后即可進(jìn)行后續(xù)的離心、吸上清液、沉淀、漂洗等步驟, 而CTAB 法則需要水浴 (65 ℃) 60 min 后加入氯仿/異戊醇溶液后再進(jìn)行離心、吸上清液、沉淀、漂洗等步驟 (詳見實(shí)驗(yàn)方法)。因此, 與對(duì)照組CTAB 法相比, 實(shí)驗(yàn)組高溫水煮法操作更簡(jiǎn)單、所需時(shí)間更短, 且無(wú)需使用有毒有害的試劑, 產(chǎn)生的廢液也更少。

2.4 快速法提取DNA 的PCR 擴(kuò)增效果

為了建立更加簡(jiǎn)潔、高效的基因組DNA 提取方法, 對(duì)高溫水煮法進(jìn)行了進(jìn)一步簡(jiǎn)化, 整個(gè)提取過(guò)程大概耗時(shí)30 min, 稱為快速法?？焖俜ㄖ饕菧p少了DNA 提取過(guò)程中的沉淀和漂洗環(huán)節(jié), 這樣勢(shì)必會(huì)降低DNA 的純凈度, 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn) (表2), 即D260/D230均很小, 表明溶液中還有較多的碳水化合物、鹽類或有機(jī)化合物, 但其濃度較高 (平均1 171.3 ng·μL-1)。因此, 將其稀釋20 倍后再作為DNA 模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 這樣既降低了雜質(zhì)的含量, 又可以使DNA 濃度達(dá)到PCR 模板的要求。隨后, 以快速法提取的DNA 的20 倍稀釋液為模板來(lái)擴(kuò)增內(nèi)參基因Actin的片段, 并用CTAB 法提取的DNA 為對(duì)照, PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖3 所示。結(jié)果表明, 快速法提取的DNA 稀釋液作模板能擴(kuò)增出與對(duì)照組一致的清晰穩(wěn)定的條帶, 且條帶大小符合預(yù)期 (250～500 bp)。說(shuō)明用快速法提取紫羅蘭基因組DNA 稀釋20 倍后能很好地滿足一般PCR反應(yīng)的需求。

圖3 DNA 稀釋20 倍后的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表2 快速法提取紫羅蘭基因組DNA 原液檢測(cè)結(jié)果

2.5 快速法提取DNA 的保存時(shí)間

為了探究快速法提取的DNA 的保存時(shí)間, 將在-20 ℃冰箱保存了3 個(gè)月后的DNA 原液稀釋20倍后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 結(jié)果顯示, 其仍然可擴(kuò)增出清晰可見的條帶 (圖4)。表明快速法提取的紫羅蘭基因組DNA 在-20 ℃下至少能夠保存3 個(gè)月,完全能夠滿足一般分子實(shí)驗(yàn)的周期要求。

圖4 保存3 個(gè)月后DNA 稀釋20 倍的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

CTAB 法是抽提基因組DNA 最常用的方法,該方法提取的DNA 產(chǎn)量高、純度好[4]; 但其提取過(guò)程中使用了有毒有害試劑氯仿等, 且抽提過(guò)程需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行, 提取過(guò)程操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)。而高溫水煮法提取DNA 過(guò)程中沒(méi)有用到有毒有害的試劑, 且提取過(guò)程耗時(shí)相對(duì)較短, 因此, 該方法可用于對(duì)DNA 純度要求不高的實(shí)驗(yàn)中, 用其來(lái)取代CTAB 法中對(duì)人體有害的試劑的提取方法[9-10]。本研究中, 以CTAB 法為對(duì)照, 比較了高溫水煮法提取紫羅蘭基因組DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量, 結(jié)果表明,高溫水煮法提取的DNA 產(chǎn)量低于CTAB 法, 但質(zhì)量相當(dāng)。因此, 可以用無(wú)危險(xiǎn)試劑、操作簡(jiǎn)單的高溫水煮法來(lái)替代有危險(xiǎn)試劑、操作繁瑣的CTAB 法提取紫羅蘭基因組DNA。

進(jìn)一步, 本研究簡(jiǎn)化了高溫水煮法, 即舍棄沉淀和漂洗的過(guò)程, 建立了快速法, 縮短了提取的時(shí)間, 操作步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少。提取紫羅蘭基因組DNA 稀釋20 倍后, PCR 擴(kuò)增結(jié)果與CTAB 法提取的DNA 擴(kuò)增結(jié)果一致?？焖俜ㄔ诟邷厮蠓ǖ幕A(chǔ)上減少了沉淀和漂洗的過(guò)程, 縮短了提取的時(shí)間, 操作步驟簡(jiǎn)單、耗時(shí)少, 可大幅節(jié)約時(shí)間, 提高工作效率[12-13]; 也減少了試劑的使用, 節(jié)約成本。此外, 快速法提取的紫羅蘭基因組DNA 保存時(shí)間較久, 可以滿足一般實(shí)驗(yàn)周期的要求。因此,快速法特別適用于樣本量大的基因型鑒定類的實(shí)驗(yàn), 如分子標(biāo)記輔助選擇育種、轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗鑒定等; 此外, 利用高通量磨樣機(jī)、96 孔板及相關(guān)配套設(shè)備等可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；腄NA 提取[14]。