三葉青品質(zhì)評(píng)價(jià)與產(chǎn)地鑒別技術(shù)研究進(jìn)展

朱思蓓, 聶晶, 李春霖, 邵圣枝, 張永志, 袁玉偉, 陶益, 王鈁*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所, 浙江 杭州 310021; 2.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院, 浙江 杭州 310014;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 杭州 310021)

三葉青 (TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)隸屬于葡萄科崖爬藤屬, 又名蛇附子、石猴子、金線吊葫蘆等, 是我國(guó)特有的民間藥用植物。三葉青以塊根或全草入藥, 具有抗腫瘤、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等功能[1]。根據(jù)根部藤表皮顏色差異可分為紫藤三葉青和青藤三葉青: 紫藤三葉青主要分布于緯度37.3°以北的江西、浙北地區(qū); 青藤三葉青主要分布于我國(guó)緯度27.3°以南的福建、湖南、四川、廣東、廣西、云南的部分地區(qū)[2]。不同產(chǎn)地的三葉青化學(xué)成分和微量元素含量有所差異, 對(duì)臨床療效產(chǎn)生影響, 調(diào)查發(fā)現(xiàn), 江浙地區(qū)的三葉青提取物在抑制癌細(xì)胞增殖、解熱等方面較西南地區(qū)具有明顯優(yōu)勢(shì)[3]。

因三葉青在抗腫瘤方面具有顯著療效, 其產(chǎn)業(yè)在近十年間有了迅速的發(fā)展, 但同時(shí)也出現(xiàn)了一些問(wèn)題。傳統(tǒng)中醫(yī)理論均以三葉青塊根入藥, 導(dǎo)致三葉青地上部分的浪費(fèi), 降低了生物利用率[4]。此外, 隨著市場(chǎng)需求的擴(kuò)大, 野生三葉青資源被過(guò)度挖掘而人工栽培水平不足導(dǎo)致的引種混亂問(wèn)題使得三葉青的藥理活性大大降低, 影響了市場(chǎng)上三葉青的品質(zhì)與價(jià)格。再者, 該藥至今未被收錄進(jìn) 《中華人民共和國(guó)藥典》, 無(wú)法以傳統(tǒng)的中藥材鑒別方法對(duì)三葉青建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此, 需要通過(guò)有效的產(chǎn)地鑒別方法建立起完善的三葉青產(chǎn)地溯源體系, 以區(qū)分市場(chǎng)上不同產(chǎn)地的三葉青品種, 選用優(yōu)質(zhì)三葉青品種入藥, 以提高臨床療效[5]。本研究綜述了三葉青的有效成分、功效、產(chǎn)地情況, 介紹了可用于三葉青的多種產(chǎn)地溯源技術(shù), 以期為建立有序的三葉青產(chǎn)地溯源體系提供參考。

1 化學(xué)成分

1.1 主要功能性成分

1.1.1 黃酮類(lèi)化合物及其糖苷

黃酮類(lèi)化合物及其糖苷是三葉青中的功能性成分之一, 也是目前研究得較為系統(tǒng)的一類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)主要存在形式為黃酮類(lèi)、黃酮醇類(lèi)、黃烷類(lèi)、二氫黃酮類(lèi)及其糖苷, 少量以異黃酮類(lèi)的形式存在[6]。孫夢(mèng)佳等[7]通過(guò)三葉青的乙醇冷浸液進(jìn)行UPLC-Q-Exactive 獲取分析數(shù)據(jù), 采用MDF 篩選方法共鑒定出金絲桃苷、紫云英苷等41 個(gè)黃酮類(lèi)化合物。鄧思珊等[8]通過(guò)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)三葉青葉化學(xué)成分進(jìn)行鑒定, 鑒別出了異葒草素、葒草素、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、異牡荊素等5 種成分。孫崇魯?shù)萚9]運(yùn)用超高效液相色譜-電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)三葉青地上部分進(jìn)行分析, 鑒別出了槲皮苷、山柰苷、蘆丁等22 個(gè)黃酮類(lèi)化學(xué)成分。

黃酮類(lèi)化合物具有抗腫瘤、消炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗氧化等功能, 因此, 作為三葉青藥理藥效研究的一大重點(diǎn)[10]。林鈺久等[11]研究證明, 三葉青黃酮可明顯降低荷Lewis 肺癌小鼠Treg 細(xì)胞比例,提高免疫功能, 抑制移植瘤的生長(zhǎng), 可用于臨床抗肺癌的治療。汪正飛等[12]通過(guò)對(duì)三葉青總黃酮對(duì)人肝癌細(xì)胞HEPG-2 裸鼠異種移植瘤生長(zhǎng)體積和生長(zhǎng)情況的研究, 證實(shí)了其具有抗肝癌的作用。杜闖研究表明, 三葉青總黃酮可能通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期, 調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)的機(jī)制來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖和侵襲。廖淑彬等[14]通過(guò)小鼠耳、足腫脹急性炎癥模型驗(yàn)證了總黃酮類(lèi)化合物的消炎作用, 同時(shí)用扭體法和熱板法驗(yàn)證了總黃酮類(lèi)化合物的鎮(zhèn)痛作用。黃真等[15]通過(guò)干酵母制熱法和2, 4-二硝基苯酚致熱法等驗(yàn)證了三葉青提取物具有一定的解熱作用。

1.1.2 多糖

多糖是廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中的重要天然化合物之一, 起著至關(guān)重要的作用, 也是三葉青的另一類(lèi)功能性成分。訾豪然等[16]用PMP 柱前衍生化-HPLC 法和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析測(cè)定了三葉青中單糖含量與組成比例, 建立了三葉青多糖圖譜, 結(jié)果表明, 三葉青中甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量較高。饒君鳳等[17]通過(guò)離子色譜-脈沖安培法 (IC-PAD) 測(cè)得三葉青塊根和葉中多糖均含有巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖這6 種單糖組分。

目前對(duì)多糖的藥理活性研究還是不夠深入, 主要集中在其抗腫瘤作用和抗氧化活性方面: 郭南通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明, 三葉青根多糖RTP 可能通過(guò)降低細(xì)胞線粒體膜電勢(shì)的線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)顯著抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞的增殖。銀喆通過(guò)維生素C、BHT 以及黃芪多糖、枸杞多糖作為三葉青多糖的對(duì)照說(shuō)明了三葉青多糖同樣具有抗氧化的功能。李萍等[20]通過(guò)建立小鼠免疫性肝損傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 說(shuō)明多糖抗免疫性肝損傷的作用可能與糾正機(jī)體Treg/Th17 免疫失衡有關(guān)(表1)。

表1 文獻(xiàn)中已知的三葉青主要功能性成分

1.2 其他功能性成分

1.2.1 酚酸類(lèi)

酚酸類(lèi)化合物也是一種重要的植物化學(xué)物質(zhì),具有廣泛的生理活性, 包括抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性等。李江等[21]通過(guò)對(duì)三葉青藤乙醇提取液的正丁醇部位的分離純化得到了沒(méi)食子酸等酚酸化合物。Sun 等[22]通過(guò)不同溶劑首次從三葉青中提取出綠原酸、新綠原酸、1-咖啡?？鼘幩?、對(duì)香豆?？崴岬?3 種酚類(lèi)化合物。同時(shí)三葉青中還存在對(duì) 水 楊 酸、丁 香 酸、香 草 酸、異 香 草 酸 等 化合物[23-24]。

1.2.2 萜類(lèi)及甾體類(lèi)化合物

萜類(lèi)及甾體類(lèi)化合物同樣作為非常重要的植物成分。目前在三葉青中發(fā)現(xiàn)了蒲公英萜酮、蒲公英萜醇等三萜類(lèi)化合物以及β-谷甾醇、麥角甾醇、胡蘿卜苷、6′-O-苯甲酰基胡蘿卜苷等甾體類(lèi)化合物[25]。β-谷甾醇具有明顯的降膽固醇、降血糖、鎮(zhèn)咳、抗癌、抗炎等藥理作用[26], 具有很高的藥用價(jià)值但由于其含量在植物體內(nèi)過(guò)低, 在藥物開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用較為少見(jiàn), 需引起我們的重視。

1.2.3 揮發(fā)油和脂肪酸類(lèi)化合物

揮發(fā)油和脂肪酸類(lèi)化合物也廣泛存在于三葉青中。徐碩等[27]通過(guò)硅膠柱色譜、凝膠柱色譜等色譜分離方法對(duì)三葉青進(jìn)行分離得到-羥基-10, 12-十八碳二烯酸、(4R, 5R) -4-羥基-5-異丙基-2-甲基環(huán)己-2-烯酮、(4S, 5R) -4-羥基-5-異丙基-2-甲基環(huán)己-2-烯酮、(3R, 4R, 6S) -3, 6-二羥基-1-薄荷烯等4 個(gè)化學(xué)成分。張煜炯等[28]利用GC-MS 的分析方法鑒別出了2-癸烯、2-烯丙基-6-甲基苯酚等53 個(gè)揮發(fā)性成分 (表2)。

表2 文獻(xiàn)中已知的三葉青中其他功能性成分

2 產(chǎn)地溯源技術(shù)

2.1 中藥指紋圖譜技術(shù)

中藥指紋圖譜是通過(guò)一定的分析方法研究某些中藥材和中藥制劑并得到能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖的一種鑒定手段, 具有專(zhuān)屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)[29]。常用的中藥指紋圖譜技術(shù)有光譜指紋圖譜法和色譜指紋圖譜法兩種。三葉青作為 “新浙八味” 之一, 其有效化學(xué)成分黃酮類(lèi)和多糖類(lèi)具有抗腫瘤、抗癌的功效, 可用近紅外光譜技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)對(duì)其有效活性成分進(jìn)行測(cè)定, 以鑒別出不同產(chǎn)地的三葉青。

2.1.1 光譜指紋圖譜法

常用的光譜技術(shù)有紫外-可見(jiàn)光譜技術(shù)、紅外光譜技術(shù)、拉曼光譜技術(shù)、熒光光譜技術(shù)、核磁共振光譜技術(shù)等[30]。李穎[31]利用近紅外光譜技術(shù)獲取了來(lái)自浙江、福建、云南、湖南、貴州等5 個(gè)產(chǎn)地的三葉青在4 000～10 000 cm-1的近紅外圖譜,并定量地分析了黃酮和多糖的含量, 在分析時(shí)構(gòu)建了PLS-DA 分類(lèi)器模型和PLS 模型以提高不同產(chǎn)地三葉青樣品鑒別的準(zhǔn)確度。李穎[31]的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了近紅外光譜技術(shù)可以準(zhǔn)確地判別出不同產(chǎn)地的三葉青, 并對(duì)三葉青中的黃酮、多糖類(lèi)有效成分進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析, 為建立三葉青的品質(zhì)評(píng)價(jià)體系提供了一定的理論基礎(chǔ)。

2.1.2 色譜指紋圖譜法

常見(jiàn)的色譜指紋圖譜法有高效液相色譜法、氣相色譜法、質(zhì)譜法等。高效液相色譜技術(shù)可以通過(guò)對(duì)有效活性成分含量的測(cè)定建立指紋圖譜來(lái)對(duì)不同產(chǎn)地的中藥材進(jìn)行溯源判別。朱燁婷等[32]通過(guò)收集8 個(gè)省20 個(gè)產(chǎn)地的三葉青樣品進(jìn)行超高相液相色譜法測(cè)定化學(xué)成分蘆丁、異槲皮苷與山柰酚-3-O-蕓香糖苷的含量, 結(jié)果表明, 三葉青中黃酮苷含量從高到低依次是重慶、福建、廣西、貴州、浙江、湖北、湖南、江西; 同時(shí)廣西、重慶、福建等經(jīng)緯度低、海拔高的地區(qū)更加有利于其塊根中黃酮苷含量積累, 在市場(chǎng)上可以?xún)?yōu)先選用。朱建麗[33]和李飄[34]都通過(guò)HPLC 發(fā)現(xiàn), 不同產(chǎn)地下三葉青中的綠原酸、咖啡酸、葒草苷、紫云英苷、槲皮素、白藜蘆醇、山柰酚等有效活性成分的含量有所差異, 為三葉青藥材的質(zhì)量控制提供參考。李鶴收集了從浙江、福建、貴州、廣西、湖南等5 個(gè)地區(qū)采集的三葉青樣品利用HPLC 建立指紋圖譜, 進(jìn)行聚類(lèi)分析和主成分分析的結(jié)果顯示, 廣西三葉青和湖南三葉青的品質(zhì)較為接近, 浙江三葉青與貴州三葉青、福建三葉青的品質(zhì)相差較大。

2.2 礦物元素產(chǎn)地溯源指紋分析技術(shù)

礦物元素指紋分析圖譜技術(shù)的原理是根據(jù)不同產(chǎn)地的土壤因與巖石風(fēng)化的母質(zhì)存在一定的相關(guān)性, 進(jìn)而使不同產(chǎn)地的土壤中礦物元素的種類(lèi)及含量有著地質(zhì)特異性差異, 包括常量元素、微量元素和痕量元素三類(lèi)。礦物元素指紋分析圖譜可以通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地樣品的礦物元素進(jìn)行組成和含量分析,利用方差分析、判別統(tǒng)計(jì)分析等數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法篩選出來(lái)的有效信息進(jìn)行產(chǎn)地判別[36], 常見(jiàn)的礦物元素指紋圖譜分析方法有電感耦合等離子體質(zhì)譜法、紫外-可見(jiàn)分光光度法、儀器中子活化法等, 在中藥材產(chǎn)地溯源中得到了廣泛的應(yīng)用。吳浩等[37]通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)三葉青的27 種礦質(zhì)元素進(jìn)行含有量測(cè)定, 測(cè)定結(jié)果顯示, 三葉青中K、Mg、Ca、Al、Fe、Mn 平均含有量較高并且西部地區(qū)與東部地區(qū)的礦質(zhì)元素含量差異較大, 廣西的三葉青樣品與其他產(chǎn)區(qū)三葉青的礦質(zhì)元素含量差異最大, 主成分和載荷分析的分析結(jié)果也可以將各個(gè)產(chǎn)地的三葉青進(jìn)行區(qū)分。江川等[38]通過(guò)等離子發(fā)射光譜法測(cè)定不同產(chǎn)地三葉青中As、Cu、Hg、Cd、Pb 五種重金屬的含量, 測(cè)定結(jié)果顯示, 不同產(chǎn)地的三葉青重金屬含量有所差異, 其中重慶的三葉青樣品Cd、Pb 含量較高, 廣西桂林的三葉青樣品As 含量較高。重金屬一旦進(jìn)入人體就會(huì)在人體器官中逐漸積累造成慢性中毒, 危害人體健康, 因此, 通過(guò)礦質(zhì)元素檢測(cè)進(jìn)行產(chǎn)地溯源來(lái)規(guī)范三葉青重金屬含量是十分重要的。同時(shí)有研究[39]表明,微量元素與肝癌也具有一定的相關(guān)性, 其貢獻(xiàn)程度依次為Zn、Mn、Cu、Fe、Mg, 而恰好三葉青中的Mg、Fe、Mn 含量較高, 由此可以推測(cè), 微量元素的差異可能會(huì)對(duì)三葉青抗肝癌療效產(chǎn)生影響。綜上所述, 對(duì)三葉青進(jìn)行礦物元素產(chǎn)地溯源指紋分析能更加準(zhǔn)確地鑒別出三葉青的產(chǎn)地, 可以建立起更完善的一套三葉青質(zhì)量控制體系。

2.3 穩(wěn)定同位素分析技術(shù)

穩(wěn)定同位素分析法是通過(guò)同位素比率質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)的, 利用同位素分餾效應(yīng)理論實(shí)現(xiàn)對(duì)碳、氫、氧、氮、硫等元素的同位素在體內(nèi)富集程度的計(jì)算來(lái)進(jìn)行示蹤[40]。其中碳同位素主要與光合作用的途徑有關(guān); 氫和氧的同位素主要與環(huán)境海拔、降水量等有關(guān); 氮同位素的差異則取決于在肥料中氮元素含量的高低[41]。在中藥材產(chǎn)地溯源中, 礦物元素分析方法與穩(wěn)定同位素分析方法通常聯(lián)合使用以增強(qiáng)其溯源的準(zhǔn)確性。

2.4 分子生物技術(shù)

分子生物技術(shù)可分為DNA 分子遺傳標(biāo)記技術(shù)和mRNA 差異顯示技術(shù)。前者根據(jù)DNA 的差異進(jìn)行判別, 后者是通過(guò)尋找不同的組織或者細(xì)胞在基因表達(dá)中的差異進(jìn)行判別[42]。沈清[43]通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地的5 個(gè)三葉青完整葉綠體基因組序列進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)特征和序列變異分析, 成功揭示了其結(jié)構(gòu)的變化; 并根據(jù)已確定的葉綠體基因組發(fā)展出了DNA 條形碼, 能高效地識(shí)別出不同產(chǎn)地的三葉青,為三葉青的鑒別提供了新的思路和方法。分子生物技術(shù)鑒別三葉青的優(yōu)點(diǎn)是不容易受到生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)狀況以及不同發(fā)育階段的影響, 只與三葉青本身的遺傳序列有關(guān), 因此, 可以更加準(zhǔn)確地對(duì)三葉青進(jìn)行鑒別 (表3)。

表3 常見(jiàn)的產(chǎn)地溯源技術(shù)

3 總結(jié)與展望

本文對(duì)三葉青的化學(xué)成分、藥理活性, 以及產(chǎn)地鑒別技術(shù)進(jìn)行了論述。三葉青的產(chǎn)地分布廣, 不同產(chǎn)地間的三葉青臨床藥效具有差異。這與當(dāng)?shù)卦耘喹h(huán)境, 如光照、降雨、海拔、土壤等因素息息相關(guān)。此外, 隨著人工栽培三葉青的技術(shù)發(fā)展, 不同的栽培方式也會(huì)致使活性成分的差異, 但鮮有相關(guān)的研究報(bào)道。由于三葉青的研究起步較晚, 有效成分和作用機(jī)制尚不清楚, 目前報(bào)道的主要的活性成分包括黃酮類(lèi)和多糖類(lèi)等。在品質(zhì)評(píng)價(jià)方面, 可按照三葉青的根、莖葉、果實(shí)中的活性成分構(gòu)建初步質(zhì)量控制方法和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn), 按需選擇合適的藥材,保證臨床用藥的有效性。另外, 現(xiàn)有三葉青的產(chǎn)地鑒別技術(shù)主要集中在傳統(tǒng)的色譜法和光譜法, 可引入和探討其他的產(chǎn)地保護(hù)技術(shù)如穩(wěn)定同位素與礦質(zhì)元素技術(shù)對(duì)三葉青產(chǎn)地的區(qū)分準(zhǔn)確度, 對(duì)中藥材產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。