大鼠伏核甘丙肽鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制

彭煜航，李焱娟，曲婧紅，唐代歡，張宏偉，吳 睿，徐世蓮

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，云南 昆明 650500）

神經(jīng)病理性疼痛和炎癥痛是臨床常見的疼痛，但至今臨床鎮(zhèn)痛藥物療效并不理想，且具有明顯的藥物副作用，故尋找和開發(fā)新的鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)而毒副作用小的鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。

甘丙肽是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周的重要的神經(jīng)肽[1]。研究報(bào)道甘丙肽可抑制炎癥介質(zhì)引起的機(jī)械超敏反應(yīng)[2]；對(duì)糖尿病外周神經(jīng)痛具有鎮(zhèn)痛作用[3]；在三叉神經(jīng)損傷后的神經(jīng)痛和神經(jīng)再生中也有重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過大鼠足底皮下注射鹿角菜堿制作炎癥痛動(dòng)物模型和左側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎制作神經(jīng)痛動(dòng)物模型，研究甘丙肽對(duì)不同動(dòng)物模型的鎮(zhèn)痛作用。

隨著甘丙肽受體激動(dòng)劑和拮抗劑的開發(fā)和應(yīng)用，越來越多的研究報(bào)道甘丙肽對(duì)痛覺的調(diào)節(jié)作用可能是通過激活其受體來完成的[5-7]。甘丙肽有3 種受體，分別是甘丙肽受體1-3（galanin receptor 1-3，GalR1-3）[8]。本實(shí)驗(yàn)通過比較甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動(dòng)物模型的鎮(zhèn)痛作用；并檢測(cè)不同模型大鼠GalRs的表達(dá)，探索甘丙肽對(duì)痛覺信息的調(diào)節(jié)作用是否通過甘丙肽受體的激活來完成。

伏核可分為核與殼兩部分，每側(cè)大腦半球各有一個(gè)。早在1999 年，Gear 等[9]研究報(bào)道伏核是一個(gè)參與痛覺調(diào)節(jié)的重要的中樞核團(tuán)。Watanabe 等[10]報(bào)道伏核內(nèi)灌注乙酰天冬氨酸可明顯減輕光刺激誘發(fā)的感覺神經(jīng)損傷引起的疼痛。最近的研究報(bào)道神經(jīng)痛大鼠伏核組織甘丙肽的表達(dá)上調(diào)[11]。本實(shí)驗(yàn)研究不同大鼠模型伏核微量注射甘丙肽的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠43 只：170～220 g，雄性，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、自由進(jìn)食，分籠飼養(yǎng)、自然光照、室溫保持在22 ℃左右。所有實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照國際疼痛協(xié)會(huì)和昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 甘丙肽（rat galanin，Tocris，UK）、Anti-GalR1（Thermo，美國）、Anti-GalR2（Abcam，英國）、Anti-GAPDH（CST，美國）。熱板智能儀（Hot plate，YLS-6B，中國）、Randall-Selitto 痛覺測(cè)試儀（UGO Basile，37215，意大利）。

1.2 研究方法

1.2.1 痛覺行為學(xué)檢測(cè) 大鼠對(duì)傷害性熱刺激誘發(fā)的后爪縮爪潛伏期（hind-paw withdrawal latency，HWL）使用熱板智能儀測(cè)定，熱板溫度保持在（52±0.2）℃。對(duì)機(jī)械壓力刺激誘發(fā)的后爪縮爪閾值（hind-paw withdrawal threshold，HWT）使 用Randall-Selitto 痛覺測(cè)試儀測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)前對(duì)大鼠進(jìn)行5 d 的訓(xùn)練，使大鼠HWL和HWT 較為穩(wěn)定，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立 實(shí)驗(yàn)采用鹿角菜堿制作炎癥痛模型。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將2%的鹿角菜堿0.1 mL 注射到大鼠左側(cè)后爪足底皮下。鹿角菜堿注射3～4 h 之間，大鼠痛敏達(dá)到高峰。

采用坐骨神經(jīng)干部分結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）的方法制作神經(jīng)痛動(dòng)物模型。大鼠麻醉用戊巴比妥鈉（50 mg/kg，腹腔注射）后，游離左側(cè)約1 cm 長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)大腿段，輕度結(jié)扎神經(jīng)（4 號(hào)羊腸線），共結(jié)扎4 圈，每圈之間間隔約1 mm。

1.2.3 伏核埋管 麻醉后，將大鼠固定在腦立體定位儀上。根據(jù)大鼠的腦定位圖譜（B，+1.7 mm；L or R，1.6 mm；V，7.0 mm），將事先準(zhǔn)備好的不銹鋼套管（外徑為0.8 mm）放置于伏核內(nèi)，并使用牙托粉固定套管。術(shù)后大鼠恢復(fù)2～3 d。

1.2.4 伏核微量注射 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天進(jìn)行伏核內(nèi)微量注射，注射管為外徑0.4 mm 的不銹鋼管。

實(shí)驗(yàn)分為生理鹽水對(duì)照組（n=8）、正常組（n=8）、炎癥痛組（n=8）和CCI 組（n=7），生理鹽水對(duì)照組大鼠伏核注射1 μL 生理鹽水；正常組大鼠伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL；炎癥痛給藥組大鼠在致炎3 h 伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL；CCI 給藥組大鼠在坐骨神經(jīng)結(jié)扎第14 天伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 μL。

注射前，需測(cè)量雙側(cè)HWL 和HWT 作為基礎(chǔ)值，在甘丙肽注射5、10、15、20、30、45、60 min 后分別測(cè)量各組大鼠雙側(cè)的HWL 和HWT，計(jì)算給藥后變化百分率，即：

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)伏核注射位點(diǎn)進(jìn)行組織學(xué)鑒定（圖1），鑒定結(jié)果顯示注射位點(diǎn)位于伏核的數(shù)據(jù)方可納入統(tǒng)計(jì)。

圖1 伏核注射位點(diǎn)鑒定圖Fig.1 Illustration of the location of the injection needle tips

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（western blot，WB）大鼠用4%的異氟醚麻醉后，迅速取雙側(cè)伏核組織。WB 法檢測(cè)GalR1（1∶500）和GalR2（1∶500）的表達(dá)。以 GAPDH（1∶10 000）作為內(nèi)參，蛋白表達(dá)條帶使用Image J 軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用Prism6 軟件分析。組間差異采用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析或單因素方差分析進(jìn)行比較。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用

和生理鹽水對(duì)照組比較，伏核注射甘丙肽引起正常組（左：F=5.76，P＜ 0.05；右：F=10.66，P＜ 0.01）、炎癥痛組（左：F=54.94，P＜ 0.001；右：F=37.92，P＜ 0.001）和CCI 組（左：F=68.13，P＜ 0.001；右：F=33.90，P＜ 0.001）大鼠雙側(cè)HWL 延長(zhǎng)，并且正常組（左：F=26.20，P＜ 0.001；右：F=13.71，P＜ 0.01）、炎癥痛組（左：F=5.51，P＜ 0.001；右：F=21.94，P＜ 0.001）和CCI 組（左：F=79.63，P＜ 0.001；右：F=30.03，P＜ 0.001）大鼠雙側(cè)HWT 也延長(zhǎng)。表明伏核注射甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都有鎮(zhèn)痛作用，在注射甘丙肽10 min 時(shí)鎮(zhèn)痛作用達(dá)到高峰，見圖2。

2.2 甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用比較

以上結(jié)果顯示，在伏核注射甘丙肽后10 min鎮(zhèn)痛作用達(dá)最高峰。比較3 組大鼠在伏核注射甘丙肽10 min 時(shí)的HWL 和HWT，結(jié)果顯示和正常組比較，炎癥痛組（左：q=4.45，P＜ 0.05；右：q=5.00，P＜ 0.05）和CCI 組（左：q=4.95，P＜0.05；右：q=4.52，P＜ 0.05）的雙側(cè)HWL 延長(zhǎng)。炎癥痛組（左：q=5.89，P＜ 0.01；右：q=4.96，P＜ 0.05）和CCI 組（左：q=7.98，P＜ 0.001；右：q=6.82，P＜ 0.001）的雙側(cè)HWT 也延長(zhǎng)，表明伏核注射甘丙肽對(duì)炎癥痛鼠和神經(jīng)痛鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于正常鼠的。但比較炎癥痛鼠和CCI 鼠的HWL（左：q=0.65，P＞ 0.05；右：q=0.31，P＞0.05）和HWT（左：q=2.3，P＞ 0.05；右：q=2.02，P＞ 0.05）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3，提示致炎或神經(jīng)損傷可能引起GalRs 的表達(dá)增加，甘丙肽通過和其受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用。

圖3 甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用比較Fig.3 Comparison of analgesic effects of galanin on native,inflammatory and CCI rats

2.3 炎癥痛和神經(jīng)痛對(duì)伏核神經(jīng)細(xì)胞GalRs 表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證甘丙肽是否通過和其受體結(jié)合對(duì)大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。取正常組（n=4）、炎癥痛組（致炎3 h，n=4）和神經(jīng)痛組（CCI 第14 天，n=4）大鼠的伏核組織，WB 檢測(cè)3 組大鼠伏核神經(jīng)元GalR1 和GalR2 的表達(dá)。結(jié)果顯示，和正常組比較，炎癥痛大鼠伏核神經(jīng)元GalR1（q=10.61，P＜ 0.001）和GalR2（q=5.47，P＜ 0.05）的表達(dá)增加。和正常組比較，CCI 大鼠伏核神經(jīng)元GalR1（q=12.47，P＜ 0.001）和GalR2（q=4.95，P＜0.05））的表達(dá)也增加。該結(jié)果表明致炎或神經(jīng)損傷引起GalR1 和GalR2 的表達(dá)增加，但比較炎癥痛大鼠和CCI 大鼠的GalR1（q=1.86，P＞ 0.05）和GalR2（q=0.53，P＞ 0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），見圖4。

圖4 正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠 GalR1 和GalR2 的表達(dá)Fig.4 Expression of GalR1 and GalR2 in native,inflammatory and CCI rats

3 討論

腦內(nèi)與痛覺相關(guān)的中樞部位檢測(cè)到甘丙肽的表達(dá)，提示甘丙肽在痛覺的產(chǎn)生和傳導(dǎo)中起到重要作用[5]。Zhang 等[12-13]報(bào)道前扣帶回（Anterior cingulate cortex）注射甘丙肽對(duì)炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。Li 等[14]報(bào)道中央杏仁核（Central nucleus of amygdala）注射甘丙肽對(duì)正常大鼠和神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)選取正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動(dòng)物模型，伏核注射相同劑量的甘丙肽，結(jié)果顯示甘丙肽引起3 組大鼠雙側(cè)HWL 和HWT 都延長(zhǎng)（圖2），提示伏核注射甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都具有鎮(zhèn)痛作用。并且比較甘丙肽對(duì)不同大鼠的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示甘丙肽對(duì)炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對(duì)正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用（圖3），提示在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，GalRs 的表達(dá)可能上調(diào)，甘丙肽可能是通過激活其受體，從而抑制痛覺信息的傳導(dǎo)。

伏核是腦內(nèi)調(diào)節(jié)痛覺的最重要的核團(tuán)之一。大鼠伏核內(nèi)注射降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）具有鎮(zhèn)痛作用[15]。本實(shí)驗(yàn)選取正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠不同動(dòng)物模型，伏核內(nèi)注射相同劑量的甘丙肽，結(jié)果顯示甘丙肽引起3 組大鼠雙側(cè)HWL 和HWT 都延長(zhǎng)，見圖2。提示伏核注射甘丙肽對(duì)正常大鼠、炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠都具有鎮(zhèn)痛作用。

既往研究報(bào)道，甘丙肽通過激活一種或幾種甘丙肽受體而發(fā)揮作用[16]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)檢測(cè)到甘丙肽與其受體的結(jié)合[17]。為了研究甘丙肽在伏核對(duì)痛覺信息的抑制作用是否通過激活甘丙肽受體來完成，本實(shí)驗(yàn)首先比較伏核注射相同劑量的甘丙肽10 min 后對(duì)不同大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果顯示甘丙肽對(duì)炎癥痛大鼠和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對(duì)正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用，見圖3。這一結(jié)果提示在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，GalRs的表達(dá)可能上調(diào)，甘丙肽通過和受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用，因而對(duì)炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對(duì)正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

GalRs 屬于G 蛋白耦聯(lián)受體[18]。先前的研究也報(bào)道在一些痛覺過敏的狀態(tài)下，比如神經(jīng)損傷，甘丙肽和其受體的表達(dá)都是增加的[13,19]。Xu 等[20]報(bào)道坐骨神經(jīng)損傷引起脊髓背根神經(jīng)節(jié)GalR1 的表達(dá)下調(diào)；但在脊髓，GalR1 的表達(dá)是上調(diào)的；GalR2 的表達(dá)則在脊髓背根神經(jīng)節(jié)和脊髓神經(jīng)細(xì)胞都是上調(diào)的。Zhang 等[11]報(bào)道伏核注射GalRs的共同阻斷劑Galantide 能阻斷甘丙肽對(duì)神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用；而伏核內(nèi)微量注射GalR1 的特異性激動(dòng)劑M617 對(duì)神經(jīng)痛大鼠具有鎮(zhèn)痛作用[7]；在CCI 大鼠[21]和炎癥痛大鼠[22]伏核內(nèi)注射GalR2的特異性激動(dòng)劑M1145 也具有鎮(zhèn)痛作用。這些研究都提示在痛敏狀態(tài)下可能腦內(nèi)GalRs 激活，從而抑制痛覺信息的產(chǎn)生而具有鎮(zhèn)痛作用。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)正常大鼠、炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠3 種不同動(dòng)物模型的伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR1 和GalR2 的表達(dá)，結(jié)果顯示和正常組大鼠比較，炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠GalR1 和GalR2 的表達(dá)上調(diào)，見圖4，進(jìn)一步表明在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，神經(jīng)細(xì)胞GalR1和GalR2 被激活。本實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到伏核神經(jīng)細(xì)胞GalR3 的表達(dá)。

綜上所述，伏核注射甘丙肽對(duì)炎癥痛和神經(jīng)痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于對(duì)正常大鼠的鎮(zhèn)痛作用；在炎癥和神經(jīng)損傷過程中，伏核神經(jīng)元GalR1 和GalR2 的表達(dá)增加。這些結(jié)果表明甘丙肽通過和其受體結(jié)合完成鎮(zhèn)痛作用。隨著對(duì)甘丙肽鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的深入研究，甘丙肽及其受體激動(dòng)劑可望成為臨床治療疼痛的新型鎮(zhèn)痛藥物。