藏藥贊丹杰巴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

趙雯瑋,達(dá)娃卓瑪*,王珊珊,楊麗瓊

(1.西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院,西藏 拉薩 850000;2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥(藏藥)質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西藏 拉薩 850000)

贊丹杰巴丸又名八味檀香丸,為黃棕色至棕紅色水丸,最早記載于《四部醫(yī)典后續(xù)部》,為藏醫(yī)常用經(jīng)典名方,常被用于治療肺結(jié)核等疾病。贊丹杰巴丸由檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香、葡萄干、甘草、力嘎都、索羅等八種藥材組成[1],具有清肺熱、化膿血等功效,臨床主要用于治療肺熱、肺膿腫、咯血、肺結(jié)核等疾病。該方劑藥材選擇和制備工藝根據(jù)藏醫(yī)藥學(xué)原理,選用珍稀、純天然藥材,采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)藏藥加工技術(shù)相結(jié)合的方法精制而成。其中檀香用于治療寒氣凝滯、腹痛、胸痛;丁香用于治療食欲不振、嘔吐腹瀉、脾胃虛寒、心腹冷痛[2];力嘎都用于醫(yī)治氣喘、咳痰、肺熱咳嗽、咯血[2];紅花用于醫(yī)治癰腫;甘草用于醫(yī)治咳嗽、咳痰、倦怠、乏力、脾胃虛弱、四肢痙攣疼痛等癥[2];索羅用于醫(yī)治感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽等[3]。

贊丹杰巴丸標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)》(2005版)當(dāng)中,但該標(biāo)準(zhǔn)僅收載制法、性狀、檢查(丸劑)、功效等項(xiàng)。與藥材真?zhèn)?、質(zhì)量?jī)?yōu)劣緊密相關(guān)的顯微鑒定、薄層色譜鑒別等項(xiàng)完全缺乏。贊丹杰巴丸作為臨床常用制劑,含有貴重藥材檀香、紫檀及礦物藥石灰華,建立有效可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)保證臨床用藥安全具有重要意義。

本研究建立贊丹杰巴丸中檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香的顯微定性鑒別;建立以紅花、丁香、甘草為主的薄層色譜(TLC)鑒別方法;同時(shí)開(kāi)展石灰華化學(xué)反應(yīng)鑒別及水分、重量差異等檢測(cè),為有效控制藏藥贊丹杰巴丸質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Scanner薄層點(diǎn)樣和成像系統(tǒng)(CAMAG公司);KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SENCOW201型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司);BS-3000A電子天平(上海友聲衡器有限公司);AL104型電子天平(梅特勒-托利多有限公司);日本奧林巴斯顯微鏡(C5060-ADU);薄層層析硅膠板(青島海洋化工有限公司硅膠G板);雙槽層析缸(上海信誼儀器廠有限公司)。

1.2 試藥

紅花對(duì)照藥材(120907-201713)、丁香對(duì)照藥材(121039-201405)和甘草對(duì)照藥材(120904-202021)均采購(gòu)于中國(guó)食品藥品鑒定研究院,贊丹杰巴丸處方由西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司提供,水為超純水,其他試劑均為分析純。

1.3 樣品信息

樣品由以下4個(gè)廠家提供,具體信息見(jiàn)表1。

表1 贊丹杰巴丸樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

取本品粉末少許,置于載玻片上,加水合氯醛封片,置于顯微鏡下觀察,如圖1所示。

注:1.檀香纖維束;2.紫檀纖維束;3.石灰華碳酸鈣方晶;4.紅花分泌細(xì)胞;5.紅花花粉粒;6.丁香花粉粒。圖1 贊丹杰巴丸粉末顯微鑒別(10×40)

如圖1所示,贊丹杰巴丸顯微特征鏡檢時(shí)檢出率較高,且特征專屬性較強(qiáng)的部分。對(duì)4家企業(yè)提供的4批贊丹杰巴丸成藥樣品進(jìn)行檢驗(yàn),顯微鑒別結(jié)果經(jīng)與參考文獻(xiàn)[4-6]對(duì)比,發(fā)現(xiàn)贊丹杰巴丸共有鑒別特征有花粉粒呈圓形或類圓形,略帶淡黃色,外壁被刺包裹,直徑約60μm,含3個(gè)萌發(fā)孔,分泌細(xì)胞為長(zhǎng)管狀,其內(nèi)含黃棕色至紅棕色分泌物(紅花)[4];木纖維束呈淡黃色,其周圍含晶細(xì)胞壁厚,木化,層紋明顯,內(nèi)含草酸鈣方晶,形成晶纖維,含晶細(xì)胞方形或長(zhǎng)方形,壁厚,木化,層紋明顯,胞腔含草酸鈣方晶(檀香)[4];花粉粒呈無(wú)色或淡黃色,圓形或類圓形,直徑約至16μm(丁香)[7];碳酸鈣結(jié)晶呈短棒狀或柱狀,直徑2～4μm,長(zhǎng)65μm(石灰華)[8];棕紅色木纖維成束或單個(gè)分散,部分纖維束周圍含有草酸鈣方晶,形成晶纖維,含晶細(xì)胞壁厚薄不均,且木化增厚,紋孔密集,纖維管胞呈紅棕色,壁厚,壁上有具緣紋孔(紫檀)[9]。

2.2 理化鑒別

取2g贊丹杰巴丸,研磨后加入0.5mol/L稀鹽酸試液20mL,充分震搖。過(guò)濾,取續(xù)濾液加入適量草酸銨溶液,分成兩份等量試液,分別加入一定量的乙酸或鹽酸溶液。結(jié)果如表2所示。

表2 贊丹杰巴丸理化鑒別結(jié)果

從上述結(jié)果可以看出,對(duì)贊丹杰巴丸中的主要藥物石灰華(CaCO3),采用理化鑒別的方式可對(duì)其進(jìn)行快速有效的鑒別。

2.3 薄層色譜鑒別方法的建立及應(yīng)用

2.3.1 紅花 (1)供試品及對(duì)照品溶液的制備。稱取3g贊丹杰巴丸,研磨成粉,加入80%丙酮溶液10mL超聲提取15min,靜置后取上清液作為供試品溶液。分別精密稱取0.5g紅花對(duì)照藥材和3g贊丹杰巴丸(去除紅花),加入80%丙酮溶液(料液比1∶10),超聲15min,放冷后取上清作為對(duì)照品溶液(紅花)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。展開(kāi)劑的選擇:采用2020版《中華人民共和國(guó)藥典》[4]一部所收錄紅花項(xiàng)下薄層鑒別的方法條件。分別取樣1號(hào)供試品溶液兩份,陰性樣品溶液一份、紅花對(duì)照藥材溶液一份,點(diǎn)樣,以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(7∶2∶3∶0.4)為展開(kāi)劑展開(kāi)。結(jié)果顯示分離效果較差(其他成分干擾、拖尾)。故參考占堆等的方法[7],分別取等量1號(hào)供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(紅花),進(jìn)行點(diǎn)樣,相繼以乙酸乙酯-甲醇(6∶1)和乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi)、取出、晾干后;結(jié)果顯示采用占堆等[7]的展開(kāi)條件分離效果最佳(斑點(diǎn)清晰),故以占堆等[7]的展開(kāi)條件作為贊丹杰巴丸薄層鑒別的最佳展開(kāi)條件。

(3)點(diǎn)樣量考察。分別從1號(hào)供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(紅花)各取1、4、7、10、15μL,點(diǎn)于同一硅膠G板上,按上述篩選出的最佳條件進(jìn)行展開(kāi),觀察發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量 10μL時(shí)斑點(diǎn)最清晰。故選擇10μL為最佳的點(diǎn)樣量。

(4)薄層板的選擇。按上述篩選出的最佳條件取供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(紅花)分別點(diǎn)于硅膠G、硅膠H、硅膠GF254板上,以上述最佳展開(kāi)條件進(jìn)行展開(kāi)后,分別考察其在紫外、熒光及自然光下的分離度、拖尾情況、成點(diǎn)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硅膠G 板上的分離效果最好。故選擇硅膠G板作為最佳的薄層板。

(5)贊丹杰巴丸中紅花樣品的鑒別。按上述篩選的最佳條件分別取等量樣1～4供試品溶液、陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(紅花)各兩份點(diǎn)樣,以上述最佳展開(kāi)條件展開(kāi),結(jié)果表明所有樣品斑點(diǎn)清晰。紅花藥材溶液與4個(gè)待測(cè)樣品中的特征斑點(diǎn)均清晰可見(jiàn),但在陰性樣品中沒(méi)有出現(xiàn)該特征斑點(diǎn)。詳見(jiàn)圖2。

注:1-2:陰性樣品;3-4:對(duì)照品(紅花);5-6:樣1;7-8:樣2;9-10:樣3;11-12:樣4展開(kāi)劑:先用乙酸乙酯-甲醇(6∶1)為展開(kāi)劑,展開(kāi),取出,揮干,再用乙酸乙酯-甲酸-水(9∶2∶2)展開(kāi)(青島硅膠G板,12.6℃,17%)。圖2 贊丹杰巴丸紅花薄層色譜

2.3.2 丁香 (1)供試品及對(duì)照品溶液的制備。分別稱取2g贊丹杰巴丸、0.5g丁香藥材和2g贊丹杰巴丸(去除丁香),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超聲20min,過(guò)濾,取濾液作為供試品溶液、對(duì)照品溶液(丁香)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。①展開(kāi)劑及展開(kāi)條件的選擇:分別取10μL陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(丁香)及1號(hào)供試品溶液點(diǎn)于同一硅膠G板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)[7]為展開(kāi)條件,分別橫向、豎向展開(kāi),取出揮干后以5%硫酸香草醛溶液顯色。發(fā)現(xiàn)橫向展開(kāi)時(shí)干擾嚴(yán)重,分離效果較差;改為使用豎向展開(kāi)時(shí),分離效果佳,但斑點(diǎn)易出現(xiàn)弧形、彎曲狀。經(jīng)改良后采用雙槽層析缸展開(kāi),先在層析缸一邊槽內(nèi)放入展開(kāi)劑,另一邊槽內(nèi)放入2mL純化水,提前預(yù)飽和15min后再放入硅膠板,可有效避免彎曲現(xiàn)象。因此,采用預(yù)飽和的環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)豎向展開(kāi)為最佳展開(kāi)條件。

②點(diǎn)樣量的考察:分別取陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(丁香)及1號(hào)供試品溶液1、3、5、7、9、11μL樣品點(diǎn)于同一硅膠G板上,按上述確定的最佳展開(kāi)條件展開(kāi),揮干,以5%香草醛硫酸溶液顯色。發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣量5μL時(shí)的分離效果和成點(diǎn)性最佳。故選擇5μL為最佳點(diǎn)樣量。

③不同薄層板的考察:按上述篩選的最佳條件,分別對(duì)陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(丁香)及1號(hào)供試品溶液在硅膠G、硅膠H、硅膠GF254板上的分離情況進(jìn)行考察。結(jié)果表明:硅膠G板的分離度最佳。

④不同顯色劑的選擇:按照上述篩選出的最佳條件進(jìn)行點(diǎn)樣、展開(kāi)后,分別考察硫酸乙醇、5%香草醛硫酸溶液、紫外分光光度計(jì)、碘粉的顯色情況,結(jié)果表明:用5%香草醛硫酸溶液時(shí)斑點(diǎn)顏色清晰。

(3)贊丹杰巴丸中丁香樣品的鑒別。分別取陰性樣品溶液、對(duì)照品溶液(丁香)、樣1-4供試品溶液按上述篩選出的最佳條件進(jìn)行點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色。結(jié)果表明,薄層色譜圖中待測(cè)斑點(diǎn)與其他成分分離效果佳良好,丁香的特征斑點(diǎn)在所有供試樣品中可清晰檢出,陰性樣品未檢出或不清晰,見(jiàn)圖3。

注:1-2:樣1;3-4:樣2;5-6:樣3;7-8:樣4;9-10:陰性樣品;11-12:丁香對(duì)照藥材展開(kāi)劑:環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)(青島硅膠G板,13.7℃,16%)。圖3 贊丹杰巴丸丁香薄層色譜

2.3.3 甘草 (1)供試品及對(duì)照品溶液的制備。分別精密稱取2g贊丹杰巴丸、0.5g甘草對(duì)照藥材和贊丹杰巴丸(去除甘草),研磨后按1∶10的料液比加入乙醇,超聲20min,取濾液濃縮至2mL,作為供試品溶液:對(duì)照品溶液(甘草)和陰性樣品溶液。

(2)薄層色譜條件的篩選。于同一硅膠G板上分別點(diǎn)上5μL的1號(hào)供試品溶液、對(duì)照品溶液(甘草)、陰性樣品溶液,以三氯甲烷-甲醇(9∶1)為展開(kāi)系統(tǒng)展開(kāi),取出,揮干。置紫外燈(365nm)下檢視。發(fā)現(xiàn)分離效果較優(yōu)且斑點(diǎn)清晰;噴以10%硫酸乙醇,加熱至斑點(diǎn)清晰時(shí),各斑點(diǎn)清晰度和成點(diǎn)性、分離度均不佳。因此選擇紫外燈(365nm)為贊丹杰巴丸最佳檢視條件。

(3)贊丹杰巴丸中甘草的薄層色譜鑒別。按上述篩選的最佳條件于同一硅膠板分別點(diǎn)上1～4號(hào)供試品溶液、對(duì)照品溶液(甘草)、陰性樣品供試品各兩份,以上述最佳展開(kāi)條件展開(kāi),置紫外燈(365nm)下檢視,結(jié)果表明:在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的位置上,所有供試品均呈現(xiàn)界限清晰的斑點(diǎn),且斑點(diǎn)的顏色是相同的。而在陰性樣品相對(duì)應(yīng)的位置上,沒(méi)有斑點(diǎn)呈現(xiàn)。見(jiàn)圖4。

注:1-2:陰性對(duì)照;3-4:甘草對(duì)照藥材;5-6:樣1;7-8:樣2;9-10:樣3;11-12:樣4(青島硅膠G板,13.7℃,16%)。圖4 贊丹杰巴丸甘草薄層條件篩選

2.4 水分

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020版[4]第四部通則0832水分(第二法)測(cè)定,每批樣品各取3份測(cè)量水分,結(jié)果見(jiàn)表3,其水分平均含量為6.53%。

表3 贊丹杰巴丸水分測(cè)定結(jié)果 (%)

2.5 質(zhì)量差異

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2020版[4]第四部通則0108丸劑項(xiàng)下質(zhì)量差異測(cè)定,取20244批號(hào)樣品以1丸為1份,取供試品10份,分別稱定質(zhì)量,再計(jì)算質(zhì)量差異,結(jié)果見(jiàn)表4,質(zhì)量差異符合藥典規(guī)定。

表4 贊丹杰巴丸質(zhì)量差異測(cè)定結(jié)果

3 討論

在本研究中,通過(guò)顯微、薄層色譜、化學(xué)鑒別、水分、質(zhì)量差異五個(gè)方面對(duì)藏藥贊丹杰巴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行補(bǔ)充與完善。

在顯微鑒別中,準(zhǔn)確鑒定并描述贊丹杰巴丸中檀香纖維束、紫檀纖維束、石灰華碳酸鈣方晶、紅花分泌細(xì)胞、紅花花粉粒及丁香花粉粒的形態(tài)特征,這些特征在所有供檢樣品中均容易發(fā)現(xiàn),特征清晰,鑒別度高,具有很強(qiáng)的鑒別意義。

在薄層色譜鑒定中,通過(guò)對(duì)薄層板、展開(kāi)劑、點(diǎn)樣量、顯色劑等多重因素考察,篩選并建立了可顯著區(qū)別陰性對(duì)照品和供試品的紅花、丁香、甘草的薄層色譜鑒定方法。這些方法選用的試劑具有低毒、廉價(jià)、溶劑易配制等特點(diǎn),且該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀,具有很好專屬性,可以準(zhǔn)確鑒別出是否含有紅花、丁香、甘草等主要藥材,可用于贊丹杰巴丸的真實(shí)性鑒定。

理化鑒別是生藥鑒定中重要組成部分,可以根據(jù)中藥中所含化學(xué)成分的理化性質(zhì),通過(guò)物理化學(xué)等分析方法,分析藥物中某一類指標(biāo)性成分的有無(wú)、多少等,是快速鑒定中藥的真實(shí)性、純度和品質(zhì)優(yōu)劣程度的一種鑒定方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。本文中,通過(guò)先后加入稀鹽酸、氯化銨、草酸、稀鹽酸等常規(guī)試劑的方法,快速鑒別了藏藥贊丹杰巴丸中的石灰華的主要成分CaCO3。

同時(shí)根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》中檢查項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定,測(cè)得贊丹杰巴丸的水分含量為6.75%～7.53%,平均水分含量為6.53%,質(zhì)量差異為0.86%～3.91%,符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的要求。

綜上,本研究建立贊丹杰巴丸處方中的主要藥材紅花、丁香、甘草、檀香、紫檀、石灰華、紅花、丁香等藥材的顯微鑒別、薄層色譜鑒別方法,并補(bǔ)充了水分、質(zhì)量差異等檢測(cè)項(xiàng),規(guī)范和完善了贊丹杰巴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系,為贊丹杰巴丸的規(guī)范化生產(chǎn)提供了簡(jiǎn)便可依的質(zhì)量控制依據(jù),為贊丹杰巴丸的臨床用藥的安全、穩(wěn)定、有效提供科學(xué)保障。本研究建立的贊丹杰巴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好,可用于其質(zhì)量控制。