基于非靶向代謝組學(xué)的訶子解草烏心臟毒性機(jī)制分析

圖布新,姜艷麗,烏日漢,胡伊力格其,劉錦文,韓曉靜,阿都沁夫,白梅榮*

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙醫(yī)藥研發(fā)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 通遼 028000;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010;3.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 護(hù)理學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

訶子為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.、絨毛訶子TerminaliachebulaRetz.var.tomentellaKurt.或恒河訶子TerminaliachebulaRetz.var.gangeticaRoxb.的干燥成熟果實(shí)[1],是蒙醫(yī)最常用的藥物,享有“額莫音·芒來、浩日音·達(dá)日嘎”的美譽(yù)[2],蒙古語意為蒙藥之王和解毒之王。草烏是毛茛科系北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥塊根[2],有大毒。由訶子解草烏毒是蒙醫(yī)用藥特色[3]?？v觀訶子解草烏毒性研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),訶子鞣質(zhì)能緩和烏頭堿的水解或改善線粒體功能,從而減少草烏毒性,降低不良反應(yīng)[4-6]。但尚未見從代謝組學(xué)角度分析訶子解草烏心臟毒性機(jī)制的研究報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)以大鼠為研究對象,以草烏訶子藥對為示例藥物,以代謝組學(xué)方法分析訶子解草烏心臟毒性過程中的心臟內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化規(guī)律,尋找訶子解草烏心臟毒性的生物標(biāo)志物,為草烏的安全合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠,SPF級,體質(zhì)量為(200±20)g,由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供(SCXK(遼)2021-0001)。飼養(yǎng)條件:室溫維持(23±1)℃,光照12h,自由飲水、攝食。

1.2 藥品與試劑

草烏與訶子由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供,并由包桂花教授鑒定;純化水(屈臣氏集團(tuán)有限公司);肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)試劑盒均購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 儀器

Eppendorf N13462C型移液器(德國Eppendorf公司);TripleTOF5600+質(zhì)譜儀MASS(AB SCIEXTM公司);Mikro 220R型臺式高速冷凍離心機(jī)(Hettich公司);TL-48R型粉碎研磨儀(上海萬柏生物科技有限公司);Nexera UHPLC LC-30A色譜UHPLC(島津SHIMADZU公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組及取材

取大鼠50只,按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組(ZC)、草烏高劑量組(CG,0.514 3g/kg,臨床等效劑量4倍)、草烏低劑量組(CD,0.032 1g/kg,臨床等效劑量1/4倍)、草烏訶子藥對高劑量組(CHG,0.514 3g/kg,臨床等效劑量4倍)、草烏訶子藥對低劑量組(CHD,0.032 1g/kg(臨床等效劑量1/4倍),每組10只。從實(shí)驗(yàn)第1天開始,給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物溶液,每日1次,連續(xù)28d;正常組灌胃等容積生理鹽水。最后一次給藥后,麻醉動(dòng)物,測定心率及心電圖;從腹主動(dòng)脈取血,3 500r/min離心15min分離血清,待測心臟功能生化指標(biāo);取部分心臟組織固定于10%甲醛溶液,待觀察病理學(xué)變化;取凍存部分心臟組織待分析其心臟內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。

2.2 代謝物提取

分別稱取心臟組織0.3g于PE管中,加入1 000μL甲醇,制備勻漿液,4℃ 12 000rpm/min離心15min,取上清過0.22μm有機(jī)濾膜,10μL進(jìn)樣,采用UPLC-MS檢測。

2.3 UPLC-MS檢測

色譜條件:采用SHIMADZU InerSustain C18色譜柱(100mm×2.1mm,2μm)。流動(dòng)相A∶乙腈,B∶0.1%甲酸水溶液,流速0.3mL/min,柱溫35℃,進(jìn)樣量10μL。洗脫梯度:95%～30% B,0～7min;30%～0% B,7～13min;0%～95% B,13～16min。

質(zhì)譜參數(shù)條件:采用電噴霧電離源條件如下:離子源Gas1:50,離子源 Gas2:50,界面加熱溫度:500℃(正離子)和450℃(負(fù)離子),離子噴霧電壓浮動(dòng)5 500V(正離子)和4 400V(負(fù)離子),氣簾氣壓力:25,TOF質(zhì)量掃描范圍:100～1 200Da,產(chǎn)物離子掃描范圍:50～1 000Da,產(chǎn)物離子掃描累積時(shí)間0.01s,TOF MS 掃描累積時(shí)間0.2s,二級質(zhì)譜采用 Information Dependent Acquisition獲得,并采用High Sensitivity模式,碰撞能量:(35±15)eV,去簇電壓:±60 V。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 多元統(tǒng)計(jì)分析

3.1.1 心電圖及心率檢測結(jié)果 在給藥28d后,與正常組相比較,CG組大鼠心率出現(xiàn)明顯降低(P<0.05),見表1。心電圖結(jié)果顯示,與正常組相比較,CG組呈現(xiàn)心律失常,室早,寬大畸形的QRS波;CD組出現(xiàn)寬大畸形的QRS波;CHG組出現(xiàn)ST段壓低;CHD組偶見ST段抬高。見圖1。

圖1 各給藥組大鼠的心電圖

表1 草烏及草烏加訶子藥對組大鼠心率的影響

3.1.2 血液生化指標(biāo)檢測 與ZC組比較,CG組CK、CKMB含量顯著降低(P<0.05);但草烏訶子藥對CK、CKMB含量無明顯變化。提示,草烏具有一定的心臟毒性,訶子具有降低草烏心臟毒性作用。結(jié)果見表2。

表2 各給藥組對大鼠生化指標(biāo)的影響

3.1.3 心臟組織病理檢測 病理檢測結(jié)果顯示,正常組心肌纖維排列整齊規(guī)則,胞核呈藍(lán)色,胞質(zhì)呈淡粉色,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。CG組和CD組心肌纖維排列略紊亂,胞質(zhì)疏松淡染,部分細(xì)胞水腫;CHG組個(gè)別心肌細(xì)胞水腫;CHD組心肌纖維排列紊亂,胞質(zhì)疏松淡染。見圖2。

圖2 各組病理切片(HE×400)

3.1.4 PCA分析結(jié)果 PCA是可觀察樣品的聚集、離散程度的圖像。與ZC組比較,CG和CHG組的大鼠心臟代謝物呈分離,見圖3。利用MetaboAnalyst軟件對各組熱圖進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)ZC組與CG和CHG組的代謝物相對豐度有明顯差異。表明,草烏高劑量可使大鼠心臟代謝物發(fā)生一定變化。見圖4。

圖3 高劑量組心臟代謝物 PCA分析

圖4 高劑量組心臟代謝物熱圖

3.1.5 PLS-DA分析結(jié)果 與ZC組比較,CG和CHG組大鼠心臟代謝物能完全分離,見圖5。說明CG和CHG組大鼠心臟代謝物譜有顯著差異。

圖5 高劑量組心臟PLS-DA分析

3.1.6 單變量分析 標(biāo)紅的點(diǎn)為具有顯著差異的代謝物,提示,與ZC組比較,CG和CHG組心臟代謝物存在顯著差異。見圖6。

圖6 高劑量組心臟火山圖

3.2 差異代謝物的篩選

與ZC組比較,CG組差異代謝物共18個(gè),其中上調(diào)代謝物4個(gè),下調(diào)代謝物14個(gè),詳見表3。與ZC組比較,CHG組差異代謝物共25個(gè),其中上調(diào)代謝物1個(gè),下調(diào)代謝物24個(gè),詳見表4。

表3 CG組心臟差異代謝物鑒定結(jié)果 (VIP≥1和P<0.05)

表4 CHG組心臟差異代謝物鑒定結(jié)果 (VIP≥1和P<0.05)

3.3 通路富集分析

將差異代謝物導(dǎo)入MBRole 2.0分析并獲得主要的代謝通路有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、精氨酸生物合成、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝等通路,見圖7。

圖7 心臟代謝通路

3.4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,訶子解草烏心臟毒性作用較明顯,調(diào)節(jié)心臟N、N-二甲基精氨酸和腺苷蛋氨酸及肌酸代謝產(chǎn)物是訶子解草烏心臟毒性的主要機(jī)制。

3.5 討論

NICHOLSON[7]首次提出了代謝組學(xué)的概念。代謝組學(xué)是分析藥物對生物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的表達(dá),從小分子水平上揭示藥物的療效或毒效的分析方法[8]。近年來,代謝組學(xué)在藥物心臟毒性研究,尤其在心臟損傷標(biāo)志物篩選、毒性機(jī)制及心臟損傷防治等研究中已被廣泛應(yīng)用[9]。

CK主要分布于骨骼肌、心肌、腦甲狀腺、肺組織、胃腸平滑肌中,在磷酸肌酸合成途徑中起到可逆催化肌酸形成磷酸肌酸的作用。即人體合成肌酸過程為依賴甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶和胍基乙酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶這兩種生物酶的催化作用,以甘氨酸、精氨酸和S-腺苷蛋氨酸為主要原料,合成肌酸。提示,血清CK含量的異常表達(dá)也與肌酸、甘氨酸、精氨酸和S-腺苷蛋氨酸表達(dá)異常有一定相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,草烏致心率和心電圖異常,升高血清CK含量、引起明顯的心肌細(xì)胞胞質(zhì)疏松及細(xì)胞水腫的表征均與心臟組織中N、N-二甲基精氨酸和腺苷蛋氨酸異常升高有關(guān);訶子解草烏心臟毒性的機(jī)制主要與降低心臟組織中肌酸有關(guān)。