電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖鼠脂肪酸合成酶(Fas)的調(diào)控機(jī)制研究

司原成,任晨晨,陳 波,張二偉,康朝霞,李志菊,高璐琪

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025)

肥胖的問(wèn)題日趨嚴(yán)重,已成為全球流行的慢性疾病[1-2],其形成發(fā)展與脂質(zhì)代謝關(guān)系密切[2]。研究表明,單純性肥胖癥患者存在一定程度血脂異常,血清中脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子顯著高于正常人[3]。中醫(yī)名家朱丹溪《丹溪心法》闡明“肥人多痰濕”[4],《黃帝內(nèi)經(jīng)》詳載過(guò)食肥甘、膏粱厚味等物,易于阻礙脾胃運(yùn)化功能,導(dǎo)致肥胖出現(xiàn)[5]。針灸是中醫(yī)學(xué)中重要的治療方法之一,電針是針刺方法之一[6]。針灸治療單純性肥胖從健脾、益氣、化痰等角度入手,治療單純性肥胖癥,選擇中脘、關(guān)元、天樞、足三里等四穴疏通經(jīng)絡(luò)、通調(diào)腑氣,降脂化痰,調(diào)控脂質(zhì)代謝途徑[7]。

課題組在肥胖研究過(guò)程中,利用新科學(xué)技術(shù)探尋肥胖治療的有效方式,在電針治療肥胖顯效的基礎(chǔ)上,比較治療前后脂肪酸合成酶(Fas)代謝調(diào)控的顯著變化,深入研究揭示單純性肥胖癥的機(jī)制?，F(xiàn)將課題組研究成果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)C57BL/6小鼠,8周齡,體質(zhì)量(30±2)g,購(gòu)買(mǎi)于長(zhǎng)沙天勤生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(湘)2019-0013],飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi),溫度23～25℃,濕度40%～60%,晝夜各半,7∶00-19∶00開(kāi)燈,19∶00-7∶00關(guān)燈。自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)符合貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理相關(guān)規(guī)定,倫理編號(hào):20210022。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司的脂聯(lián)素(ADPN)試劑盒(批號(hào):57KIPS 7RAG)和瘦素(LEP)試劑盒(批號(hào):Q263T2L4IP);南京建成生物工程研究所的CHO試劑盒(批號(hào):20210629)和TG試劑盒(批號(hào):20210629)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(型號(hào):ELX808 IU-P;廠家:美國(guó)寶特公司);小型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(型號(hào):Multiskan X1R;廠家:美國(guó)THermoScientic公司);快速核酸提取儀(型號(hào):FastPrep-24;美國(guó)MP Biomedicals公司);電子針灸治療儀(型號(hào):G6805-Ⅱ型;青島鑫生實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法 課題實(shí)驗(yàn)參照高脂飲食誘導(dǎo)肥胖,建立C57BL/6小鼠肥胖癥模型[8-9]。將購(gòu)買(mǎi)得到的50只小鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)5d,隨機(jī)選取10只作為正常組,其余40只飼以高脂飲食8周,得到體質(zhì)量顯著高于正常組均值20%的肥胖小鼠20只。正常組小鼠,繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料,肥胖鼠繼續(xù)飼養(yǎng)高脂飲食。

1.2.2 分組及干預(yù) 將復(fù)制得到的20只肥胖小鼠均分成模型組和電針組。電針組,所選穴位參照2021版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10],斜刺天樞4mm,斜刺關(guān)元5mm,直刺足三里3mm,直刺三陰交4mm,施以捻轉(zhuǎn)手法,得氣后,接通電針儀,疏密波,30～150Hz之間,強(qiáng)度1～2mA,以局部輕微顫抖為度,留針10min,日1次,左右交替取穴,正常組與模型組不予電針干預(yù),以相同方式固定10min。

1.2.3 取材 每周定期測(cè)量所有小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)治療干預(yù)后,股動(dòng)脈采血,脫頸椎處死,無(wú)菌操作剖開(kāi)腹腔,剪取腎周脂肪組織和肝臟組織,稱(chēng)重后,剪取1cm×1cm大小的組織,放置于無(wú)菌無(wú)酶的2mL平底EP管中,-80℃冰箱保存,用于檢測(cè)Fas代謝相關(guān)指標(biāo)的差異變化。

1.2.4 檢測(cè) (1)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA):參照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū),測(cè)定實(shí)驗(yàn)鼠血清血脂CHO、TG、LEP、ADPN及脂肪組織中Fas含量的差異變化。

(2)HE染色:參照HE染色的說(shuō)明書(shū)和操作方法,觀察選擇400倍視野下上、下、左、右四個(gè)脂肪細(xì)胞的直徑進(jìn)行分析,觀察各組脂肪組織直徑的差異變化。

(3)油松染色:使用200倍成像的顯微鏡,使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件測(cè)量每張切片中三個(gè)視野脂滴像素面積和對(duì)應(yīng)的組織像素面積,計(jì)算公示如下:脂滴面積占比(%)=脂滴像素面積/組織像素面積×100%。

(4)Fas基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)量:檢測(cè)Fas基因采用Rt-PCR方法進(jìn)行[11]。利用Trizol法提取組織總RNA,通過(guò)提取試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,再通過(guò)目標(biāo)引物(5′-AGCCCGGCCAGCGATACAGA-3′;3′-TGGATACCGGGCCCACCAGG-5′)測(cè)定Fas基因的相對(duì)表達(dá)量。檢測(cè)Fas蛋白采用Western blot(WB)方法進(jìn)行。參照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū),提取小腸中段組織的總蛋白,通過(guò)Fas的單克隆抗體檢測(cè)其在各組實(shí)驗(yàn)鼠中的含量水平。Rt-PCR和WB方法檢測(cè),重復(fù)3遍。

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的影響

如表1所示,治療前,模型組和電針組實(shí)驗(yàn)鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)均顯著高于正常組;經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組的實(shí)驗(yàn)鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)均明顯降低。

表1 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠體質(zhì)量及Lee’s指數(shù)的影響

2.2 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠血脂及血糖的影響

如表2所示,模型組血清CHO、TG、LDL-C含量均明顯高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組實(shí)驗(yàn)鼠血清CHO、TG、LDL-C均明顯降低。各組血清HDL-C和血糖均無(wú)明顯變化。

表2 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠血脂及血糖的影響

2.3 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠脂肪細(xì)胞因子ADPN及LEP的影響

如表3所示,模型組腎周脂肪組織中ADPN明顯低于正常組,而LEP含量均明顯高于正常組;經(jīng)電針干預(yù)21d后,電針組實(shí)驗(yàn)鼠腎周脂肪組織中ADPN明顯升高,LEP含量均明顯降低。

表3 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠脂肪細(xì)胞因子ADPN及LEP的影響

2.4 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠腎周脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1所示,模型組腎臟周?chē)窘M織的質(zhì)量(圖1d)、細(xì)胞形態(tài)直徑(圖1 b)的均值顯著高于正常組(圖1a),電針治療后腎臟周?chē)镜馁|(zhì)量和細(xì)胞直徑(圖1c、圖1e)明顯減少。

圖1 各組腎臟周?chē)窘M織的形態(tài)、脂肪細(xì)胞直徑的變化

2.5 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠肝臟組織中脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

如圖2所示,模型組肝臟組織中油粒大小的分布(圖2b)的均值顯著高于正常組(圖2a),電針治療后肝臟組織中油粒分布明顯降低(圖2c)。

圖2 各組肝臟組織中油粒分布的差異變化

2.6 電針對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖鼠各組脂肪組織中Fas含量、Fas基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)的變化

如圖3a所示,模型組脂肪組織中Fas的含量顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas的含量均顯著下降(P<0.01)。如圖3b所示,模型組脂肪組織中Fas基因的表達(dá)的顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。如圖3c所示,模型組脂肪組織中Fas蛋白的表達(dá)顯著高于正常組,經(jīng)電針干預(yù)治療后,肥胖鼠脂肪組織中Fas基因的表達(dá)顯著下降(P<0.01)。

圖3 各組脂肪組織中Fas含量、Fas基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)的變化

3 討論

目前,單純性肥胖癥已成為健康問(wèn)題,是健康的高危影響因素,其與眾多疾病關(guān)系密切,如糖尿病、高血壓、高脂血癥、關(guān)節(jié)炎及部分癌癥等[12]。單純性肥胖癥在形成發(fā)展進(jìn)程中,與機(jī)體脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切,常伴隨有血脂異常升高,脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(ADPN、LEP等)明顯升高,這些細(xì)胞因子是調(diào)整機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡的重要內(nèi)分泌激素,其水平的高低直接關(guān)系機(jī)體脂質(zhì)代謝調(diào)控[13]。此外,有研究表明[14],單純性肥胖癥的發(fā)展還與機(jī)體脂肪細(xì)胞的堆積有關(guān),進(jìn)一步造成肥胖癥患者體型的異常發(fā)展[15]。

在傳世的中醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中,單純性肥胖癥的形成病因與痰、濕、虛、瘀四大因素有關(guān),體現(xiàn)為本虛(氣虛)、標(biāo)實(shí)(膏脂、痰濁)的證候。先天稟賦不足,嗜以膏粱厚味,脾失健運(yùn),導(dǎo)致痰濕蓄積而發(fā)肥胖[16]。通常運(yùn)用健脾、益氣、祛濕、化痰的方法進(jìn)行治療,整體調(diào)節(jié)臟腑功能,促進(jìn)脂質(zhì)代謝分解。針灸是中醫(yī)學(xué)干預(yù)疾病的重要治療手段之一,通過(guò)疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理腸腑、祛濕化痰等作用治療單純性肥胖癥[17]。電針是針刺療法常用且可量化實(shí)施的方法之一,目前廣泛應(yīng)用于治療針灸適宜病種,如單純性肥胖癥[18]。電針將電信號(hào)以波的形式輸送到針刺部位,持續(xù)為針刺腧穴行針,提高針刺治療效果,而且電針輸送生物電信息,通過(guò)針體直接作用于脂肪層,促進(jìn)脂肪組織的脂質(zhì)代謝,更好達(dá)到減肥消脂的目的[19]。電針選取中脘、關(guān)元、天樞、足三里四穴進(jìn)行治療,中脘是“腑會(huì)”和“胃之募穴”,調(diào)理腸胃,促進(jìn)代謝;天樞是“大腸募穴”,疏調(diào)水道,消脂減肥;關(guān)元是“小腸募穴”,調(diào)解腸腑功能;足三里是胃“下合穴”,治療胃腸疾患;四穴合用,共奏健脾、益氣、減肥、消脂功效[20]。

本實(shí)驗(yàn)選用近交系C57BL小鼠,其較容易建立穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)型肥胖模型[21],通過(guò)60%的高脂飼料喂養(yǎng),約有50%的小鼠能夠肥胖。通過(guò)觀察不同組別實(shí)驗(yàn)鼠的整體水平數(shù)據(jù),課題組發(fā)現(xiàn)電針顯著降低肥胖鼠體質(zhì)量和體脂;進(jìn)一步研究表明,模型肥胖鼠血清CHO和TG顯著高于正常組,經(jīng)過(guò)治療后,顯著降低肥胖鼠血清CHO和TG的含量。脂肪組織分泌特有激素脂肪細(xì)胞因子ADPN和LEP是調(diào)解脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵激素,合成及堆積脂肪,通過(guò)活化肌肉組織中腺苷酸激活蛋白激酶途徑及過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α,增加脂肪酸氧化,抑制脂肪脂質(zhì)代謝[22]。模型肥胖鼠腎臟周?chē)窘M織中分泌的ADPN和LEP均顯著高于正常鼠,經(jīng)過(guò)治療后,肥胖鼠的脂肪組織中的ADPN和LEP也得到有效改善。在單純性肥胖的形態(tài)學(xué)研究中,模型肥胖鼠腎臟周?chē)炯?xì)胞的直徑和體積顯著增加,肝臟組織細(xì)胞中的脂肪油粒比重顯著高于正常小鼠,經(jīng)過(guò)治療后,肥胖鼠腎臟周?chē)炯?xì)胞直徑及肝臟組織細(xì)胞中脂肪油粒明顯減小。

在脂質(zhì)代謝中,Fas起關(guān)鍵作用,在脂肪組織儲(chǔ)存和運(yùn)輸能量,維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,提供多種激素合成所需的中間產(chǎn)物等方面起到重要作用[23]。模型肥胖鼠腎周脂肪組織中Fas含量顯著高于正常鼠,并腎周脂肪組織中的Fas基因和蛋白的表達(dá)顯著高于正常鼠,經(jīng)治療后,肥胖鼠腎臟周?chē)窘M織中Fas含量及基因蛋白的表達(dá)顯著降低,表明電針具有調(diào)整Fas基因及蛋白表達(dá)的重要作用。

綜上所述,電針良性調(diào)控對(duì)營(yíng)養(yǎng)型肥胖癥小鼠的體質(zhì)量、血脂(CHO、TG)、脂肪細(xì)胞因子(ADPN、LEP)、脂肪組織的形態(tài)及油粒分布。在機(jī)體脂質(zhì)代謝上,電針顯著調(diào)節(jié)脂肪組織中的FAS含量及基因和蛋白的表達(dá)功能,進(jìn)而調(diào)整機(jī)體脂質(zhì)代謝。課題組會(huì)在進(jìn)一步的研究中確認(rèn)其更密切的作用關(guān)系。電針改善肥胖癥的脂質(zhì)代謝有重要意義。