海島棉CAD和CAD-Like基因家族的鑒定、表達(dá)及其對(duì)大麗輪枝菌的響應(yīng)

張鈺佳，崔凱文，段力升，曹愛萍,2，謝全亮,2，沈海濤,2，王斐,2，李鴻彬,2

海島棉CAD和CAD-Like基因家族的鑒定、表達(dá)及其對(duì)大麗輪枝菌的響應(yīng)

張鈺佳1，崔凱文1，段力升1，曹愛萍1,2，謝全亮1,2，沈海濤1,2，王斐，李鴻彬

1石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003；2綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003

【目的】肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶，在增強(qiáng)植物機(jī)械強(qiáng)度、抵御病原菌入侵等方面發(fā)揮重要作用。鑒定海島棉GbCAD、GbCAD-LIKE（GbCADL）基因家族成員，并對(duì)其表達(dá)特征及其在黃萎病抗性中的作用進(jìn)行分析，為棉花抗黃萎病機(jī)制的解析及抗病育種提供參考?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)方法對(duì)海島棉GbCAD、GbCADL基因家族成員進(jìn)行鑒定，并對(duì)其染色體定位、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式元件的預(yù)測進(jìn)行系統(tǒng)分析。通過獲得公開釋放的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析GbCAD基因及GbCADL基因的表達(dá)特征。利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)對(duì)GbCAD基因及GbCADL基因進(jìn)行功能分析。【結(jié)果】從海島棉中鑒定到25個(gè)GbCAD基因（分布在10條染色體）和34個(gè)GbCADL基因（分布在17條染色體）。GbCAD基因分為3個(gè)亞組，GbCADL基因分為4個(gè)亞組，同一個(gè)組內(nèi)基因含有相似的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域。GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特征，其啟動(dòng)子中含有多種激素和脅迫響應(yīng)元件。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR顯示，、、、、的表達(dá)受大麗輪枝菌誘導(dǎo)，尤其是、、、的表達(dá)在大麗輪枝菌處理后顯著增加。利用VIGS技術(shù)，將顯著受大麗輪枝菌誘導(dǎo)表達(dá)的、、、分別在棉花中沉默，分析VIGS株系對(duì)大麗輪枝菌抗性的變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照植株相比，VIGS株系對(duì)大麗輪枝菌的抗性顯著降低。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色結(jié)果顯示，在未受到黃萎病侵染時(shí)，VIGS植株和對(duì)照植株的染色程度無顯著差異；在大麗輪枝菌處理6 h后，與對(duì)照植株相比，沉默株系、、、均表現(xiàn)出較深的著色，表明在沉默株系中有較高的活性氧累積。莖的切片結(jié)果顯示，大麗輪枝菌處理后，TRV:、TRV:、TRV:、TRV:沉默株系的莖維管組織表現(xiàn)出明顯的深褐色，表明其對(duì)大麗輪枝菌的抗性顯著降低?！窘Y(jié)論】抑制、、、的表達(dá)可以顯著降低棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。

海島棉；肉桂醇脫氫酶；基因家族；表達(dá)特征；基因沉默；大麗輪枝菌

0 引言

【研究意義】大麗輪枝菌（）引起的黃萎病是一種具有破壞性的土傳維管束病害，對(duì)植物具有廣泛的侵害性，通常會(huì)引起植物發(fā)育不良、枯萎、維管束褐變等，最終導(dǎo)致植物生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響甚至死亡[1]。棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物和天然纖維作物，在種植過程中容易受黃萎病的危害，該真菌病害嚴(yán)重影響棉花的生長、品質(zhì)以及產(chǎn)量。中國棉田中的黃萎病主要由大麗輪枝菌侵染所致[2]。研究棉花中響應(yīng)大麗輪枝菌的關(guān)鍵基因及其功能，對(duì)于抗病機(jī)制解析及抗病棉花材料培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】木質(zhì)素（lignin）是一種植物體內(nèi)重要的大分子有機(jī)物質(zhì)，主要存在于次生加厚的細(xì)胞壁中[3]，能增強(qiáng)植物體機(jī)械強(qiáng)度及細(xì)胞壁的硬度，進(jìn)而增強(qiáng)植物抵御生物和非生物脅迫[4]。當(dāng)植物受到病原菌侵害時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列信號(hào)通路誘導(dǎo)植物防御相關(guān)基因的表達(dá)和一些化合物的產(chǎn)生，如萜類和苯丙烷[5]，苯丙烷途徑進(jìn)一步可合成木質(zhì)素單體，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗病性[6-7]。木質(zhì)素主要由香豆醇、松柏醇、芥子醇3種木質(zhì)醇單體聚合而成，根據(jù)這3種不同單體最終形成3種類型的木質(zhì)素，分別是對(duì)-羥基苯基丙烷木質(zhì)素（H-木質(zhì)素）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G-木質(zhì)素）、紫丁香基木質(zhì)素（S-木質(zhì)素）[8]。木質(zhì)素可通過增強(qiáng)植物機(jī)械強(qiáng)度、增厚細(xì)胞壁形成物理屏障以抑制病原體入侵[9-12]。木質(zhì)素對(duì)黃萎病的抗性與活性氧（reactive oxygen species，ROS）信號(hào)介導(dǎo)的植物防御反應(yīng)密切相關(guān)[13-14]。肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是一類NADPH依賴性酶，是調(diào)控木質(zhì)素單體生物合成的關(guān)鍵酶，對(duì)于木質(zhì)素的合成發(fā)揮著重要作用[7]。當(dāng)植物受到外界環(huán)境的刺激或誘導(dǎo)時(shí)，植物各組織會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，形成特定的機(jī)制，木質(zhì)化過程或木質(zhì)素大量沉積也是對(duì)逆境脅迫的一種響應(yīng)機(jī)制[15]。研究發(fā)現(xiàn)，香瓜抗病材料PMR-45在接種白粉病菌24 h后，被侵入的表皮細(xì)胞發(fā)生木質(zhì)化[16]。亞麻CAD基因在不同組織器官對(duì)鐮刀菌侵染具有不同程度的響應(yīng)[17]。通過對(duì)3個(gè)玉米品種接種串珠鐮刀菌（），發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素含量與品種抗莖腐病的能力呈顯著正相關(guān)[18]。大麗輪枝菌誘導(dǎo)的木質(zhì)化賦予植物對(duì)黃萎病的抗性[19]。棉花轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌誘導(dǎo)了木質(zhì)素生物合成基因的上調(diào)[20]。木質(zhì)素合成基因能夠通過調(diào)節(jié)木質(zhì)化和酚含量參與對(duì)黃萎病的抗性；木質(zhì)素合成受到轉(zhuǎn)錄因子GhMYB4的調(diào)控，進(jìn)而參與對(duì)大麗輪枝菌的響應(yīng)[21-22]。擬南芥有9個(gè)CAD基因和8個(gè)CADL基因，一些已被證明與木質(zhì)素生物合成有關(guān)[23-24]。和在花、莖的木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用[25]；甜瓜和的表達(dá)受干旱的誘導(dǎo)，并可以促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成[26]；抑制擬南芥和小麥CAD基因的表達(dá)，顯著降低植物對(duì)病原菌的抗性[27-28]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】海島棉具有較好的黃萎病抗性，目前，關(guān)于海島棉GbCAD基因和GbCADL基因參與棉花大麗輪枝菌響應(yīng)的研究及調(diào)控機(jī)制鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究基于海島棉全基因組信息，通過生物信息學(xué)方法對(duì)GbCAD基因和GbCADL基因家族成員進(jìn)行鑒定，分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉不同組織和大麗輪枝菌侵染下的表達(dá)特征，利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)抑制GbCAD基因和GbCADL基因的表達(dá)，分析其在海島棉響應(yīng)大麗輪枝菌處理下的功能，為棉花抗病遺傳改良提供有效的候選基因，為棉花抗黃萎病機(jī)制解析及抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為海島棉品種新海21號(hào)，其種子由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院103實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 數(shù)據(jù)庫下載與分析工具

從Cottongen（https://www.cottongen.org/）下載海島棉基因組數(shù)據(jù)，通過本地BLAST構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫。從TAIR（https://www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥同源CAD、CADL蛋白質(zhì)序列，以擬南芥同源CAD、CADL蛋白序列為命中序列，使用BLASTP命令（e-value：1e-30）調(diào)取海島棉的CAD、CADL蛋白序列。取相似度大于50%的蛋白序列，提交Pfam（https://pfam.xfam.org/）進(jìn)行在線預(yù)測，有CAD、CADL保守結(jié)構(gòu)域的確定為CAD基因和CADL基因家族成員。

1.3 CAD基因和CADL基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對(duì)海島棉和擬南芥的CAD、CADL蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)。利用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000，將生成的無根樹提交ITOL（http://itol.embl.de/）形成環(huán)形進(jìn)化樹。

1.4 GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位分析

利用本地BLAST從海島棉基因組數(shù)據(jù)庫中獲取GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位信息，運(yùn)用TBtools軟件作圖。

1.5 GbCAD基因和GbCADL基因的結(jié)構(gòu)分析

從海島棉基因組數(shù)據(jù)庫中（https://cottonfgd.org/）下載海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的信息，基于MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。利用MEME（http:// meme-suite.org/tools/meme）進(jìn)行motif預(yù)測，設(shè)置查找10個(gè)motif，利用TBtools軟件進(jìn)行可視化。

1.6 啟動(dòng)子順式元件組成分析

使用TBtools中的Gff3 Sequence Extractor 提取GbCAD基因和GbCADL基因起始密碼子前2 000 bp的啟動(dòng)子區(qū)序列，并提交在線分析軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/）分析啟動(dòng)子的順式作用元件組成，通過TBtools中的Simple BioSequence Viewer軟件進(jìn)行可視化。

1.7 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的表達(dá)特征

利用海島棉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭、胚珠和纖維（0 d的胚珠及開花后10、15、18、21和28 d的纖維）的表達(dá)特征。

1.8 總RNA的提取和cDNA的制備

選取海島棉品種新海21號(hào)，分別在大麗輪枝菌浸染處理前（0 h）和處理后6、24、48和72 h取棉花的葉片和根，采用多酚多糖植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物，大連）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)qRT-PCR試驗(yàn)分析。

1.9 GbCAD基因和GbCADL基因響應(yīng)大麗輪枝菌處理的表達(dá)分析

基于海島棉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果，選擇顯著優(yōu)勢表達(dá)的、、、、和，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物，檢測其在響應(yīng)大麗輪枝菌浸染不同時(shí)期的表達(dá)特征。按照熒光定量試劑盒（全式金，北京）說明書設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。以作為內(nèi)參基因，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.10 GbCAD10A/D、GbCADL4A/D、GbCADL6A/D和GbCADL7A/D VIGS沉默載體的構(gòu)建

根據(jù)、、和的序列，選取特異目的片段，以海島棉cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化后產(chǎn)物與TRV沉默載體連接，并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將測序正確的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404中，將TRV:、TRV:、TRV:和TRV:分別轉(zhuǎn)化海島棉。

1.11 大麗輪枝菌浸染處理棉花

將TRV:、TRV:、TRV:、TRV:、TRV:、PDS和輔助菌液在含有卡那霉素、鏈霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床過夜培養(yǎng)（28 ℃，16 h），使用離心機(jī)收集菌體（4 000 r/min，10 min），再用重懸液（MES、乙酰丁香酮、MgCl2）進(jìn)行重懸，測OD值為1.1左右時(shí)，將各個(gè)載體重懸液和輔助載體重懸液按照1﹕1進(jìn)行混合，室溫黑暗培養(yǎng)3 h以上。選取子葉完全展開的棉花幼苗進(jìn)行注射，注射之后黑暗處理24 h，隨后置于23 ℃的溫室（16 h光照，8 h黑暗）繼續(xù)培養(yǎng)。三葉期對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組分別進(jìn)行大麗輪枝菌浸染處理，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.12 DAB染色

配制二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色液，按照Ａ液﹕Ｂ液＝19﹕1混勻備用。分別取棉花接種大麗輪枝菌0、6和12 h后的葉片，用無菌水沖洗干凈后，將葉片置于離心管中，加入適量的染色液于室溫避光染色9 h，隨后用95%的酒精脫色。每天更換無水乙醇，2—3 d后，用無菌水洗脫后拍照記錄。

1.13 沉默植株表型觀察

在海島棉三葉期進(jìn)行大麗輪枝菌浸染15 d后，觀察沉默植株與空載植株的表型。用滅菌后的鋒利刀片對(duì)沉默植株和空載對(duì)照植株的莖部進(jìn)行縱剖，然后使用光學(xué)顯微鏡觀察其感病程度，從而比較不同植株維管束被黃萎病侵害后的差異。

1.14 抗病性分析

采用灌根法接種大麗輪枝菌，其發(fā)病情況調(diào)查使用5級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[29]。0級(jí)：葉片無病斑；1級(jí)：1—2片葉片出現(xiàn)萎蔫；2級(jí)：3—5片葉片出現(xiàn)萎蔫；3級(jí)：大部分葉片出現(xiàn)萎蔫；4級(jí)：植株萎凋枯死或即將萎凋枯死[30]。病情指數(shù)指標(biāo)可作為植株抗病能力的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，病情指數(shù)=∑（發(fā)病級(jí)數(shù)×株數(shù)）/（最高發(fā)病級(jí)數(shù)×總株數(shù)）×100%[31]。

2 結(jié)果

2.1 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的全基因組鑒定

在海島棉基因組中共篩選得到25個(gè)GbCAD基因和34個(gè)GbCADL基因，分別分布在10條染色體和17條染色體（或scaffold）（圖1）。根據(jù)每個(gè)基因在染色體的位置及序列的同源性，將海島棉GbCAD基因命名為—，將海島棉GbCADL基因命名為—。

2.2 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析海島棉GbCAD基因、GbCADL基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將擬南芥AtCAD基因、AtCADL基因與海島棉GbCAD基因、GbCADL基因整合，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖2）。CAD基因可分為A、B和C 3個(gè)亞組，包含9個(gè)AtCAD基因和25個(gè)GbCAD基因。CADL基因可分為D、E、F和G 4個(gè)亞組，包含8個(gè)AtCADL基因和34個(gè)GbCADL基因。

2.3 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因結(jié)構(gòu)與保守基序分析

CAD基因和CADL基因聚類為2個(gè)不同的類群（圖3-A）；基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，GbCAD基因的外顯子數(shù)目為3—6個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目為2—5個(gè)。GbCADL基因的外顯子數(shù)目和內(nèi)含子數(shù)目相較于GbCAD基因較多，外顯子數(shù)目為7—10個(gè)，內(nèi)含子數(shù)目為6—9個(gè)（圖3-B），表明CAD基因和CADL基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)具有多樣性。保守基序分析發(fā)現(xiàn)，GbCAD基因均含有motif1、motif4和motif10 3個(gè)保守基序，GbCADL基因均含有motif1、motif5、motif6和motif9 4個(gè)保守基序。不同組CAD基因和CADL基因之間的基序類型存在一定差異，但在同一聚類組中的成員表現(xiàn)出相似的基序組成模式（圖3-C）。

圖1 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的染色體定位

圖2 海島棉和擬南芥CAD及CADL基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

A：系統(tǒng)發(fā)育樹；B：基因結(jié)構(gòu)分析；C：保守結(jié)構(gòu)域分析

2.4 啟動(dòng)子順式作用元件組成分析

啟動(dòng)子順式作用元件組成結(jié)果顯示，海島棉GbCAD基因和GbCADL基因中含有多種激素相關(guān)的響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件（圖4），如脫落酸響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件等。還發(fā)現(xiàn)了一些與脅迫相關(guān)的順式作用元件，如干旱響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、防御應(yīng)激元件以及厭氧響應(yīng)元件等。結(jié)果表明，GbCAD基因和GbCADL基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含不同順式作用元件，可能在調(diào)節(jié)植物逆境脅迫響應(yīng)和激素的響應(yīng)等過程中發(fā)揮著潛在的重要作用。

2.5 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組分析GbCAD基因和GbCADL基因在海島棉的根、莖、葉、花瓣、花藥、柱頭、胚珠和纖維的表達(dá)特征，結(jié)果顯示，、、、、、在根、莖、葉、胚珠和纖維組織中優(yōu)勢表達(dá)；和在花瓣、花藥和柱頭中優(yōu)勢表達(dá)，和在花瓣、花藥、柱頭和纖維中顯著累積，在纖維表現(xiàn)出獨(dú)特的特異性高表達(dá)（圖5）；表明這些基因在組織器官發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。大麗輪枝菌脅迫不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，、、、、和的表達(dá)顯著累積（圖6）；進(jìn)一步對(duì)這些基因在大麗輪枝菌處理不同時(shí)間的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，、、、的表達(dá)均顯著受到大麗輪枝菌處理的誘導(dǎo)（圖7），表明這些GbCAD基因和GbCADL基因在棉花響應(yīng)大麗輪枝菌過程中的重要作用。

圖4 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因啟動(dòng)子的順式作用元件組成分析

2.6 抑制GbCAD基因和GbCADL基因的表達(dá)降低海島棉對(duì)大麗輪枝菌的抗性

利用VIGS技術(shù)對(duì)顯著響應(yīng)大麗輪枝菌處理誘導(dǎo)表達(dá)的、、和進(jìn)行抑制表達(dá)，分析這些基因表達(dá)的變化與大麗輪枝菌抗性之間的聯(lián)系。棉花的沉默，導(dǎo)致棉花后期新出現(xiàn)的真葉表現(xiàn)白化（圖8-A），表明抑制基因表達(dá)的遺傳轉(zhuǎn)化成功有效。取陽性植株與對(duì)照植株接種大麗輪枝菌0、6和12 h后的棉花葉片進(jìn)行DAB染色，空載體對(duì)照植株和轉(zhuǎn)化植株在未受到黃萎病侵染時(shí)，染色結(jié)果無差異；在接菌后6 h，與對(duì)照植株相比，VIGS轉(zhuǎn)化株系TRV: G、TRV:、TRV:、TRV:表現(xiàn)出顯著加深的棕褐色（圖8-B），表明這些基因的沉默表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)活性氧的累積；

圖5 海島棉GbCAD基因和GbCADL基因的組織表達(dá)特征分析

圖6 GbCAD基因和GbCADL基因響應(yīng)大麗輪枝菌處理的表達(dá)分析

GbUBQ7為內(nèi)參基因，不同字母間表示樣本的顯著差異（p＜0.05）。下同

與對(duì)照植株相比，VIGS轉(zhuǎn)化株系在受到大麗輪枝菌浸染后葉片枯萎，表現(xiàn)出對(duì)大麗輪枝菌敏感性的增加（圖8-C）。對(duì)海島棉莖縱切面的觀察結(jié)果顯示，在大麗輪枝菌處理后，與對(duì)照相比，VIGS轉(zhuǎn)化株系TRV:G、TRV:、TRV:、TRV:表現(xiàn)出莖維管組織顯著的深褐色和更高的病情指數(shù)（圖8-D和圖8-E）。結(jié)果表明，抑制、、和的表達(dá)降低了棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性，暗示它們?cè)诿藁憫?yīng)大麗輪枝菌過程中的重要作用。

3 討論

3.1 GbCAD基因和GbCADL基因家族的鑒定與表達(dá)分析

肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成途徑中最早研究的酶類，是木質(zhì)素單體合成過程中的最后一步關(guān)鍵酶[32]，在木質(zhì)素種類和功能多樣性中發(fā)揮重要作用[33]。目前，在許多物種中鑒定到CAD基因，如擬南芥有9個(gè)CAD基因和8個(gè)CADL基因[34]，水稻有12個(gè)CAD基因[35]，高粱有14個(gè)CAD基因[36]，楊樹有15個(gè)CAD基因[37]，陸地棉有19個(gè)CAD基因和27個(gè)CADL基因[38]。

本研究在海島棉基因組中鑒定得到25個(gè)GbCAD基因和34個(gè)GbCADL基因，分布在不同的染色體上（圖1）；擬南芥和海島棉CAD基因和CADL基因分別可分為3個(gè)亞組和4個(gè)亞組（圖2），、、聚類于A組，、與木質(zhì)素的合成過程密切相關(guān)[39]；在紫丁香假單胞菌（）侵染擬南芥的過程中，該基因受到誘導(dǎo)表達(dá)[28]，在和缺失的雙突變體中木質(zhì)素的含量顯著降低[25]，表明它們不僅與擬南芥木質(zhì)素合成相關(guān)，還與植物木質(zhì)素防御途徑相關(guān)[23]。棉花/在根、莖中具優(yōu)勢表達(dá)，且受到大麗輪枝菌的誘導(dǎo)表達(dá)（圖5和圖6），表明/可能通過調(diào)控木質(zhì)素的合成進(jìn)而參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的響應(yīng)過程。同組的CAD基因和CADL基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域（圖3），表明它們可能具有功能的相似性。

A：陽性對(duì)照植株葉片表型；B：大麗輪枝菌處理后的葉片DAB染色分析；C：大麗輪枝菌浸染后的棉花植株表型分析；D：大麗輪枝菌浸染后的棉花莖縱剖圖；E：大麗輪枝菌浸染后的棉花病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)

3.2 GbCAD基因和GbCADL基因功能發(fā)揮與植物的抗病響應(yīng)密切相關(guān)

在對(duì)患易碎葉病的棗椰樹的研究中發(fā)現(xiàn)，易碎葉病誘導(dǎo)了棗椰樹和在根中的表達(dá)，與木質(zhì)素合成相關(guān)的在感病植株的葉片和根中的表達(dá)也顯著增強(qiáng)[40]。擬南芥木質(zhì)素合成的主要基因和是防御細(xì)菌性葉斑病的主要成分，的表達(dá)也受細(xì)菌性葉斑病處理的誘導(dǎo)[41]。沉默小麥植株后，植株葉片組織更易感小麥白粉病菌[42]。這表明CAD基因在植物抗病過程中起著重要作用。接種細(xì)菌性葉斑病的雙突變體與野生型相比，水楊酸（SA）通路基因的表達(dá)水平在接種病菌時(shí)被顯著誘導(dǎo)，且雙突變體中的SA含量減少，表明SA可能是參與抗病的信號(hào)分子[41]。外源SA處理誘導(dǎo)感病香蕉品種和耐病香蕉品種根組織中苯丙烷類途徑與木質(zhì)素產(chǎn)生，提高對(duì)TR4的抗病性[43]，表明CAD基因可能通過水楊酸激素信號(hào)途徑調(diào)控其對(duì)病原菌的抗性。本研究中GbCAD基因和GbCADL基因的啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)激素和脅迫響應(yīng)元件（圖4），可能在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用；、、和的表達(dá)顯著受到大麗輪枝菌處理的誘導(dǎo)（圖6和圖7），暗示這些基因在棉花對(duì)大麗輪枝菌響應(yīng)過程中的重要功能。

在擬南芥中過量表達(dá)導(dǎo)致植物對(duì)寄生疫霉菌和辣椒疫霉菌的抗性減弱，的沉默抑制了疫霉菌的侵染[44]。本研究中，分別抑制、、和表達(dá)的棉花株系表現(xiàn)出對(duì)大麗輪枝菌抗性顯著降低的現(xiàn)象，莖維管組織表現(xiàn)出深褐色（圖8），表明它們?cè)诿藁憫?yīng)大麗輪枝菌過程中的重要作用。

4 結(jié)論

海島棉GbCAD基因和GbCADL基因具有不同的組織表達(dá)特征和受到大麗輪枝菌的誘導(dǎo)表達(dá)，抑制、、和的表達(dá)顯著降低海島棉對(duì)大麗輪枝菌的抗性。

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Identification and expression of CAD and CAD-Like gene families fromand Their response to

ZHANG YuJia1, CUI KaiWen1, DUAN LiSheng1, CAO AiPing1,2, XIE QuanLiang1,2, SHEN HaiTao1,2, WANG Fei, LI HongBin

1College of Life Sciences, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang;2Key Laboratory of Oasis Town and Mountain-Basin System Ecology of Xinjiang Production and Construction Corps, Shihezi 832003, Xinjiang

【Objective】Cinnamyl alcohol dehydrogenas(CAD) is a key enzyme in lignin synthesis pathway, which plays an important role in enhancing plant mechanical strength and resisting pathogen invasion. The aim of this study is to identifyCAD and CAD-Like (CADL) gene family members inand to analyze their expression characteristics and their role inwilt resistance, which provides reference for the mechanism elucidation and disease resistance breeding of cotton againstwilt. 【Method】The CAD andCADLgene family members ingenome were identified by bioinformatics method, and their chromosomal location, phylogenetic relationship, gene structure and promoter-element prediction were systematically analyzed. The expression characteristics of GbCAD and GbCADL were analyzed by obtaining publicly released transcriptome data and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR). Functional analysis of GbCADandGbCADL genes was performed by viral-induced gene silencing (VIGS) technique. 【Result】A total of 25 GbCAD and 34 GbCADL genes were identified fromand distributed on 10 and 17 different chromosomes, respectively. GbCAD and GbCADL genes are divided into 3 and 4 subgroups, respectively. The genes in the same group contain similar exon-intron structures and conserved domains. GbCAD and GbCADL genes have different transcriptional expression characteristics, and the promoters of GbCAD and GbCADL genes contain various hormone response elements and stress response elements. Transcriptome data and qRT-PCR showed that the expressions of,,,, andwere induced byespecially the,,, andindicated significant increased expressions undertreatment. The genes of,,, andwere respectively silenced in cotton by virus-induced gene silencing (VIGS) technology, to analyze the changes of VIGS plant lines againsttreatment. The results showed that, compared with the control plants, the VIGS plant lines indicated significant decreased resistance toThe results of diaminobenzidine (DAB) histochemical stain displayed that, both control and VIGS plants showed similar normal phenotype withoutaddition; after 6 h treatment of, the VIGS plant lines silencing,,,expressions demonstrated a deeper brown coloring, indicating a higher reactive oxygen species (ROS) accumulation in the VIGS plant lines. The results of stem sectioning showed that, the stem vascular tissues of VIGS plant lines TRV:,TRV:,TRV:,and TRV:showed obvious dark brown enrichment aftertreatment, indicating the significant decreased resistance to【Conclusion】 Suppressing the expressions of,,,could significantly reduce the cotton resistance to.

; cinnamyl alcohol dehydrogenase; gene family; expression characteristics; gene silencing;

2022-12-31；

2023-04-06

國家自然科學(xué)基金（31960413）、兵團(tuán)科技計(jì)劃（2016AC017）

張鈺佳，E-mail：1427740428@qq.com。通信作者王斐，E-mail：feiw@shzu.edu.cn。通信作者李鴻彬，E-mail：lihb@shzu.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.19.005

（責(zé)任編輯 李莉）