NH3和H2S降解功能菌的分離鑒定及降解特性研究

江海溶 崔若琪 王玥 白淼 張明露 任連海

（北京工商大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院國(guó)家環(huán)境保護(hù)食品鏈污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048）

2019年起，我國(guó)地級(jí)及以上城市全面開(kāi)展垃圾分類工作，其中將廚余垃圾單獨(dú)收集成為生活垃圾分類收集的重點(diǎn)工作［1］。廚余垃圾具有含水率高、有機(jī)質(zhì)高、含鹽量高、含油量高和易腐爛等特點(diǎn)，若處理不及時(shí)易產(chǎn)生惡臭，并會(huì)滋生病原微生物，引發(fā)環(huán)境污染問(wèn)題［2-3］。廚余垃圾所產(chǎn)生的惡臭不僅刺激人的嗅覺(jué)器官，而且很多組分是有毒有害氣體，對(duì)人體及動(dòng)植物造成危害［4］。惡臭氣體種類有很多，包括：H2S、SO2、NH3、CH4和二惡英等，雖然不同地區(qū)產(chǎn)生的廚余垃圾主要成分有所區(qū)別，但其中NH3和H2S是較為典型的惡臭氣體［5-6］。

目前對(duì)控制惡臭氣體的研究工作主要集中在化學(xué)除臭、物理除臭和生物除臭三方面。生物除臭以除臭效率高、無(wú)二次污染、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，成為治理惡臭環(huán)境的一個(gè)重要研究方向［7］。近年來(lái)，研究工作多集中在高效除臭優(yōu)勢(shì)菌株的選育，推廣應(yīng)用的研究多采用外國(guó)進(jìn)口的微生物制劑，以韓國(guó)的鈕咳厲惡、德國(guó)的潔博士、日本的EM菌劑為主［8-10］。目前國(guó)內(nèi)選育和復(fù)配的微生物除臭劑研究起步較晚，菌株除臭效果相對(duì)國(guó)外進(jìn)口的微生物菌劑存在一定的差距［11-12］。

本研究通過(guò)多種除臭微生物菌種的篩選，以NH3和H2S的降解率為除臭篩選指標(biāo)，優(yōu)選降解效率最高的菌株，確定其最佳培養(yǎng)條件和混合比例，最終混合成微生物除臭劑，應(yīng)用于廚余垃圾臭氣的降解。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 用無(wú)菌桶從北京工商大學(xué)東區(qū)學(xué)校食堂收集約1 kg廚余垃圾至化工樓實(shí)驗(yàn)室，用小型破碎機(jī)破碎后備用。取10 g廚余垃圾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)使用，剩余樣品在4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配方如下：

NH3降解菌篩選培養(yǎng)基［13］：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，1% ZnSO45 mL，NaCl 2.0 g，氨水10.0 mL，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min，氨水過(guò)濾除菌后加入；

H2S降解菌篩選培養(yǎng)基［14］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2S 2.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min；

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基［15］：C6H5Na3O75.0 g，（NH4）2SO40.45 g，K2HPO40.25 g，F(xiàn)eSO40.0025 g，NaCl 0.125 g，MgSO40.06 g，MnSO40.001 g，瓊脂粉15.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH=7.0，121℃滅菌20 min；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：稱取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基33 g，加蒸餾水至1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 NH3和H2S降解菌的富集與純化 經(jīng)20 000 r/min離心處理后的廚余垃圾，取100 μL上清液分別接入NH3和H2S選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行富集馴化［16］。將特征不同的菌落劃線純化至單菌后，分別吸取200 μL菌液于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，保存?zhèn)溆茫羧》蛛x后的菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基上，30℃、130 r/min，搖床擴(kuò)大培養(yǎng)72 h。

1.2.2 NH3和H2S降解菌的初篩 將分離純化獲得的菌株制作成5 mL菌液，接入裝有50 g新鮮廚余垃圾的1 000 mL廣口瓶中，混勻，同時(shí)以接種5 mL無(wú)菌水的廚余垃圾樣品作為對(duì)照，雙層塑料膜密封，置于30℃，130 r/min恒溫?fù)u床中發(fā)酵。發(fā)酵24 h后采用感官法對(duì)惡臭氣體強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將除臭能力明顯的菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)［17］。

1.2.3 NH3和H2S降解菌的復(fù)篩 選擇初篩中具有較好除臭效果的菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)，以10% 接種量將菌株接種至相應(yīng)的NH3和H2S降解菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)成菌液，置于30℃，130 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。每個(gè)菌株做3組平行，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與空白組進(jìn)行差異顯著性分析，計(jì)算NH3與H2S的降解率，確定NH3與H2S降解率較高的菌株。

1.2.4 最佳NH3和H2S降解菌的篩選 將復(fù)篩菌株的菌液接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，置于30℃，130 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)菌株做3組平行。培養(yǎng)24 h后取出菌液，計(jì)算出氨氮濃度和硫酸鹽濃度［18-19］，最終得出最佳NH3降解菌株和H2S降解菌株。

1.2.5 菌株的鑒定 采用革蘭氏染色法對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，分子生物學(xué)鑒定由北京開(kāi)泰明鏡基因科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定。16S rDNA基因擴(kuò)增的PCR引物為細(xì)菌通用引物，上游引物（341F）5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，下游引物（785R）5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，其中，上、下游引物各0.25 μL、模板DNA 2 μL，2×Mastermix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃使DNA預(yù)變性3 min；95℃使DNA變性30 s，55℃引物退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min將PCR產(chǎn)物純化后加入到 Illumina Novaseq 6000 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果后通過(guò)BLAST程序與NCBI GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，查找與各菌株相似性最高的菌株序列［20］。

1.2.6 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化 將分離得到的兩株細(xì)菌分別制作液體培養(yǎng)物，溫度梯度設(shè)置為25℃、30℃、35℃、40℃，培養(yǎng)48 h，每隔4 h取樣測(cè)量OD600值，根據(jù)生長(zhǎng)曲線變化情況，選擇最佳培養(yǎng)溫度。在最佳培養(yǎng)溫度下依次設(shè)置不同梯度的接種量、pH、C/N、碳源、氮源，130 r/min條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)定菌株的降解率，每組試驗(yàn)做3組平行，最終取平均值（表1）。

表1 除臭條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of optimal deodorizing conditions

1.2.7 混合培養(yǎng)對(duì)臭氣的降解效果 將獲得的兩株菌株在牛肉膏平板培養(yǎng)基上進(jìn)行交叉劃線，觀察交叉點(diǎn)是否有菌株生長(zhǎng)情況，兩者能生長(zhǎng)為不拮抗，一株或兩株都不能生長(zhǎng)為拮抗。若兩株菌株不產(chǎn)生拮抗，將其分別制作液體培養(yǎng)物，在最佳培養(yǎng)條件下，混合比例依次設(shè)置為1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1，130 r/min的搖床震蕩培養(yǎng)48 h，每隔4 h取出菌液，測(cè)量pH變化情況和吸光度，繪制濃度曲線，選擇最佳混合比例。在最佳混合比例下，培養(yǎng)72 h，每隔4 h取樣，檢測(cè)氨氮和硫酸鹽離子濃度變化情況，計(jì)算氨氮降解率和硫酸鹽生成率。每組試驗(yàn)做3組平行，最終取平均值。

1.2.8 分析方法 復(fù)篩降NH3試驗(yàn)：硼酸吸收凱氏定氮法［21］；復(fù)篩降H2S試驗(yàn)：鋅銨絡(luò)鹽比色法［22］；NH3降解效率的測(cè)定：納氏試劑分光光度法［23］；H2S降解效率的測(cè)定：采用鉻酸鋇分光光度法［24］。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用 Microsoft Office Excel 2022進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Origin Pro 2021bS R2進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 降解菌株的篩選

利用選擇性培養(yǎng)基共篩選到菌株40株，其中NH3降解菌株中細(xì)菌（CN）10株、真菌（PN）5株、乳酸菌（MN）5株，H2S降解菌株中細(xì)菌（CS）10株、真菌（PS）5株、乳酸菌（MS）5株。將氣味評(píng)判等級(jí)4、5的16株菌株去除，剩余24株菌株進(jìn)入復(fù)篩階段。

復(fù)篩采用降NH3和降H2S實(shí)驗(yàn)，計(jì)算培養(yǎng)液中NH3和H2S含量，與空白中的含量進(jìn)行對(duì)比，最終得出菌種所對(duì)應(yīng)的NH3或H2S的去除效率，選取去除率達(dá)到60%以上的菌株進(jìn)行NH3和H2S的高效降解菌的篩選。根據(jù)表2可知，共有8株菌株可進(jìn)入復(fù)篩，其中可降解NH3的編號(hào)為：CN5、CN10、PN1、PN3，可降解H2S的編號(hào)為：CS2、CS4、CS6、CS7。

表2 篩選結(jié)果及其降解率Table 2 Screening results and degradation rates

2.2 最佳NH3和H2S降解菌的篩選及鑒定

由圖1-A可知，最佳NH3降解菌株編號(hào)為CN5，24 h后CN5菌液中氨氮含量最低為103.5 mg/L，NH3去除率為83.1%。由圖1-B可知，最佳H2S降解菌株編號(hào)為CS2，24 h后CS2菌液中硫酸鹽生成含量最多為304.2 mg/L，H2S去除率為87.2%。如圖2-A所示CN5菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，顯微鏡下呈現(xiàn)璉球狀，菌落大，黃色不透明，邊緣清晰，較濕潤(rùn)容易挑取，單菌培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度較慢。如圖2-B所示CS2菌為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下呈現(xiàn)長(zhǎng)卵狀，菌落細(xì)小，白色通透，邊緣清晰，濕潤(rùn)容易挑取，單菌培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度快。對(duì)菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及16S rDNA基因鑒定后，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，根據(jù)BLAST結(jié)果，菌株CN5與Enterococcuss casseliflavus NCIMB 11449的相似性為99%，菌株CS2和Pseudomonas geniculata ATCC 19374的相似性為99.78%，說(shuō)明分離菌株CN5屬于腸球菌屬（Enterococcus sp.），菌株CS2屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）。

圖1 菌株對(duì)氨氮（A）和硫酸鹽（B）的轉(zhuǎn)化情況Fig.1 Transformation of ammonia nitrogen（A）and sulfate（B）by strains

圖3 菌株CN5和CS2的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of the CN5 and CS2 strains

2.3 NH3和H2S降解菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

由圖4可知，菌株CN5和CS2的OD600均在35℃溫度下達(dá)到最大值，說(shuō)明35℃條件下菌株生長(zhǎng)最旺盛。如圖5-A所示，接種量為10%時(shí)菌株對(duì)NH3和H2S的降解率最高，分別為83%和86.3%。菌株CN5更適合在堿性條件下生長(zhǎng)，在初始pH為7-8.5時(shí)，降解效果較好，降解率接近85%；菌株CS2更適合在酸性條件下生長(zhǎng)，在初始pH為6-7.5時(shí)，降解效果較好，降解率均在85%以上（圖5-B）。以原始培養(yǎng)基中碳源氮源為基底，初始碳氮比為25∶1時(shí)，兩株菌株對(duì)兩種氣體的降解效果均最佳，降解率可達(dá)84.7%和88.9%（圖5-C）。當(dāng)以蔗糖和氯化銨作為唯一碳源和氮源時(shí)，兩菌株均能達(dá)到最佳降解效果，NH3降解率均接近85%，H2S降解率均在85%以上（圖5-D，5-E）。綜上兩菌株培養(yǎng)的最優(yōu)條件：接種量為10%，培養(yǎng)溫度為35℃，初始pH為7，碳氮比25∶1，碳源為蔗糖，氮源為氯化銨。

圖4 菌株在不同溫度培養(yǎng)時(shí)的OD600值Fig.4 OD600 value of strains cultured at different temperatures

圖5 菌株CN5和菌株CS2在不同培養(yǎng)條件下降解率的變化Fig.5 Changes in degradation rates of strain CN5 and strain CS2 under different culture conditions

2.4 最佳混合比例的確定

在平板上將菌株交叉十字劃線，兩菌株交叉點(diǎn)生長(zhǎng)良好，說(shuō)明菌株彼此之間沒(méi)有拮抗作用，可以進(jìn)一步進(jìn)行最佳除臭組合的篩選。由圖6可知，菌株CN5和CS2以2∶3的比例接入時(shí)，OD600值最大，菌株生長(zhǎng)最旺盛。由圖7可知，菌株CN5和CS2以2:3的比例接入時(shí)，pH值在7左右保持穩(wěn)定。在上述單因素優(yōu)化條件得出的最佳培養(yǎng)條件下，混合菌劑對(duì)NH3的降解率達(dá)到86.3%，對(duì)H2S的降解率達(dá)到91.2%。相較于圖5中單個(gè)菌株對(duì)NH3和H2S的降解率分別為84.7%和88.9%，兩菌在混合狀態(tài)下產(chǎn)生的協(xié)同作用，能進(jìn)一步提高NH3和H2S的降解率。

圖6 兩菌株不同混合比例下OD600的變化Fig.6 Changes of OD600 under different mixing ratios of two strains

圖7 兩菌株不同混合比例下pH的變化Fig.7 Changes of pH under different mixing ratios of two strains

2.5 氨氮含量和硫酸鹽含量測(cè)定

通過(guò)氨氮含量和硫酸鹽含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)兩株菌的降解能力，由圖8可知，在0-24 h內(nèi)，氨氮濃度呈現(xiàn)指數(shù)下降趨勢(shì)，硫酸鹽濃度呈現(xiàn)指數(shù)上升趨勢(shì)，兩者變化幅度均較大。在24-72 h，氨氮和硫酸鹽離子濃達(dá)到飽和后基本保持不變。最終氨氮濃度穩(wěn)定在50.5 mg/L，氨氮降解率為85.3%，相較于圖1-A中未優(yōu)化條件下氨氮降解率83.1%，優(yōu)化條件下氨氮降解率提高了2.2%。硫酸鹽濃度穩(wěn)定在302.7 mg/L，硫酸鹽生成率為89.2%，相較于圖1-B中未優(yōu)化條件下硫酸鹽生成率87.2%，優(yōu)化條件下硫酸鹽生成率提高了2.0%。

圖8 兩株菌混合條件下氨氮和硫酸鹽離子濃度變化曲線Fig.8 Variation curve of ammonium nitrogen and sulfate ion concentration under mixed conditions of two strains

3 討論

微生物對(duì)臭氣的降解率與接種量、pH有密切關(guān)系，接種量過(guò)低降解效果不明顯，接種量過(guò)高導(dǎo)致菌種繁殖過(guò)于旺盛產(chǎn)生多余的代謝物質(zhì)，影響降解效率。本研究中接種量為10%時(shí)菌株生長(zhǎng)最旺盛，對(duì)NH3和H2S的降解率最高。pH值是影響微生物活性的重要因子之一，其值太小或太大都會(huì)影響菌劑除臭效果，一般適宜微生物生長(zhǎng)的pH值環(huán)境是中性左右，本研究中最適宜兩株菌生長(zhǎng)的pH為7，與現(xiàn)有研究一致。張紅玉等［25］研究表明碳氮比為25∶1時(shí)，是微生物生長(zhǎng)繁殖以及分解有機(jī)物的最佳條件，能夠保證能量和氮素來(lái)源都不會(huì)受到限制。本研究中最佳碳氮比為25∶1與現(xiàn)有參考文獻(xiàn)一致，碳氮比過(guò)高和過(guò)低都不利于細(xì)胞生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)和積累，過(guò)低導(dǎo)致菌體提早自溶；過(guò)高導(dǎo)致細(xì)菌代謝不平衡，最終不利于產(chǎn)物的積累［26］。蔣敏［27］在對(duì)廚余垃圾好氧堆肥高效菌劑的研發(fā)中發(fā)現(xiàn)葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖和淀粉均是容易被微生物利用的碳源，其中添加蔗糖作為碳源可在實(shí)驗(yàn)前期加快細(xì)胞增殖。本研究中蔗糖為提高NH3和H2S降解率的最佳碳源。同時(shí)，氮源也是影響菌劑除臭效果的重要因素，一定的氮源能夠促進(jìn)微生物菌劑對(duì)惡臭氣體的分解，加快反應(yīng)時(shí)間和效率。夏遠(yuǎn)艦等［28］對(duì)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌最佳氮源的研究中發(fā)現(xiàn)，由于氯化銨中含有可促進(jìn)菌劑代謝的氨氮離子，因此添加氯化銨作為唯一氮源時(shí)菌株作用效果最佳，本研究中最佳氮源也為氯化銨，對(duì)NH3和H2S降解率均可達(dá)到85%。

在菌株混合培養(yǎng)方面，Van Ransbeeck等［29］研究表明，臭氣成分復(fù)雜，每一種臭氣都需要特定的微生物來(lái)降解，單一菌株除臭效果低于多種微生物共同作用的效果，兩株菌接種于同一體系中互利共生，聯(lián)合作用，可在一定程度上提高生長(zhǎng)繁殖能力。史鉆紅等［30］研究表明廚余垃圾的pH一般為中性偏酸性，因此兩株菌混合，偏向于酸性條件的菌株CS2添加相對(duì)比例高時(shí)，除臭效果更明顯。腸球菌已有多個(gè)研究表明具有除臭作用［31-33］，對(duì)NH3降解效果可達(dá)70%以上，同時(shí)對(duì)CH4、甲醛、二惡英等惡臭氣體也有一定的降解作用。假單胞菌也有研究表明具有較好的除臭效果［34-36］，常常應(yīng)用于污水處理廠污泥臭氣降解，對(duì)H2S降解效果最佳，最高達(dá)到95.1%，同時(shí)對(duì)甲硫醇、甲硫醚、NH3等惡臭氣體也有一定的降解效果。本研究中兩菌混合對(duì)NH3和H2S的降解效果明顯優(yōu)于單菌的降解效果，產(chǎn)生協(xié)同作用促進(jìn)NH3和H2S的降解，最終對(duì)NH3的降解率達(dá)到86.3%，對(duì)H2S的降解率達(dá)到91.2%，明顯高于單個(gè)菌株對(duì)NH3和H2S的降解率。

有研究表明［37-38］，垃圾中含有大量的NH4+和S2-，是NH3和H2S的主要產(chǎn)生來(lái)源。處于旺盛生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種活性高，因此會(huì)大量消耗NH4+，生成硝酸鹽和亞硝酸鹽，同時(shí)大量分解S2-，產(chǎn)生硫酸鹽，SO42-離子濃度增加。待細(xì)菌逐漸達(dá)到衰亡期后，各離子濃度平穩(wěn)。目前篩選除臭菌株一般都是在48 h之后才能獲得最佳除臭效果，曾蘇等［39］研究的菌株生長(zhǎng)的變化在60 h后才趨于穩(wěn)定，最大值氨氮和硫酸鹽的離子濃度變化為80.05%和65.03%，在72 h后降解效果下降。張鉥孟等［40］研究的一株脫氮硫桿菌中，菌株在48 h后趨于穩(wěn)定，最大值氨氮和硫酸鹽的離子濃度變化為67.18%和63.85%，低于本研究中兩株菌株的混合效果。本研究篩選的兩株菌在40 h左右趨于穩(wěn)定，在72 h仍有明顯降解效果。相對(duì)其他研究，該混合菌株氨氮降解率和硫酸鹽離子轉(zhuǎn)化率更高，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，因此具有更佳除臭效果。

4 結(jié)論

從廚余垃圾中分離出能夠高效降解NH3和H2S的菌株各1株，鑒定菌株CN5屬于腸球菌屬（Enterococcuss sp.），為革蘭氏陽(yáng)性菌；CS2屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），為革蘭氏陰性菌。菌株最佳除臭條件為：接種量為10%，培養(yǎng)溫度為35℃，初始pH為7，碳氮比25∶1，碳源為蔗糖，氮源為氯化銨。在混合比例為2∶3時(shí)，對(duì)NH3和H2S的去除效果最佳，且pH值穩(wěn)定在中性偏酸性，NH3降解率為86.3%，H2S降解率為91.2%。在72 h內(nèi)，最終氨氮濃度穩(wěn)定在50.5 mg/L，氨氮降解率為85.3%；硫酸鹽濃度穩(wěn)定在302.7 mg/L，硫酸鹽生成率為89.2%。