核桃JrSnRK1α1.1調(diào)控種子油脂合成與積累

王貴芳 姚元濤 許海峰 相昆 梁家慧 張淑輝 王文茹張明娟，4 張美勇 陳新

（1.山東省果樹研究所 國家核桃板栗種質(zhì)資源圃 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮設(shè)施園藝工程重點實驗室，泰安 271000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，濟南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，泰安 271018；4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018）

核桃（Juglans regia L.）是世界四大干果之一［1］，具有很高的營養(yǎng)和保健價值。核桃種仁含油量高達(dá)63%以上，其中不飽和脂肪酸含量可達(dá)到90%，同時含有較多的生物活性成分，國內(nèi)外研究表明核桃油在預(yù)防糖尿?。?］、防治動脈粥樣硬化［3］和提高記憶力［4］等方面具有重要作用。另有研究表明，脂肪酸組成中的ω-3和ω-6不飽和脂肪酸比例約為1∶4-1∶6時對健康最有益，對預(yù)防心腦血管疾病有較好的作用［5］。與其他植物油相比，核桃種仁中ω-3和ω-6不飽和脂肪酸的組成較為理想，因此，核桃油脂是優(yōu)質(zhì)和健康的植物油脂［6］。

種子是植物的“庫”端，由葉片（“源”端）合成的蔗糖通過韌皮部運輸?shù)椒N子中，油料種子首先積累淀粉，在種子發(fā)育后期全部或部分分解，用于合成油脂和蛋白質(zhì)［7］。種子油脂是由脂肪酸和甘油合成的高級脂肪酸甘油酯, 以三酰甘油的形式儲存于種子中。核桃種仁油脂合成與積累是堅果品質(zhì)和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵，種仁油脂合成的原料物質(zhì)主要來源于光合作用產(chǎn)生的可溶性糖［8］，蔗糖非發(fā)酵-1-蛋白激酶（sucrose non-fermentation1-related kinase1,SnRK1）是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)碳氮代謝和能量平衡的重要樞紐［9-13］，在碳代謝分配中起著關(guān)鍵的作用［14］。目前，有關(guān)植物SnRK1蛋白激酶研究主要集中于碳氮代謝［15-18］、生長發(fā)育［19-22］及脅迫響應(yīng)［12,23-25］方面。對SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累之間的關(guān)系和調(diào)節(jié)機制探討較少，主要以酵母（Saccharomyces cerevisiae）［26-27］及模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）［28］為主，在油料作物及木本油料樹種中的相關(guān)研究鮮見報道。作者前期對桃（Prunus persica）SnRK1蛋白激酶進行功能研究發(fā)現(xiàn)，SnRK1能夠顯著提高植株的光合速率、可溶性糖含量、淀粉含量及其利用率，通過調(diào)節(jié)碳代謝進而調(diào)控植株的生長發(fā)育進程［29-30］。隨著人們對SnRK1蛋白激酶功能研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)擬南芥中SnRK1同源基因KIN10與油脂合成轉(zhuǎn)錄因子WRI1相互作用調(diào)控油脂的合成與積累［28］。由于SnRK1蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能屬于非常保守的基因家族［31］，因此推測果樹SnRK1蛋白激酶可能參與油脂的合成與積累過程。而重要的木本油料樹種核桃SnRK1蛋白激酶在種子油脂合成與積累方面的研究至今未見報道。

作者在前期研究的基礎(chǔ)上，為進一步探討果樹SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累中的作用，在本研究中以核桃種仁為試材，分離獲得核桃SnRK1蛋白激酶α催化亞基的一個編碼基因JrSnRK1α1.1（全長1 539 bp）。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染花序?qū)⑵滢D(zhuǎn)化擬南芥，獲得超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥，探討核桃JrSnRK1α1.1對種子油脂合成和積累的影響，以期為調(diào)控核桃種仁油脂含量及改善核桃品質(zhì)提供理論依據(jù)，同時為采用分子手段選育不同類型的核桃新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2017年4月-2020年10月在山東省干果育種工程技術(shù)研究中心和國家蘋果工程技術(shù)研究中心進行。

所用的植物材料為‘香玲’核桃果實種仁，采自山東省泰安市岱岳區(qū)國家核桃種質(zhì)資源圃，采樣時間為2017年4月-2018年8月，核桃種仁總RNA提取樣品于液氮中迅速冷凍，保存于-80℃冰箱；擬南芥（Arabidopsis thaliana）為‘哥倫比亞’（Columbia）野生型，為實驗室保存。所用植物表達(dá)載體為pBI121，購自TaKaRa公司；所用大腸桿菌菌株為Trans5α，農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，購自TIANGEN公司，用于轉(zhuǎn)化擬南芥。

所用的主要試驗試劑及儀器為瓊脂糖、石油醚、體式顯微鏡、索氏抽提器、干燥鍋、分析天平、恒溫水浴鍋、烘箱和粉碎機。

1.2 方法

1.2.1 核桃種仁JrSnRK1α1.1基因的克隆與載體構(gòu)建 以‘香玲’核桃種仁為試材提取總RNA，采用OMEGA植物組織總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈采用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time），參照說明書進行操作?；騄rSnRK1α1.1克隆依據(jù)GenBank登錄的核桃SnRK1蛋白激酶α亞基編碼基因（基因登錄號：LOC108985954）的CDS序列進行，采用Primer Premier 5設(shè)計引物，引物序列見表1。以上述cDNA為模板進行基因JrSnRK1α1.1全長PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火70 s，72℃延伸30 s，36個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，回收，將其與克隆表達(dá)載體pMD-19T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取3個對陽性菌落進行測序，與參考基因序列進行比對，序列正確者連接植物表達(dá)載體為pBI121，獲得重組質(zhì)粒pBI121- JrSnRK1α1.1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，再次進行測序、比對，測序正確的菌落提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，以備轉(zhuǎn)化擬南芥。

表1 目的基因JrSnRK1α1.1的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene JrSnRK1α1.1

1.2.2 不同發(fā)育時期核桃種仁JrSnRK1α1.1基因表達(dá)定量分析 依據(jù)核桃JrSnRK1α1.1測序結(jié)果，運用NCBI中Primer-BLAST設(shè)計核桃JrSnRK1α1.1熒光定量引物（表1），以18S作為內(nèi)參基因。熒光定量采用ChamQTMUniversal SYBR Qpcr Master Mix試劑盒（Vazyme公司），實驗參照說明書進行。待反應(yīng)結(jié)束，獲得擴增曲線，通過StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù)，利用Excel進行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)CT值用2-ΔΔCT相對定量法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.2.3 核桃JrSnRK1α1.1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及超表達(dá)株系的篩選 在溫度22℃，16 h光照/8 h黑暗的植物智能光照培養(yǎng)箱中，播種野生型擬南芥種子，待野生型擬南芥開花時將擬南芥主花序的頂端剪掉，以誘導(dǎo)更多側(cè)花序的生成，且側(cè)花序同時開花，便于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前澆透營養(yǎng)液，轉(zhuǎn)化后控制澆水。

在轉(zhuǎn)化前2 d，將含重組質(zhì)粒pBI121-JrSnRK1α1.1的農(nóng)桿菌加到10 mL的YEP培養(yǎng)基中（含有利福平和卡那霉素），28℃搖床振蕩培養(yǎng)，過夜，活化農(nóng)桿菌。取1 mL的菌液加到20 mL的YEP培養(yǎng)基中再次過夜培養(yǎng)，至菌液呈金黃色時收集菌體，5 000-6 000 r/min離心10 min，棄上清液。以含有3%蔗糖的侵染液懸浮菌體，懸浮菌液中加入0.05%的Silwet L-77表面活性劑，將擬南芥的花序浸到菌液中8-10 min，然后用濾紙吸干多余的菌液。侵染過的擬南芥黑暗培養(yǎng)1 d。第2天取出放到光下繼續(xù)生長。根據(jù)浸染過的植株的長勢，隔5-7 d再浸一次。浸染4-5次后的擬南芥植株正常生長，收種子。將收集到的T0代擬南芥種子進行陽性篩選獲得3個植株J-1、J-2和J-3。提取陽性植株和野生型擬南芥葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄作為模板，進行PCR擴增JrSnRK1α1.1，瓊脂糖凝膠電泳檢測；熒光定量檢測JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)水平。凝膠電泳檢測含目的基因條帶、并結(jié)合熒光定量檢測結(jié)果確定植株J-1、J-2和J-3為轉(zhuǎn)基因擬南芥。收集獲得T1代種子，對T1代種子進行陽性植株篩選獲得T2代植株，單株采收種子；繼續(xù)對單株采收的T2代種子進行陽性篩選，全部為陽性植株的種子即為純合型。采收種子，獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。

1.2.4 超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子表型觀察及粗脂肪含量檢測

1.2.4.1 種子表型觀察 以野生型擬南芥植株為對照，對超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1的T3代擬南芥株系進行生長表型觀察。收集擬南芥的種子，將轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥株系的種子在體式顯微鏡下進行觀察，對比兩者表型的差異。

1.2.4.2 種子千粒重統(tǒng)計 取適量同批次種植、收獲的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，利用METTLER TOLEDO AB204-N電子天平稱重，重復(fù)3次。

1.2.4.3 種子尺寸測量 取適量同批次種植、收獲的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，用體式顯微鏡觀察，利用Digimizer4.5.1軟件測量種子的長和寬，每個樣品測量約300粒種子，計算平均值，重復(fù)3次。

1.2.4.4 種子粗脂肪含量測定 測定采用索氏抽提的方法，測定方法參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中脂肪的測定》，略有改動，取樣2.5 g，3個重復(fù)。

1.2.5 核桃JrSnRK1α1.1與JrWRI1雙分子熒光互補試驗 作者前期以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板克隆獲得油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因全長［32］。為進一步探討核桃JrSnRK1α1.1是否與油脂合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1相互作用，構(gòu)建熒光雙分子表達(dá)載體JrSnRK1α1.1-YFPC和JrWRI1-YFPN。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將JrSnRK1-YFPC和JrWRI1-YFPN共同轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞，以JrSnRK1-YFPC與YFPN共轉(zhuǎn)化作為對照，運用雙分子激光共聚焦電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 核桃JrSnRK1α1.1基因的克隆

依據(jù)GenBank登錄的核桃SnRK1蛋白激酶α亞基編碼基因（登錄號：LOC108985954）的CDS序列設(shè)計引物。以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板進行基因JrSnRK1α1.1 PCR擴增，獲得基因CDS全長為1 539 bp。將得到的基因進行測序、比對，其基因序列與參考基因（登錄號：LOC108985954）完全一致。可見核桃SnRK1蛋白激酶屬于非常保守的基因家族，擴增獲得的JrSnRK1α1.1即為目的基因。

2.2 核桃JrSnRK1α1.1基因家族進化關(guān)系分析

運用NCBI在線工具BLAST對核桃、桃、蘋果、草莓、番茄、煙草、大豆、芝麻、擬南芥等SnRK1蛋白激酶α亞基同源基因的蛋白質(zhì)序列進行搜索，構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果（圖1）表明，核桃JrSnRK1α1.1與桃、蘋果、棗、草莓及中華薔薇的親緣關(guān)系較近，而與線蟲、酵母、水稻、黑麥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 不同植物中SnRK1蛋白激酶α亞基蛋白進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the proteins of α subunit in SnRK1 protein kinase from different plant species

2.3 核桃種仁發(fā)育過程中JrSnRK1α1.1基因表達(dá)水平的變化

本課題組前期研究表明，‘香玲’核桃自開花至60 d，果實快速膨大，種仁逐漸形成透明半流質(zhì)狀的內(nèi)含物；花后60 d至成熟期種仁內(nèi)含物逐漸增加，是油脂逐漸積累的階段。因此。自花后60 d進行核桃種仁取樣，每隔10 d取1次。測定核桃種仁JrSnRK1α1.1在花后60-130 d（成熟期）之間基因相對表達(dá)水平。結(jié)果（圖2）表明，核桃種仁中基因JrSnRK1α1.1自花后60-90 d相對表達(dá)量逐漸下降，這一時期果實大小基本定型，種仁逐漸呈白色、脆嫩，營養(yǎng)物質(zhì)迅速積累；JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)量在花后90-120 d逐漸上升，花后120-130 d又下降，這一階段核桃種仁不斷充實飽滿，種仁風(fēng)味由甜變香，核桃油脂含量快速增加。

圖2 ‘香玲’核桃種仁不同生長階段JrSnRK1α1.1基因表達(dá)水平Fig.2 Expressions of the JrSnRK1α1.1 gene in different growth stages of ‘Xiangling’ walnut kernel

2.4 核桃JrSnRK1α1.1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及超表達(dá)植株的篩選

將含有重組質(zhì)粒pBI121-JrSnRK1α1.1的農(nóng)桿菌侵染野生型擬南芥花序，獲得超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1的陽性植株J-1、J-2和J-3。轉(zhuǎn)基因植株J-1、J-2和J-3與野生型擬南芥WT植株生長差異不顯著（圖3）。以WT為對照，提取轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA，進行核桃JrSnRK1α1.1基因PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖4-A）顯示，3個植株均含有目的條帶。以18S作為內(nèi)參基因，對轉(zhuǎn)基因擬南芥JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)水平進行熒光定量分析，JrSnRK1α1.1在植株J-2中相對表達(dá)量較高，其次為J-3，在J-1中表達(dá)較弱（圖4-B）。

圖3 野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（J-1、J-2和J-3）幼苗表型Fig.3 Seedling phenotype of wild-type（WT）and transgenic Arabidopsis thaliana lines（J-1, J-2 and J-3）

2.5 超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子表型及粗脂肪含量

將超表達(dá)JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因植株J-1、J-2和J-3進行純化，獲得T3代純合型株系，在數(shù)碼顯微鏡下觀察種子表型（圖5）。與野生型WT相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系J-1、J-2和J-3種子表現(xiàn)為癟小、表皮皺縮，其中株系J-1、J-2和J-3癟小種子占比分別為43.69%、60.80%和45.87%，高于野生型WT（8.43%），差異顯著（圖6-A）；轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子千粒重比野生型降低27.95%-29.32%（圖6-B），種子平均粒長和粒寬均顯著變?。▓D6-C, D），種子的長寬比顯著增大（圖6-E）。可見核桃JrSnRK1α1.1影響了擬南芥種子的發(fā)育。進一步對種子粗脂肪含量進行測定，結(jié)果（圖6-F）表明，與野生型WT相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系J-1、J-2、J-3粗脂肪含量分別下降了9.66%、23.86%和17.61%，差異顯著；可見核桃JrSnRK1α1.1負(fù)調(diào)控種子油脂的合成和積累。

2.6 核桃JrSnRK1α1.1與核桃油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互作

作者前期以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板克隆獲得油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因全長，對其結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)特性進行了分析。為進一步探討核桃JrSnRK1α1.1是否與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1相互作用，構(gòu)建重組表達(dá)載體，共同轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞，進行雙分子熒光互補試驗（圖7）。在YFP光照下，對照J(rèn)rSnRK1α1.1-YFPC和YFPN共轉(zhuǎn)化的煙草表皮細(xì)胞沒有綠色熒光，而JrSnRK1α1.1-YFPC和JrWRI1-YFPN共轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有明亮的綠色熒光，表明核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1能夠相互作用。

圖7 核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1雙分子熒光互補Fig.7 Bimolecular fluorescence complementation of walnut JrSnRK1α1.1 with JrWRI1, a key transcription factor for lipid synthesis（Scale bar=10 μm）

3 討論

SnRK1蛋白激酶是植物碳代謝和生長發(fā)育中的重要調(diào)控樞紐。SnRK1蛋白激酶廣泛存在于高等植物中，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)光合碳代謝和能量平衡［12-13,18,33］。SnRK1蛋白激酶在轉(zhuǎn)錄水平上對蔗糖合酶和α-淀粉酶進行調(diào)節(jié)，調(diào)控碳水化合物代謝［11,34］。SnRK1蛋白激酶影響豌豆種子的發(fā)育，反義表達(dá)SnRK1的豌豆種子出現(xiàn)許多成熟缺陷，表現(xiàn)為糖轉(zhuǎn)變成儲存物的數(shù)量減少、球蛋白含量較低、多數(shù)種子的子葉外觀、形狀、勻稱性改變及早熟現(xiàn)象［35］。本研究中，超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子與野生型相比，種子出現(xiàn)癟小、表皮皺縮的現(xiàn)象，并且轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子千粒重明顯降低，種子的平均粒長和粒寬均顯著變小。因此，核桃JrSnRK1α1.1也影響了種子的發(fā)育進程。但JrSnRK1α1.1是否通過調(diào)節(jié)碳水化合物的代謝影響了種子的發(fā)育？以及對光合碳代謝的調(diào)控機制如何？這些問題亟需進一步探討。

SnRK1蛋白激酶參與調(diào)控油脂的合成與積累。油料種子以貯存油脂為主，光合作用產(chǎn)生的可溶性糖是油脂合成的物質(zhì)基礎(chǔ)［8］，隨著人們對SnRK1蛋白激酶研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)酵母Snf1不僅調(diào)節(jié)碳代謝，還調(diào)控油脂的合成與積累［26-27］。但目前對植物SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累方面的研究較少，僅在擬南芥中有所發(fā)現(xiàn)，擬南芥KIN10通過磷酸化油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子WRI1使其降解，從而降低種子油脂含量［28］；進一步研究表明具有活性的KIN10下調(diào)WRI1的表達(dá)，并通過促進細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8（CDK8）的降解來抑制油脂的合成［36］。本研究中，超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1擬南芥株系與野生型擬南芥WT相比，種子中油脂含量顯著下降，分別比WT下降9.66%、23.86%和17.61%，這與擬南芥中KIN10的功能相似［28］。

核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互作調(diào)控油脂的合成與積累。油脂是核桃種仁的主要成分，也是核桃品質(zhì)形成的關(guān)鍵因子。近年來，核桃果實油脂合成相關(guān)研究取得一些進展，張通［37］對山核桃果實種仁油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)了油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子WRI1，張楠［38］利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了核桃胚脂肪積累期脂肪代謝通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，為進一步研究相關(guān)基因的功能及調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。本課題組前期從‘香玲’核桃種仁中分離得到核桃JrWRI1基因［32］，為進一步研究核桃油脂的形成奠定了基礎(chǔ)。在本研究中，核桃JrSnRK1α1.1影響種子的發(fā)育，負(fù)調(diào)控種子油脂的合成與積累，且熒光雙分子試驗表明核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1能夠相互作用，這為改變核桃種仁油脂的含量提供了新的思路，也為利用分子手段加快核桃新品種的選育提供一定的參考，但其調(diào)控機制仍不清楚。木本油料樹種核桃JrSnRK1α1.1如何調(diào)控油脂的合成與積累過程，是否通過JrWRI1基因?qū)颂曳N仁油脂的合成及積累進行調(diào)控？以及是否存在其他調(diào)控途徑？其作用機制是否與擬南芥同源基因KIN10一致，還是其具有自己的特異性？目前仍不清楚，需進一步探討與研究。

4 結(jié)論

超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1對擬南芥植株生長發(fā)育影響不明顯，對種子的發(fā)育影響顯著，轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子表現(xiàn)為癟小、表皮皺縮，千粒重、種子粒長和粒寬均顯著變小。核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互相作用，負(fù)調(diào)控種子油脂的合成與積累。