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    馬鈴薯StCIPK11的克隆及響應干旱脅迫分析

    2023-10-25 05:05:34劉雯錦馬瑞劉升燕楊江偉張寧司懷軍
    生物技術通報 2023年9期
    關鍵詞:轉基因馬鈴薯載體

    劉雯錦 馬瑞 劉升燕 楊江偉,2 張寧,2 司懷軍,2

    (1.甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院,蘭州 730070;2.甘肅農業(yè)大學省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室,蘭州 730070;3.甘肅農業(yè)大學農學院,蘭州 730070)

    馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)為茄科茄屬一年生草本植物,是世界重要的糧食、蔬菜兼經濟作物,在糧食安全和社會經濟發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用[1]。干旱是一種常見的不利環(huán)境因素,對農業(yè)生產發(fā)展有著極大的影響。馬鈴薯對水分十分敏感,干旱條件下,馬鈴薯根、莖、葉的生長發(fā)育都會受到影響,其結薯能力以及塊莖對營養(yǎng)元素的吸收也會受到抑制,從而降低塊莖的品質[2-3],因此,干旱成為嚴重制約馬鈴薯生長生產的重要因素之一[3-6]。

    鈣離子是一種重要而保守的第二信使,廣泛存在于真核生物體內,在植物逆境信號轉導過程中起著至關重要的作用[7]。當植物在受到不利環(huán)境刺激時,細胞質中Ca2+的濃度就會發(fā)生一系列復雜的變化,即產生Ca2+振蕩。Ca2+感受器接受到振蕩信號并繼續(xù)向下游傳遞,從而引起植物一系列的生理生化反應[8]。目前,已知高等植物中的Ca2+感受器有鈣調蛋白(calmodulin, CaM)、鈣調磷酸酶B類蛋白(calcineurin B-like protein, CBLs)、鈣調蛋白類似蛋白(calmodulin-like protein, CMLs)和鈣依賴蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases, CDPKs),這四大類感受器的蛋白質結構中均含有EF手型(EF-hand)結構,該結構在與Ca2+結合時會發(fā)生改變[9]。CBL是植物體內多種鈣離子感受器中較為特殊的一類小分子鈣結合蛋白,其自身沒有活性,需與下游的CBL結合蛋白激酶(CBL interacting protein kinase,CIPK)特異性互作,激活下游靶標,解碼Ca2+信號[10-11]。CIPKs是植物中特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族[12],前人研究發(fā)現(xiàn)CIPK參與調節(jié)植物各種生理反應從而調節(jié)植物應激耐受性[13-15]。植物在遭受干旱脅迫時,細胞內會產生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS),造成嚴重的氧化損傷,破壞膜系統(tǒng)的完整性[16],膜脂過氧化產物丙二醛(malondialdehyde, MDA)的含量可以反映出植物所受傷害的程度[17]。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化物酶(peroxidase, POD)可有效分解植物體內的自由基,對植物起到一定的保護作用。在缺水環(huán)境下,植物會通過改變體內的滲透調節(jié)物質水平來維持正常生理功能,而脯氨酸(proline, Pro)是植物響應滲透脅迫抗性的重要指標,逆境中脯氨酸的累積可降低細胞的滲透勢,保護質膜免受缺水的有害影響[18-19]。

    再者,食品行業(yè)有時需要運輸海鮮、魚、肉等需要保鮮的東西,冬天還好,但是在夏天,天氣炎熱使很多物資都浪費在了路上,損失的也不是小數(shù)目。這些問題一直到現(xiàn)在都是無法徹底解決的,公司的管理層對此也是非常地頭大,雖然物資運輸慢是可以克服的,但是想要運輸成批量的保鮮食品的難度還是非常大的。

    近年來,有關CIPK響應非生物脅迫過程的機制已在擬南芥、水稻、玉米、小麥等多種植物中進行了大量研究,如AtCIPK6介導內質網(wǎng)定位的鈣結合肽來調節(jié)對干旱的抗性[20];過表達OsCIPK15可提高水稻對低溫、干旱和鹽脅迫耐受能力[21];小麥過表達TaCIPK24可提高植株耐鹽性[22];干旱脅迫后ZmCIPK8在玉米葉片和根部的表達發(fā)生了顯著變化[23];SlCIPK8在番茄響應干旱、低溫和鹽脅迫過程中都起到一定作用[24];CaCIPK13在辣椒耐冷性機制中發(fā)揮積極作用[25]。

    Ma等[26]完成了馬鈴薯CIPK家族基因系統(tǒng)鑒定發(fā)現(xiàn),馬鈴薯植株在干旱脅迫后StCIPK11的表達量發(fā)生了顯著變化,但關于馬鈴薯StCIPK11在干旱脅迫方面的研究還較為罕見。

    1.2.5 馬鈴薯遺傳轉化及轉基因植株鑒定 將構建好的p1300-StCIPK11和pBI121-amiR-StCIPK11重組質粒導入根癌農桿菌GV3101菌株中。參見Qi等[17]方法進行試管薯的誘導,參考Huai[27]方法進行馬鈴薯的遺傳轉化。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    所用供試馬鈴薯品種‘大西洋’試管苗由甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院分子生物學實驗室保存并提供;pMD18-T克隆載體購于TaKaRa公司;大腸桿菌感受態(tài)DH5α購于北京全式金生物技術有限公司;農桿菌GV3101、載體pCAMBIA1300、pRS300和pBI121均由甘肅農業(yè)大學生命科學技術學院分子生物學實驗室保存并提供。

    1.2 方法

    1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 根據(jù)TIANGEN總RNA提取試劑盒(天根,北京)提取‘大西洋’葉片總RNA。根據(jù)TIANGEN Fast Quant RT試劑盒(天根,北京)合成第一鏈cDNA。

    1.2.4.2 馬鈴薯StCIPK11干擾表達載體構建 利用WMD3網(wǎng)站(http://wmd3.weigelworld.org/)獲取StCIPK11的amiRNA干擾序列(5′-TTCTATTTCCGCGCTAGCCTC-3′)和PCR擴增引物序列(表1),將引物序列提交至金唯智生物科技(蘇州)有限公司進行合成。以pRS300質粒為模板,進行amiRStCIPK11前體片段a(引物A和IV)、b(引物III和II)、c(引物I和B)的擴增;再以a、b、c小片段混合物為模板擴增d(引物A和B)片段,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收。將回收的d片段與pMD18-T克隆載體連接成功后轉入大腸桿菌DH5α,經PCR檢測后,對陽性克隆進行測序檢驗,以測序正確的pMD18-amiR-StCIPK11為基礎,采用酶切連接法將干擾片段amiR-StCIPK11插入pBI121質粒中,命名為pBI121-amiR-StCIPK11。

    1.2.4.1 馬鈴薯StCIPK11過表達載體構建 根據(jù)StCIPK11序列,通過(https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning)網(wǎng)站設計上下游引物并在5′端分別添加Kpn I和BamH I酶切位點(表1)。引物由金唯智生物科技(蘇州)有限公司合成。

    2.全面清理不利于民營企業(yè)發(fā)展的法律法規(guī)和規(guī)范性文件。統(tǒng)籌協(xié)調正在開展的相關法律法規(guī)清理工作,在2018年年底前集中清理現(xiàn)行法律法規(guī)和規(guī)范性文件中有悖于平等保護原則、不利于民營經濟發(fā)展的相關內容,及時予以廢止或者調整完善,打破各種各樣的“卷簾門”“玻璃門”“旋轉門”。進一步加強法規(guī)規(guī)章備案審查,及時糾正有悖于保護民營經濟的法規(guī)規(guī)章規(guī)定,積極為民營企業(yè)發(fā)展提供平等法治保障。

    1.2.4 載體構建

    泄漏7 200 d后,上覆第四系松散孔隙含水層氟化物污染羽狀物繼續(xù)向南側擴散遷移,濃度也在持續(xù)增大,但遷移距離為75 m,擴散面積12 800 m2;此時下伏巖溶含水層出現(xiàn)低濃度氟化物迅速向南側遷移,最遠遷移距離約300 m,擴散面積36 600 m2。

    1.2.3 StCIPK11的生物信息學分析 從馬鈴薯PGSC數(shù)據(jù)庫(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml)中獲取StCIPK11序列(Soltu.DM.06G002800.1),利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找StCIPK11開放閱讀框;通過ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)預測該蛋白一級結構,運用Ex-PASy-ProtScale(https://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析其基本理化性質;利用SOPMA(https://blog.csdn.net/wangli-ang_f/article/details/22859187)預測二級結構;通過SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive/NJSqC4/models/)預測三級結構;利用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白的跨膜結構域、WOLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位預測;利用MEGAX軟件對鑒定的蛋白質序列進行多重序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(采取鄰近法、使用Poisson模式,重復次數(shù)為1 000,其他參數(shù)默認)。

    (1) 本文通過興趣點、土地開發(fā)情況、逗留人數(shù)、車站交通銜接條件等數(shù)據(jù)的挖掘,利用雷達圖分析法找到評價各車站的相對分值,該評價值與車站的出站客流量相關性較高,可以近似反應各站客流量的變化趨勢。因此,該方法可以在城市軌道交通客流評價中進行應用。

    表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in the study

    利用同源重組法將1.2.2中的回收產物連接至pCAMBIA1300質粒,重組質粒命名為p1300-StCIPK11。

    1.2.2 StCIPK11基因克隆 以1.2.1合成的cDNA為模板進行StCIPK11的擴增,擴增條件為94℃ 3 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 2 min,30個循環(huán);72℃ 10 min,4℃保存。按照天根生化科技(北京)有限公司DNA膠回收試劑盒說明書,回收經電泳檢測后的StCIPK11片段。

    本研究克隆StCIPK11并進行生物信息學分析,構建其過表達載體和干擾表達載體,對轉化馬鈴薯薯塊獲得的轉基因植株進行PEG脅迫,測定轉基因植株中StCIPK11的表達水平和生理生化指標,解析StCIPK11在響應干旱脅迫中發(fā)揮的作用,以期為深入研究StCIPK11響應馬鈴薯抗旱調控的分子機制提供理論依據(jù)。

    通過查找比對馬鈴薯StCIPK11蛋白與其他11個物種同源性蛋白序列發(fā)現(xiàn),HRDLKPENLL這段序列在12個比對的物種間高度保守(圖2)。構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析StCIPK11蛋白在不同物種間的進化關系,結果(圖3)表明,馬鈴薯與智利番茄的親緣關系最近。

    1.2.6 轉基因植株StCIPK11的表達分析 采用實時熒光定量PCR的方法分析StCIPK11在不同轉基因植株中的相對表達情況。以非轉基因植株和轉基因植株RNA反轉錄合成的cDNA作為模板,延伸因子lα(elongation factor 1α, Ef1α)基因為內參,設計特異性引物(表1),使用TIANGEN Super Real PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應體系為Super Real PreMix Plus(2×)10 μL、上、下游引物各0.6 μL、模板1 μL,用ddH2O補至20 μL。反應條件為95℃ 15 min;95℃ 10 s,60℃ 30 s,72℃ 40 s,45個循環(huán)。3次技術重復,根據(jù)相對表達量計算公式2-ΔΔCt法計算StCIPK11的相對表達量。

    1.2.8 統(tǒng)計分析方法 利用Office 2020對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與整理,使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析,試驗數(shù)據(jù)為3個生物學重復的平均值,用LSD法進行顯著性分析,星號表示顯著性差異(*:P<0.05,顯著差異;**:P<0.01,極顯著差異)。

    1.2.7 PEG6000脅迫下轉基因植株StCIPK11的生理生化指標測定 將轉基因植株接種于含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基(25℃ 16 h光照/8 h黑暗20 d),倒出液體培養(yǎng)物,并含20% PEG6000新MS液體培養(yǎng)基取代[28-29]。處理1 d后取樣,液氮速凍后-80℃保存,每個樣品采集自獨立的植株,進行3次生物學重復。參照《植物生理學實驗》操作方法[30],測定葉片中SOD活性、POD活性、MDA含量和Pro含量。

    面對全新的發(fā)展環(huán)境,各醫(yī)院必須緊緊圍繞在戰(zhàn)略部署的周圍,深化理解現(xiàn)代醫(yī)院管理制度的現(xiàn)實需要,實現(xiàn)對財務管理各崗位職能與責任義務的優(yōu)化配置,進而為構建嶄新財務管理組織奠定基礎,適應公立醫(yī)院綜合改革的現(xiàn)實需要。在實現(xiàn)崗位優(yōu)化配置的實踐中,應該將重點放在財務管理職能逐步強化這一視角之上,整合《會計法》、《行政事業(yè)單位內部控制規(guī)范》、《醫(yī)院財務制度》等相關法律法規(guī)與政策部署中的要求與路線指引,公立醫(yī)院應該將進一步提高內部治理能力為基本著眼點與發(fā)力點,盡快構建起將總會計師作為核心的領導管理機制,使得財務部門可以盡快實現(xiàn)集中化、統(tǒng)一化管理,實現(xiàn)財務核算職能與管理職能的相互分離。

    2 結果

    2.1 StCIPK11基因克隆

    以馬鈴薯品種‘大西洋’的cDNA為模板進行PCR 擴增(圖1-A),瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明,在1 000-2 000 bp之間有明顯條帶,大小約為1 341 bp,與預期大小一致。

    圖1 StCIPK11的擴增產物條帶及 amiR-StCIPK11前體片段擴增Fig.1 StCIPK11 amplified product bands and amiRStCIPK11 precursor fragments amplification

    2.2 StCIPK11生物信息學分析

    根據(jù)馬鈴薯StCIPK11序列(Soltu.DM.06G0028 00.1),該基因位于第6染色體,全長1 747 bp,包含一個1 341 bp開放閱讀框,含有2個外顯子。StCIPK11共編碼456個氨基酸,總原子數(shù)7 238個、化學分子式C2281H3663N611O659S24、相對分子量50 960.31 Da、等電點8.47、不穩(wěn)定指數(shù)38.01。通過在線軟件預測,結果表明,StCIPK11蛋白質結構以無規(guī)則卷曲(40.36%)為主,α-螺旋(31.61%)次之,最后為延伸鏈(19.0%)和β轉角(8.97%);StCIPK11蛋白可能定位于細胞質中,是不具有跨膜結構域的親水性蛋白。

    通過CTAB法提取轉基因植株和非轉基因植株的DNA為模板,利用表達載體pCAMBIA1300上特有的HYG抗性標記序列和pBI121上特有的新霉素磷酸轉移酶NPT II,設計特異性引物(表1),以非轉基因植株DNA和質粒p1300-StCIPK11、pBI121-amiR-StCIPK11作為對照,分別擴增HYG和NPT II,篩選轉基因植株用于后續(xù)測定。

    Step3:將屬于同一類別的所有用戶評分和情境信息平均值作為該類中心;返回Step2,直到聚類中心不再發(fā)生變化。

    2.3 StCIPK11過表達載體與干擾表達載體構建

    利用同源重組法獲得重組質粒p1300-StCIPK11,經Kpn I和BamH I酶切驗證,結果(圖4-A)顯示,片段在1 000和1 500 bp中間有明顯條帶,大小約為1 341 bp,符合目的基因預期效果,結合測序結果,進一步說明馬鈴薯過表達載體p1300-StCIPK11構建成功。

    圖4 重組質粒雙酶切驗證Fig.4 Double-digestion verification of recombinant plasmid

    以pRS300為模板,擴增獲得a(272 bp)、b(171 bp)、c(298 bp)片段(圖1-B),以a、b、c的膠回收產物以等量混合后擴增d片段,片段大小與預期相符(圖1-C)。利用雙酶切法獲得干擾表達載體pBI121-amiR-StCIPK11,經Kpn I和Xba I雙酶切驗證,插入的目的片段大小為512 bp(圖4-B),與預期片段的大小相符,結合測序結果進一步表明干擾表達載體pBI121-amiR- StCIPK11構建成功。

    2.4 馬鈴薯轉化植株的檢測

    對農桿菌介導法獲得的轉化植株用HYG和NPT II進行PCR擴增檢測,結果表明,目的基因已整合到馬鈴薯基因組中。RT-qPCR結果表明,StCIPK11在過表達株系中的相對表達水平顯著高于非轉基因植株,OE-1和OE-2的表達水平分別是NT植株的11.59和21.76倍;StCIPK11在干擾表達株系中的表達水平顯著低于NT,Ri-1和Ri-2的表達水平分別是NT植株的0.21和0.22倍,抑制效率達到78%以上(圖5)。

    圖5 轉基因植株的RT-qPCR檢測Fig.5 RT-qPCR detection of the transgenic plants

    2.5 PEG6000脅迫下轉基因植株的生理指標測定

    模擬干旱條件下,過表達植株中MDA含量是NT植株的1.24-1.32倍以上,而Pro含量是NT植株的0.91倍,SOD和POD活性也較低,僅為NT植株的82%-84%;干擾表達植株中MDA含量是NT植株的0.84-0.86倍,Pro含量是NT植株的1.18-1.32倍,SOD、POD活性顯著高于NT植株和過表達植株,是NT植株的1.25-1.40倍(圖6)。

    圖6 PEG6000處理下轉基因植株和NT植株生理指標分析Fig.6 Analysis of physiological indices of transgenic and NT potato plants under PEG6000 treatment

    3 討論

    干旱是威脅農業(yè)生產力和生態(tài)平衡的主要環(huán)境因素之一[31]。當植物遭受干旱脅迫時,細胞中的鈣離子濃度會迅速累積[17]。CBL-CIPK作為Ca2+信號通路中的重要感受器之一,在維持植物正常生長和調節(jié)環(huán)境脅迫反應中發(fā)揮重要作用。基于前人對馬鈴薯CIPK基因家族的研究,本試驗發(fā)現(xiàn),PEG模擬干旱脅迫條件下,干擾表達StCIPK11可以提高馬鈴薯抗氧化酶(SOD、POD)活性和脯氨酸含量,減少MDA含量,減輕細胞受損程度,從而降低馬鈴薯幼苗對水分的敏感性。

    本研究對StCIPK11進行了生物信息學分析。結果顯示,StCIPK11編碼的蛋白質與擬南芥[28]、紫花苜蓿[32]和小麥[33]等CIPK蛋白質二級結構基本一致,均以無規(guī)則卷曲和α-螺旋結構為主;研究發(fā)現(xiàn)AtCIPK11蛋白在擬南芥中雙定位于細胞質和細胞核中[31],而本研究亞細胞定位預測結果顯示StCIPK11蛋白定位于細胞質上,后期需進行相關試驗再次鑒定。

    在其他調味品應用上,Nisin主要是與其他防腐劑進行復配使用,而非單一添加應用,因此后續(xù)在開發(fā)Nisin防腐效果上,應采用復配型防腐劑。

    為進一步研究StCIPK11響應非生物脅迫的分子和生理機制,通過構建過表達載體和干擾表達載體,利用農桿菌介導法獲得StCIPK11轉基因植株。本研究中,在20% PEG條件下,NT植株和轉基因植株體內MDA、Pro含量和SOD、POD活性較脅迫前均有升高,過表達植株中MDA含量高于NT植株,而Pro含量和SOD、POD活性均顯著低于NT植株,說明干旱條件下,StCIPK11過表達植株更易受到損傷,且清除活性氧的能力較弱;干擾表達植株中MDA含量略低于NT植株,而Pro含量和SOD、POD活性則是NT植株的1.18-1.40倍,說明干擾表達植株對干旱脅迫具有更高的抵抗力。前人發(fā)現(xiàn),AtCIPK11不僅響應干旱、高pH脅迫,還參與鐵離子和脫落酸(abscisic acid, ABA)調節(jié)[24,34-35];ZmCIPK27在玉米遭受干旱脅迫后表達水平顯著上升[36];馬鈴薯中,StCIPK11在響應干旱、PEG、NaCl及部分激素脅迫后其表達水平存在顯著差異[26,37];擬南芥過表達AtCIPK11植株在干旱脅迫下,MDA含量最高,脯氨酸含量顯著低于NT植株[35],與本研究結果一致。StCIPK11可能是通過調節(jié)植物體內抗氧化酶活性,清除體內自由基含量,增加有機物質積累從而響應干旱脅迫,其作用機理及分子機制有待于進一步研究。本研究結果初步表明了StCIPK11負調控馬鈴薯的抗旱性。

    綜上所述,護理臨床帶教中實施分層次教學目標管理,應用價值較高,可有效提供帶教效果,為實習生日后工作奠定良好基礎,利于醫(yī)療事業(yè)良性發(fā)展。

    4 結論

    從馬鈴薯中克隆獲得StCIPK11,全長1 747 bp,包含一個1 341 bp開放閱讀框,編碼456個氨基酸。StCIPK11對干旱脅迫有響應,在馬鈴薯中干擾其表達,會使馬鈴薯植株抗旱能力升高。

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