水稻幼苗酵母單雜文庫構(gòu)建及LAZY1上游調(diào)控因子篩選

黃小龍 孫貴連 馬丹丹 閆慧清

（1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省植物生理與發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；3.西南喀斯特山地生物多樣性保護(hù)國家林業(yè)和草業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025）

在悠久的人工選擇馴化過程中，水稻（Oryza Sativa L.）的株型生長習(xí)性由野生稻的散生生長到如今栽培稻的直立生長，分蘗角的改變大大提高了產(chǎn)量，使水稻成為了一種重要的糧食作物［1］。LAZY1是最早發(fā)現(xiàn)的控制水稻分蘗角的基因［2］。水稻lazy突變體已廣泛研究了數(shù)十年，現(xiàn)更名為lazy1［3-5］。當(dāng)水稻地上部分完全喪失向重性響應(yīng)后，植株表型為散生或匍匐生長，人們形象地將控制這種表型的基因命名為“LAZY”。水稻lazy1突變體的地上部向重性喪失，植株表現(xiàn)為散生生長，分蘗角大于50°，細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示其胚芽鞘和葉鞘中有正常淀粉體，但生長素的不對稱分布受損，進(jìn)一步研究表明LAZY1通過調(diào)控地上部分莖中生長素橫向的極性運(yùn)輸，從而抑制植物的向重性響應(yīng)［6］。LAZY1在不同的植物中功能保守，在大麥（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、短柄草（Brachypodium distachyon）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中均鑒定到了LAZY1的同源基因［7-12］。

水稻LAZY1在胚芽、未伸長莖維管束的外周細(xì)胞、葉鞘枕部及莖鞘維管束內(nèi)側(cè)細(xì)胞中特異表達(dá)［8］。這種表達(dá)方式受LAZY1啟動子上的特定順式元件和相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控［13］。在玉米ZmLAZY1啟動子中共鑒定得到4個(gè)生長素響應(yīng)元件和14個(gè)光響應(yīng)元件，生長素和黑暗處理均可誘導(dǎo)玉米ZmLAZY1的表達(dá)［12］。水稻LAZY1在黑暗處理下的表達(dá)也明顯高于光照處理下的表達(dá)［2］。目前對于調(diào)控LAZY1基因的上游轉(zhuǎn)錄因子知之甚少，前期研究僅發(fā)現(xiàn)水稻中轉(zhuǎn)錄因子熱激蛋白OsHSFA2D是LAZY1的上游調(diào)控因子［13］，因此對于LAZY1的表達(dá)調(diào)控仍然是個(gè)謎。

本研究通過構(gòu)建水稻萌發(fā)3 d的酵母單雜交文庫，以LAZY1啟動子為誘餌對該酵母單雜交文庫進(jìn)行篩選，結(jié)合雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到了結(jié)合LAZY1啟動子并正調(diào)控LAZY1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子OsMBF1，為進(jìn)一步揭示LAZY1的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了理論基礎(chǔ)，有助于揭示水稻由散生變?yōu)橹绷⑸L的奧秘。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 酵母菌株AH109和Y187保存于本實(shí)驗(yàn)室。將酵母菌株劃線接種于YPDA固體培養(yǎng)基，30℃，250 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)4-7 d后待用。水稻種子置于MS培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)。

1.1.2 試劑 Library Construction Screening試劑盒（Clontech, Cat.No.630490）, TRIzol Reagent（Invitrogen,Cat.No.15596-018）, Dual-Luciferase?Reporter Assay System試劑盒（Promega, Cat.No.E1910），SMART試劑盒（Clontech, Cat.No.634925），NucleoSpin RNA試劑盒（MNG, Cat.No.740955.50），Mate &PlateTM試劑盒（Clontech, Cat.No.630490），酵母質(zhì)粒DNA提取試劑盒（TIGEN, Cat.No.DP112）。載體pMD19-T、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T4連接酶、EcoR I和Mlu I等酶均購自TaKaRa公司。引物合成及測序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻LAZY1基因啟動子的克隆及序列分析 通過RAPDB（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/dump）數(shù)據(jù)庫獲得LAZY1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 000 bp序列。以日本晴（Oryza sativa L.ssp japonica cv Nipponbare）的DNA為模板，以LAZY1-F和LAZY1-R引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳、切膠回收后連接至pMD19-T載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 mg/L氨芐的固體LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，選取PCR驗(yàn)證為陽性的單克隆菌株送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線數(shù)據(jù)庫對LAZY1啟動子上的順式作用元件進(jìn)行分析。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 誘餌載體pHIS2-LAZY1的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 將LAZY1啟動子片段和pHIS2載體分別用EcoR I和Mlu I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后回收，純化然后用T4連接酶連接。按上述T載克隆方法獲得陽性重組克隆，將重組質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)公司測序，獲得pHIS2-LAZY1誘餌載體。以LiAc熱激轉(zhuǎn)化法將誘餌載體pHIS2-LAZY1轉(zhuǎn)化進(jìn)入AH109酵母菌株［14］，轉(zhuǎn)化后的酵母菌株涂布于SD/-Trp培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3 d，通過菌落PCR篩選得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株。

1.2.3 誘餌載體的自激活檢測 分別將pHIS2-LAZY1誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109，pGADT7空載體入酵母菌株Y187，按照Mate&PlateTM試劑盒，30℃，30-40 r/min接合約20 h后收集菌體，涂布于氨基酸營養(yǎng)缺陷型SD/-His/-Leu/-Trp/（SD-LTH）的固體培養(yǎng)基上。如果在上述缺陷型SD-LTH平板的固體培養(yǎng)基上生長，在篩庫時(shí)需加入組氨酸抑制劑3-氨基-1,2,4-三唑（3-Amino-l, 2, 4-triazole, 3-AT）以抑制組氨酸His泄露。因此，分別在培養(yǎng)基中加入0、20和40 mmol/L的3-AT觀察接合菌的生長，以確定最適合的3-AT濃度。同時(shí)分別以pHIS2-p53+AD53、pHIS2+AD53和pHIS2+AD作為陽性對照、陰性對照和空白對照。

1.2.4 cDNA文庫的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化 利用Trizol抽提日本晴萌發(fā)3 d幼苗的總RNA，經(jīng)NucleoSpin RNA試劑盒分離獲得mRNA，接著使用SMART試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成First-Strand cDNA后，經(jīng)LD-PCR得到雙鏈cDNA，使用CHROMA SPINTMTE-400 Column純化后得到雙鏈cDNA文庫，接著同樣利用LiAc熱激轉(zhuǎn)化法將5 μg的cDNA文庫和3 μg的pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化入酵母菌株Y187，將上述懸浮酵母細(xì)胞液（預(yù)留50 μL用于檢測酵母庫容和重組率）涂布SD-Leu平板培養(yǎng)3-5 d后, 4℃放置3-4 h，以文庫保存培養(yǎng)基收集酵母菌落，重懸離心，加入200 mL文庫保存培養(yǎng)基重懸，1.5 mL離心管分裝，每管1 mL，得到酵母單雜文庫菌，-70℃保存。同時(shí)共轉(zhuǎn)化pGADT7-Rec和SV40大T PCR片段作為陽性對照，單獨(dú)轉(zhuǎn)化pGADT7-Rec空載體作為陰性對照，將上述預(yù)留的50 μL酵母懸浮液分別稀釋到1∶10和1∶100，取100 μL后分別涂到SD-Leu培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)3-5 d后，選取適合稀釋濃度的平板，計(jì)算文庫篩選克隆數(shù)，文庫篩選克隆數(shù)=培養(yǎng)基（CFU/mL）×稀釋倍數(shù)×重懸體積。

1.2.5 酵母單雜交文庫篩選 挑取含有pHIS2-LAZY1誘餌菌株單克隆至50 mL YPDA液體培養(yǎng)基，30℃，250 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至OD值至0.8，700×g離心5 min后收集菌體，將50 mL pHIS2-LAZY1誘餌菌和1 mL的酵母單雜文庫菌混合后加入到100 mL 2×YPDA培養(yǎng)基中，30-50 r/min，30℃，接合約20 h，完成酵母單雜篩庫。取100 mL接合菌液分至2個(gè)50 mL離心管中，1 000 ×g室溫離心10 min，棄上清液。然后再加入2×YPDA洗酵母細(xì)胞，1 000×g室溫離心10 min，棄上清液。用滅菌水清洗酵母細(xì)胞后，兩管合并，1 000 ×g室溫離心10 min，棄上清液。加入約15 mL滅菌超純水重懸酵母細(xì)胞，取100 μL涂布于SD-LTH/40 mmol/L 3-AT培養(yǎng)基平板，30℃倒置培養(yǎng)4-6 d。

1.2.6 陽性克隆的檢測和質(zhì)粒提取 挑取上述SDLTH/40 mmol/L 3-AT培養(yǎng)基上的接合菌的單克隆，以T7和AD引物（表1）進(jìn)行菌液PCR，電泳檢測得到的陽性接合菌株，以酵母質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司測序。測序結(jié)果在水稻的全基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast比對，篩選得到LAZY1候選上游因子的基因ID和CDS全長序列。

1.2.7 酵母單雜驗(yàn)證 將LAZY1基因的啟動子序列經(jīng)Sac I和Sma I酶切后，與經(jīng)相同酶切的pAbAi載體連接，構(gòu)建pBait-AbAi誘餌載體。經(jīng)BstB I酶切后線性化，轉(zhuǎn)化Y1HGold后，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在SD/-Ura的缺陷培養(yǎng)基上生長。轉(zhuǎn)化成功的酵母克隆即為誘餌酵母，這些克隆中包含穩(wěn)定的pBait-AbAi，可用來篩選蛋白與基因之間的互作。從SD/-Ura培養(yǎng)皿上挑取誘餌酵母菌株，用100 μL 0.9%的NaCl懸浮菌體，調(diào)OD600至0.002，取100 μL懸浮菌液分別涂在對照［不含金擔(dān)子素 A（aureobasidin A, AbA）］和含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d。將含有LAZY1啟動子的pAbAi誘餌載體菌株制備成誘餌酵母感受態(tài)，再將經(jīng)BamH I和Sac I雙酶切構(gòu)建后的pGADT7-OsMBF1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到誘餌酵母感受態(tài)中涂布于SD/-Ura/AbA平板上，30℃恒溫培養(yǎng)3-5 d。

1.2.8 雙熒光素酶檢測 PCR擴(kuò)增得到OsMBF1的CDS序列，通過重組方法將CDS連到‘None’載體得到none-OsMBF1效應(yīng)載體。同時(shí)，將1 000 bp的LAZY1啟動子克隆到190LUC載體，得到190LUCLAZY1報(bào)告載體，引物見表1。然后，通過PEG轉(zhuǎn)化將none-OsMBF1效應(yīng)載體和190LUC-LAZY1報(bào)告載體共轉(zhuǎn)化到水稻原生質(zhì)體中［15］，以空載體none和190LUC-LAZY1作為陰性對照。最后，使用Dualluciferase Reporter Assay System試劑盒和Infinite200 Pro microplate reader（Tecan）儀器檢測fLUC/rLUC比值，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)測量3次。數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)處理軟件SPSS（version 20.0）處理，采用單因素方差進(jìn)行差異顯著性分析，P-value ＜ 0.05*表示差異顯著，P-value ＜ 0.01 **表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LAZY1啟動子的克隆及順式元件分析

以日本晴葉片基因組DNA為模板，克隆得到LAZY1啟動子的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示產(chǎn)物大小與目標(biāo)長度1 000 bp一致（圖1-A）。測序所擴(kuò)增LAZY1啟動子片段的結(jié)果如圖1-B所示，與水稻預(yù)期的LAZY1啟動子序列一致，表明LAZY1啟動子序列克隆成功。

為了分析LAZY1啟動子所含有的順式元件，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫對LAZY1啟動子進(jìn)行順式元件的分析，結(jié)果顯示LAZY1啟動子除了含有CAAT-box和TATA-box等基本啟動子元件外，還含有光響應(yīng)元件、植物激素響應(yīng)元件和其它響應(yīng)元件，其中光響應(yīng)元件有ATCT-motif、Box 4、TCCC-motif、GATA-motif、G-box等元件，植物激素響應(yīng)元件有脫落酸響應(yīng)的ABRE元件、生長素響應(yīng)的TGA-element元件以及茉莉酸甲酯響應(yīng)的CGTCA、TGACG-motif等元件，其他元件包括抗旱響應(yīng)的MBS及3個(gè)功能未知的作用元件（表2）。

2.2 pHIS2-LAZY1誘餌菌株的獲得和自激活檢測

為了得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株，將構(gòu)建的pHIS2-LAZY1誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母AH109，挑選單克隆進(jìn)行PCR陽性鑒定，檢測結(jié)果顯示PCR片段長度為1 kb，與目標(biāo)大小一致（圖2-A），說明誘餌載體成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞得到pHIS2-LAZY1誘餌菌株。

圖2 陽性pHIS2-LAZY1誘餌菌株的鑒定及最低3-AT抑菌濃度的確定Fig.2 Identification of positive pHIS2-LAZY1 transformed bait-yeast strains and the determination of minimum inhibitory concentration of 3-AT

由于內(nèi)源性酵母的轉(zhuǎn)錄因子可能導(dǎo)致組氨酸泄漏，因此需要加入3-AT來抑制這種泄露，在氨基酸營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基SD-LTH中分別加入0、20和40 mmol/L的3-AT，通過觀察酵母生長情況以確定最適的3-AT抑制濃度。結(jié)果表明當(dāng)3-AT濃度為0和20 mmol/L時(shí)，檢測組（pHIS2-LAZY1+AD）和陰性對照（pHIS2+AD53）一樣都會生長。當(dāng)將3-AT濃度升高至40 mmol/L時(shí)，檢測組和陰性對照中酵母細(xì)胞的生長完全受到抑制，而陽性對照則正常生長。結(jié)果說明pHIS2-LAZY1在酵母AH109中不會發(fā)生自激活，因此，40 mmol/L 3-AT可作為最低抑菌濃度進(jìn)行酵母單雜文庫篩選。

2.3 酵母單雜文庫的構(gòu)建

提取日本晴萌發(fā)3 d后的幼苗RNA，電泳檢測結(jié)果顯示有完整的3條目的條帶，其中28S和18S條帶亮度明顯（圖3-A），表明RNA質(zhì)量較好。通過SMART技術(shù)擴(kuò)增合成雙鏈cDNA，純化電泳結(jié)果顯示條帶分散且分布均勻，純化后的cDNA片段大小在400-3 000 bp之間（圖3-B），說明所獲得的cDNA文庫中各基因的表達(dá)量均為平均水平，可用于后續(xù)反應(yīng)。

將上述cDNA文庫與pGADT7-rec載體共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，得到酵母單雜文庫菌。分別將稀釋后10倍（圖3-C）和100倍（圖3-D）的酵母細(xì)胞在YPDA平板上生長，根據(jù)菌斑生長情況使用1/100平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，cDNA文庫共轉(zhuǎn)的菌斑個(gè)數(shù)為370，即庫容為370×1 000×30=1.11×107CFU/mL，大于1×106CFU/mL的庫容要求。同時(shí)SV40大T PCR共轉(zhuǎn)的菌斑個(gè)數(shù)為148，空載體轉(zhuǎn)化的菌斑個(gè)數(shù)為11，由此可見cDNA文庫共轉(zhuǎn)的克隆數(shù)是空載體的10倍以上，即超過90%的克隆都包含同源重組后的pGADT7質(zhì)粒。使用T7和AD引物進(jìn)行菌落PCR，電泳檢測結(jié)果顯示酵母文庫菌中cDNA插入片段范圍為500-3 000 bp（圖3-E），上述結(jié)果表明成功獲得了可用于后續(xù)LAZY1上游調(diào)控因子篩選的酵母單雜文庫菌。

2.4 酵母單雜文庫篩選LAZY1的上游調(diào)控因子

為了得到與LAZY1啟動子作用的上游調(diào)控因子，通過pHIS2-LAZY1誘餌菌與酵母單雜文庫菌接合完成酵母單雜文庫篩選，離心收集酵母接合菌后涂布于缺陷型SD-LTH/40 mmol/L 3-AT的平板上，培養(yǎng)4 d后，發(fā)現(xiàn)平板上有酵母接合菌落，說明酵母單雜文庫菌中有獵物蛋白與pHIS2-LAZY1誘餌菌上的LAZY1啟動子結(jié)合。挑取結(jié)合菌落的單克隆進(jìn)行PCR檢測，選取擴(kuò)增條帶明亮、片段長度大于500 bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過Blast比對后去除重復(fù)結(jié)果，最終得到21個(gè)LAZY1的上游調(diào)控因子，通過功能注釋和文獻(xiàn)得到這21個(gè)基因的信息，這些上游調(diào)控因子包含了1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Os08g27850、2個(gè)激素相關(guān)蛋白Os11g44810和OsGLN2、1個(gè)細(xì)胞色素蛋白OsCYP20-2、1個(gè)幾丁質(zhì)家族蛋白Os04g41620、8個(gè)與蛋白質(zhì)合成和代謝的相關(guān)蛋白（Os02g55140、Os02g1531、Os04g20990、Os03g59310、Os12g08260、Os03g59320、Os04g53620、Os01g69950）以及8個(gè)參與糖脂類和能量代謝的相關(guān)蛋白（Os11g07020、Os01g54940、OsRBCS4、Os07g05360、Os01g05670、Os08g33820、Os01g41710、Os12g07210）（表3）。轉(zhuǎn)錄因子Os08g27850，屬于擬南芥中AtMBF1同源基因，故命名為OsMBF1。

2.5 OsMBF1正調(diào)控LAZY1的轉(zhuǎn)錄

轉(zhuǎn)錄因子往往直接調(diào)控下游基因的表達(dá)，為了檢測轉(zhuǎn)錄因子OsMBF1是否調(diào)控LAZY1的轉(zhuǎn)錄活性，采用酵母單雜和雙熒光素酶檢測方法檢測OsMBF1對LAZY1轉(zhuǎn)錄活性的影響。圖4顯示在含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固體培養(yǎng)基上酵母菌不能生長，設(shè)定抑制誘餌酵母生長的AbA濃度為500 ng/mL。通過pAbAi酵母單雜體系檢測發(fā)現(xiàn)OsMBF1可以與LAZY1啟動子產(chǎn)生酵母，表明兩者能夠在體外進(jìn)行互作。

將none-OsMBF1效應(yīng)載體和和190LUC-LAZY1報(bào)告載體通過PEG轉(zhuǎn)化法瞬時(shí)轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體，以空載體none和190LUC-LAZY1作為陰性對照，以fLUC/rLUC的比值代表LAZY1啟動子的相對轉(zhuǎn)錄活性。測量結(jié)果顯示，與對照相比，當(dāng)加入轉(zhuǎn)錄因子OsMBF1時(shí)，LAZY1啟動子的相對轉(zhuǎn)錄活性顯著增加（圖4），說明OsMBF1在煙草體內(nèi)能夠促進(jìn)LAZY1的表達(dá)，是LAZY1的正調(diào)控因子。

3 討論

水稻LAZY1在幼苗的葉鞘維管束內(nèi)側(cè)細(xì)胞和未伸長莖維管束的外周細(xì)胞中特異表達(dá)［8］，從而快速響應(yīng)答生長素信號并調(diào)控生長素的橫向運(yùn)輸［4］。同時(shí)，LAZY1在光、暗不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)也明顯不同，暗處理水稻幼苗可顯著提高其表達(dá)［2］。通過對LAZY1啟動子序列的順式元件分析發(fā)現(xiàn)它含有生長素響應(yīng)元件TGA-element和多個(gè)光響應(yīng)元件，由此可見，LAZY1的這種特異表達(dá)正是通過啟動子上的這些生長素響應(yīng)元件和多個(gè)光響應(yīng)元件對生長素和不同的光暗進(jìn)行響應(yīng)。

本研究通過酵母單雜篩庫策略共獲得了21個(gè)與LAZY1啟動子結(jié)合的蛋白，除了轉(zhuǎn)錄因子和激素響應(yīng)蛋白外，還包含有8個(gè)蛋白質(zhì)合成和代謝相關(guān)基因。這與近年研究表明核糖體蛋白不僅能參與蛋白質(zhì)的合成，還可直接或間接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)論相一致［19］。而一些具有特定結(jié)構(gòu)的RNA識別基序的蛋白可以與DNA結(jié)合［19］，如煙草中的剪接因子CFM3可調(diào)控?zé)煵軳IA1基因的轉(zhuǎn)錄［20］。在本研究中也篩選得到了一個(gè)富含絲氨酸/精氨酸的SC35-類剪接因子SCL30（Os02g15310），是一種定位于細(xì)胞核中能夠識別RNA motif的蛋白質(zhì)［21］。

轉(zhuǎn)錄因子可以直接或間接結(jié)合到下游目的基因的啟動子上，從而調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄活性。本研究通過酵母單雜篩庫得到了1個(gè)轉(zhuǎn)錄因子OsMBF1，雙熒光素酶檢測結(jié)果證明OsMBF1能夠結(jié)合到LAZY1啟動子上并促進(jìn)LAZY1的表達(dá)，是LAZY1的正調(diào)控基因。擬南芥MBF1的C端是保守的含有50-60個(gè)氨基酸所組成的轉(zhuǎn)角-螺旋-轉(zhuǎn)角（helixturn-helix）結(jié)構(gòu)域，能夠直接結(jié)合CTAGA的順式作用因子［22］。其中，在LAZY1啟動子的1 000 bp序列中含有2個(gè)CTAGA順式作用元件，推測其也有可能通過結(jié)合LAZY1啟動子的CTAGA元件從而調(diào)控表達(dá)。此外，MBF1也是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，能夠連接轉(zhuǎn)錄因子和TATA-box結(jié)合蛋白直接調(diào)控下游目的基因的表達(dá)，在進(jìn)化上高度保守［23］。MBF1可以通過對生長素等激素的響應(yīng)，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育，包括花器官和種子的發(fā)育，從而提高產(chǎn)量［24］。而LAZY1作為生長素快速應(yīng)答和橫向運(yùn)輸調(diào)控途徑的關(guān)鍵基因，OsMBF1可能參與了LAZY1介導(dǎo)的生長素響應(yīng)和運(yùn)輸途徑。前期報(bào)道發(fā)現(xiàn)熱激蛋白OsHSFA2D是水稻LAZY1的上游調(diào)控基因，當(dāng)OsHSFA2D發(fā)生突變后將導(dǎo)致LAZY1的表達(dá)下降，植株分蘗角增大［13］，但目前未發(fā)現(xiàn)OsHSFA2D可以直接結(jié)合LAZY1的啟動子。在擬南芥、小麥（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、苔蘚（Polytrichastrum alpinum）甚至低等植物紅藻中發(fā)現(xiàn)，MBF1能夠增強(qiáng)植物對非生物應(yīng)激脅迫的反應(yīng)，特別是在熱應(yīng)激反應(yīng)中的反應(yīng)，熱脅迫處理將會導(dǎo)致MBF1的表達(dá)量增加［25-26］。在水稻中異源過表達(dá)小麥TaMBF1能夠促進(jìn)植株對熱脅迫的能力［27］，推測MBF1與熱激蛋白可能存在潛在聯(lián)系，但是還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

4 結(jié)論

本研究通過酵母單雜交篩庫和雙熒光素酶的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)得到了水稻散生基因LAZY1的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子OsMBF1，有助于揭示LAZY1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。