微生物單細(xì)胞分離方法研究進(jìn)展

張坤 閆暢 田新朋

（1.中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院海洋微生物研究中心 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣州 511458；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細(xì)胞是所有生物的基本組成部分和進(jìn)化的基本單位，研究單細(xì)胞對(duì)各個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域都具有重要意義［1］。隨著單細(xì)胞分離技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展，單細(xì)胞分析受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，單細(xì)胞分離技術(shù)的產(chǎn)生和相關(guān)分析對(duì)生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了越來越大的影響，已被應(yīng)用到蛋白質(zhì)、神經(jīng)肽、酶活性、核酸等多種物質(zhì)的分析研究中，單細(xì)胞方法對(duì)于我們理解細(xì)胞生物化學(xué)和行為之間的聯(lián)系以及群體水平現(xiàn)象的細(xì)胞基礎(chǔ)也是必不可少的，這為進(jìn)一步發(fā)展疾病的早期分子診斷奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)［2-4］。在微生物研究領(lǐng)域，單細(xì)胞分離技術(shù)為未培養(yǎng)微生物的分離研究提供了新的思路，它在研究微生物生理、基因表達(dá)和功能方面也起著重要作用，其最重要的特點(diǎn)是分離并收集目標(biāo)單細(xì)胞的同時(shí)可以結(jié)合單細(xì)胞基因組學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)深入的多學(xué)科分析研究，因此，可能成為未來繞過微生物培養(yǎng)來揭示微生物暗物質(zhì)的有力工具［5-6］。

微生物在自然環(huán)境中普遍存在，且?guī)缀跖c所有多細(xì)胞生命形式相關(guān)，包括植物、動(dòng)物和人類［7］。自然界中大多數(shù)微生物處于未培養(yǎng)狀態(tài)，被稱為 “微生物暗物質(zhì)”，根據(jù)目前所描述的細(xì)菌種類和全球細(xì)菌多樣性指數(shù)的系統(tǒng)比較表明，99%細(xì)菌仍然未獲得純培養(yǎng)［8］。然而，這些未經(jīng)培養(yǎng)的微生物在碳氮循環(huán)、新型天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)以及維持環(huán)境平衡方面發(fā)揮著前所未有的作用［9］。近年來，隨著擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等非培養(yǎng)方法的發(fā)展，全球微生物多樣性和分布的信息呈指數(shù)增長(zhǎng)。基于16S rRNA序列的方法和環(huán)境宏基因組學(xué)［10］，許多新的候選分類單元得到認(rèn)可，但目前仍然有很多細(xì)菌門級(jí)類群尚未獲得純培養(yǎng)［11］。盡管宏基因組學(xué)和基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析日益增多，但獲取未培養(yǎng)微生物的純培養(yǎng)菌株對(duì)于深入系統(tǒng)研究微生物的生理機(jī)制、生態(tài)作用及遺傳進(jìn)化等仍至關(guān)重要。未培養(yǎng)并不意味著永遠(yuǎn)不能培養(yǎng)，而是意味著我們?nèi)狈﹃P(guān)于它們生物學(xué)的關(guān)鍵信息，這既是挑戰(zhàn)，也是機(jī)遇。當(dāng)前正在聚焦自然環(huán)境中微生物的生理狀態(tài)的研究，這可能為微生物的培養(yǎng)提供全新的思路、方法和途徑，即革新尚未培養(yǎng)的微生物的培養(yǎng)策略［12］。為了攻克微生物的不可培養(yǎng)特性，許多研究已開始開發(fā)替代培養(yǎng)方法。例如通過向培養(yǎng)基中添加特定的有機(jī)或無機(jī)化合物來改善生長(zhǎng)條件，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低營(yíng)養(yǎng)濃度和使用替代凝膠劑等方法，從而成功實(shí)現(xiàn)之前未培養(yǎng)微生物在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)。這些傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)雖然很重要，但對(duì)于許多未培養(yǎng)微生物的分離培養(yǎng)來說卻略顯盲目和偶然，因此需要?jiǎng)?chuàng)新和發(fā)展單細(xì)胞分離的新技術(shù)，新方法并應(yīng)用到微生物的分離與培養(yǎng)。

目前，新興培養(yǎng)技術(shù)大多遵循兩種分離策略，一種是利用高通量方法擴(kuò)大細(xì)胞分離的數(shù)量實(shí)現(xiàn)增大獲取目標(biāo)物種的機(jī)會(huì)，例如基于膜擴(kuò)散的培養(yǎng)方法、基于微流控技術(shù)的培養(yǎng)方法等。另一種策略則是靶向分離具有特定功能特征或?qū)儆谔囟惾旱奈⑸?，例如基于活?xì)胞熒光標(biāo)記和分選（Live-FISH）技術(shù)的細(xì)胞分選以及基于反向基因組學(xué)的熒光激活細(xì)胞分選等方法［13-15］。第一種策略通過建立大量單細(xì)胞培養(yǎng)物，然后篩選并鑒定培養(yǎng)物中的大部分物種來實(shí)現(xiàn)未培養(yǎng)微生物的規(guī)?；囵B(yǎng)，但該策略選擇性低，對(duì)于目標(biāo)菌種的獲取具有很大局限性。第二種策略對(duì)目標(biāo)微生物具有靶向性，可以選擇性分離環(huán)境微生物，但在大規(guī)模高通量分選方面有局限性。方法各有利弊，但是，通過利用這些培養(yǎng)方法對(duì)實(shí)現(xiàn)更多未培養(yǎng)微生物的純培養(yǎng)分離具有重要意義。本論文主要綜述了微生物單細(xì)胞分離方法研究方面的進(jìn)展，同時(shí)對(duì)單細(xì)胞分離方法在未來微生物分離培養(yǎng)方面的應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 微生物單細(xì)胞分離方法

自19世紀(jì)，瓊脂培養(yǎng)基發(fā)明以來，微生物分離培養(yǎng)發(fā)生了革命性的變化［16］，大量的微生物在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得了純培養(yǎng)。在微生物學(xué)發(fā)展的這100多年里，人們嘗試了各種方法分離獲得未培養(yǎng)微生物，從早期單純的瓊脂平板分離培養(yǎng)方法［17］到后期發(fā)展出多種多樣固體培養(yǎng)法等；隨著生物科技的發(fā)展，傳統(tǒng)的平板分離方法越來越不能滿足人們獲得未培養(yǎng)微生物的需求，各種新型單細(xì)胞分離方法次序產(chǎn)生，如膜擴(kuò)散培養(yǎng)法［18］、微流控分選［19］、光鑷技術(shù)［20］、顯微操作技術(shù)［21］、拉曼光譜分選［22］、熒光激活細(xì)胞分選［23］等方法（圖1），對(duì)未知微生物研究的方法不斷更新，以期攻克99%未知微生物純培養(yǎng)的問題。盡管目前的單細(xì)胞分離方法仍存在一些限制，但是運(yùn)用這些方法使我們獲得了許多未培養(yǎng)的新微生物資源，讓我們更好地了解到這些微生物的生理及生態(tài)作用，顯示出單細(xì)胞分離技術(shù)對(duì)未培養(yǎng)微生物研究明顯的優(yōu)勢(shì)。本文簡(jiǎn)要介紹幾種常用的單細(xì)胞分離方法及其在微生物研究中的應(yīng)用。

圖1 單細(xì)胞分離方法Fig.1 Single cell separation methods

1.1 膜擴(kuò)散培養(yǎng)法

由于來自環(huán)境樣本的微生物很少能在培養(yǎng)皿中的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，造成了大量未培養(yǎng)微生物難以發(fā)掘和利用，因此，研究者計(jì)劃通過模擬自然環(huán)境條件來實(shí)現(xiàn)未培養(yǎng)微生物的純培養(yǎng)。2002年，Kaeberlein等［18］根據(jù)“提供其自然環(huán)境的化學(xué)成分可以將其中不可培養(yǎng)微生物實(shí)現(xiàn)其可培養(yǎng)”的假設(shè)設(shè)計(jì)了一個(gè)擴(kuò)散室（diffusion chamber），來模擬這些微生物自然環(huán)境，并讓其能夠充分接觸到自然環(huán)境中的生長(zhǎng)成分。環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可透過通透膜擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，但膜內(nèi)外的微生物不能相互接觸，從而可使膜內(nèi)微生物獲得其原始生境中所需的所有生長(zhǎng)因子，保證了細(xì)胞間的物質(zhì)交流以促進(jìn)未經(jīng)培養(yǎng)的微生物在模擬的自然環(huán)境中生長(zhǎng)。通過孵育培養(yǎng)獲得了35%以上未知的、全新的微生物，為環(huán)境中未培養(yǎng)微生物的可培養(yǎng)提供了新的技術(shù)。根據(jù)同樣的假設(shè)，Aoi等［29］研制了一種用于環(huán)境微生物原位培養(yǎng)的中空纖維膜室（HFMC），該系統(tǒng)由48-96塊多孔中空纖維膜與注射器連接而成。通過連續(xù)稀釋環(huán)境中的細(xì)胞獲得極限稀釋的細(xì)胞懸浮液，將每個(gè)纖維膜室接種上單個(gè)細(xì)胞，然后浸入為細(xì)胞提供生長(zhǎng)因子的環(huán)境水樣中，因此，各種類型的純培養(yǎng)細(xì)胞可以在模擬環(huán)境條件下在每個(gè)室中生長(zhǎng)［13］。另外，Nichols等［30］設(shè)計(jì)并測(cè)試了一種隔離芯片（ichip），它由幾百個(gè)微型擴(kuò)散室組成，每個(gè)擴(kuò)散室都接種一個(gè)環(huán)境細(xì)胞。通過ichip的應(yīng)用微生物可恢復(fù)超過標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)的許多倍，并且生長(zhǎng)的物種具有顯著的系統(tǒng)發(fā)育新穎性。這種新方法可以接觸到大量多樣的以前無法接觸到的微生物，非常適合基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究。

1.2 顯微操作技術(shù)

從環(huán)境樣本中捕獲和分離單細(xì)胞的顯微操作技術(shù)在40多年前就被引入，之后人們?cè)啻螄L試使用顯微操作技術(shù)來改善對(duì)單細(xì)胞的處理。利用視覺反饋系統(tǒng)，顯微鏡聚焦到目標(biāo)物上，將調(diào)節(jié)濃度的微生物懸浮液吸入簡(jiǎn)單的毛細(xì)管中，使單個(gè)細(xì)胞在確定的體積內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移［21,28］。早期系統(tǒng)的主要障礙是放大率低導(dǎo)致無法操作單個(gè)原核細(xì)胞，但隨著顯微鏡的不斷改進(jìn)和微毛細(xì)血管的發(fā)展，顯微操作技術(shù)已經(jīng)成功地將單細(xì)胞從實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和自然環(huán)境中分離出來。顯微操作技術(shù)是一種簡(jiǎn)單、方便、高效和成本低的分離單個(gè)細(xì)胞的方法，但是其吞吐量有限、自動(dòng)化程度低、操作技術(shù)要求較高［31-32］。2005年，Ish?y等［33］提出了一個(gè)改進(jìn)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)由倒置顯微鏡、微進(jìn)樣器和微操作器組成，可以使單個(gè)活的原核細(xì)胞從混合細(xì)胞中分離出來且不受其他非目標(biāo)細(xì)胞的污染。他們利用微毛細(xì)管將分離的細(xì)胞捕獲并轉(zhuǎn)移到合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，并證明了被顯微操作器捕獲的細(xì)胞確實(shí)可以生長(zhǎng)。然而，目前顯微操作的主要局限性仍然是在培養(yǎng)基中單細(xì)胞生長(zhǎng)的成活率較低，這阻礙了該技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室的廣泛應(yīng)用［34］。

1.3 光鑷技術(shù)

1986年，Ashkin等［20］發(fā)明了光鑷，并用光鑷對(duì)病毒和細(xì)菌進(jìn)行了捕獲和操作實(shí)驗(yàn)，由此開啟了光鑷在物理學(xué)和生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用。光鑷的原理是使用高度聚焦的激光束來捕捉和操縱微觀的中性物體，它能夠?qū)ξ⒚状笮〉慕橘|(zhì)物體施加作用力，如小的電介質(zhì)球形粒子，它們受到兩種力的作用，即光子沿其傳播方向撞擊細(xì)胞所產(chǎn)生的散射力和場(chǎng)強(qiáng)梯度所產(chǎn)生的梯度力［35-36］。在光鑷技術(shù)操作中不需要物理接觸，細(xì)胞可以在無菌條件下的封閉室中完成操作［37］。2019年，Zhang等［38］確立了一個(gè)操作程序，允許使用光鑷處理和成像單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，同時(shí)最大限度地減少對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成的負(fù)面影響，這是一種使用光鑷長(zhǎng)期穩(wěn)定處理單個(gè)大腸桿菌細(xì)胞的方法，這項(xiàng)工作為光鑷在微生物學(xué)中的應(yīng)用鋪平了道路。結(jié)合微流控技術(shù)，光鑷為在單個(gè)微芯片平臺(tái)下對(duì)不同細(xì)胞類型進(jìn)行高通量分選提供了光學(xué)技術(shù)的發(fā)展前景。在單細(xì)胞生物化學(xué)研究中，將光鑷與拉曼光譜相結(jié)合也變得越來越流行，因?yàn)槔霉獾牧α縼砉潭ㄋ芯康募?xì)胞，不僅避免了將細(xì)胞固定在基質(zhì)上的負(fù)面影響，而且還提高了記錄光譜的質(zhì)量［39］。Liu等［40］描述了一種結(jié)合光鑷?yán)庾V、漸進(jìn)式增長(zhǎng)生成對(duì)抗網(wǎng)絡(luò)（PGGAN）和殘差網(wǎng)絡(luò)（ResNet）分析的微生物分類新方法，利用該方法對(duì)深海細(xì)菌進(jìn)行了單細(xì)胞拉曼光譜分析。PGGAN可以為大多數(shù)現(xiàn)有的深度學(xué)習(xí)方法快速生成大量的高分辨率拉曼光譜，并提高其預(yù)測(cè)精度，ResNet能夠?qū)Φ托旁氡鹊睦庾V進(jìn)行準(zhǔn)確的分類。結(jié)合PGGAN的高分辨率數(shù)據(jù)，ResNet可以快速、高效、準(zhǔn)確地對(duì)單細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行分類，這在海洋生物學(xué)與生態(tài)學(xué)中具有重要意義。因此，光鑷技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用既發(fā)揮了其優(yōu)點(diǎn)也彌補(bǔ)了不足，有利于促進(jìn)未來單細(xì)胞分離方法的發(fā)展。

1.4 微流控技術(shù)

高效的細(xì)胞分離是生物和醫(yī)學(xué)研究中的必要手段，由于傳統(tǒng)技術(shù)的分離和分析稀有細(xì)胞方面的能力有限，如選擇性普遍較低、樣品損失較大等，限制了該方法的應(yīng)用，因此，最近發(fā)展了許多微尺度分離技術(shù)［41］。微流控芯片技術(shù)是一種能夠在微尺度上運(yùn)輸和操縱流體和顆粒（如細(xì)胞）的技術(shù)，已被用于稀有細(xì)胞的分離、富集和分析［19］，具有更高的效率和靈敏度水平。微流控技術(shù)利用不同細(xì)胞群內(nèi)在特性的差異來實(shí)現(xiàn)分離，特別是細(xì)胞的機(jī)械和物理性能，包括尺寸、形狀、密度、附著力和可變形性，都是特性區(qū)分的常見標(biāo)志［41］。微流控設(shè)備可以通過微滴流體技術(shù)［42］、介質(zhì)電泳［43］、聲學(xué)［44］、磁學(xué)［45］等方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。微液滴產(chǎn)生的常見幾何結(jié)構(gòu)包括T型結(jié)、流聚焦和共流結(jié)構(gòu)，基本工作原理是相同的，即在兩種共流非混相流體之間創(chuàng)建一個(gè)界面，其中一種流體自我分離成離散的液滴，液滴被另一種流體包圍［42］。介質(zhì)電泳（DEP）是可極化粒子在非均勻電場(chǎng)中的誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)，已被證明是在微流體系統(tǒng)中傳輸、積累、分離和表征微/納米級(jí)生物粒子的完美候選方法［43］。聲學(xué)分離技術(shù)主要是基于體聲波或表面聲波來精確控制細(xì)胞或者粒子的分離［44］。磁分選通過使用抗體、多肽或凝集素使磁珠表面功能化，磁珠可以高選擇性地附著在細(xì)胞上或被細(xì)胞吞噬，從而使利用外部磁場(chǎng)操縱細(xì)胞成為可能［45］。微流控芯片在提高分析靈敏度、準(zhǔn)確性和吞吐量等方面具有突出的優(yōu)點(diǎn)。它的某些特性，如快速樣品處理和測(cè)定中流體的精確控制，使其成為有吸引力的替代傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法的候選技術(shù)。在過去的20年里，發(fā)展微流控技術(shù)，即所謂的“芯片上的實(shí)驗(yàn)室”，已成為一種趨勢(shì)，以使這些程序小型化和自動(dòng)化，用于分離細(xì)胞和微粒的過程被縮小成一個(gè)小的微流控芯片［46］。近年來，微流控土壤芯片（microfluidic soil chip）被開發(fā)出來，用于觀察土壤過程和微生物間的相互作用。這種技術(shù)可以使可見光譜進(jìn)入自然不透明的土壤系統(tǒng)，并能夠直接研究微觀結(jié)構(gòu)和化學(xué)控制環(huán)境中的微生物生長(zhǎng)和相互作用［47-48］。Qiao等［49］開發(fā)了一種微流控?zé)晒饧せ钜旱畏诌x技術(shù)來篩選PET塑料降解菌，并評(píng)估了假定的PET酶的降解活性，該技術(shù)可以廣泛應(yīng)用于PET降解微生物和酶的發(fā)現(xiàn)。微流控技術(shù)是一種強(qiáng)大的平臺(tái)技術(shù)，它不僅被應(yīng)用在微生物的檢測(cè)，還能夠?qū)崿F(xiàn)罕見的細(xì)胞分離、高效的單細(xì)胞組學(xué)分析，為藥物開發(fā)提供了平臺(tái)［50］。2021年，Xu等［51］引入了一種基于離心機(jī)的微流控濃縮器，用于毫升到皮升的細(xì)菌懸液濃縮，以實(shí)現(xiàn)快速和實(shí)時(shí)的病原體檢測(cè)和藥敏實(shí)驗(yàn)。該方法可以通過顯微鏡直接觀察病原菌細(xì)胞，更重要的是，藥敏實(shí)驗(yàn)可以從原始樣品開始而無需傳統(tǒng)的預(yù)培養(yǎng)步驟，其富集效率更高。可見微流控技術(shù)大大提高了單細(xì)胞分選及藥物開發(fā)的效率，具有良好的發(fā)展前景。

1.5 單細(xì)胞拉曼分選

單細(xì)胞拉曼光譜（SCRS）作為一種振動(dòng)光譜，是拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)（RACS）的基礎(chǔ)。通過激光與樣品相互作用時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)鍵的振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)，來識(shí)別分子的特殊指紋，然后與共聚焦顯微鏡或其他設(shè)備結(jié)合，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞檢測(cè)。在單細(xì)胞拉曼光譜的基礎(chǔ)上，拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)提供一種無標(biāo)記的細(xì)胞分選方法，拉曼激活細(xì)胞分選系統(tǒng)將單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)儀器耦合到可在溶液中工作的細(xì)胞分離系統(tǒng)上，從而實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的分選。此外，拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)與具有獨(dú)特指紋特征的單細(xì)胞拉曼光譜的結(jié)合，有效地測(cè)量單個(gè)細(xì)胞中所有拉曼活性成分的生化譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞功能的定量和多方面研究［22,52］。拉曼激活細(xì)胞分選是多種單細(xì)胞分類技術(shù)中的一種新興方法，包括4個(gè)基本操作程序：首先，在檢測(cè)點(diǎn)定位樣品；其次，從細(xì)胞中獲取拉曼信號(hào)；第三，快速的現(xiàn)場(chǎng)分析和實(shí)時(shí)決策；最后，收集目標(biāo)樣品的分離物［53］。Wang等［54］利用拉曼激活細(xì)胞分選技術(shù)分選人腸道中的耐藥菌，其研究結(jié)果表明，人類腸道耐藥菌群和個(gè)人病史之間有很強(qiáng)的關(guān)系。Zhang等［25］開發(fā)了一種靜態(tài)版本的RACS系統(tǒng)，被稱為拉曼活化細(xì)胞彈射（RACE）系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過應(yīng)用脈沖激光將選定的細(xì)胞從襯底噴射到制備的容器中，使其分布在CaF2載玻片上（涂有光吸附中間層），利用該系統(tǒng)對(duì)類胡蘿卜素生產(chǎn)酵母（9%）和非類胡蘿卜素生產(chǎn)釀酒酵母（91%）的兩種細(xì)胞株的混合物進(jìn)行了分選，前者平均富集到73%，并顯示了亞秒級(jí)快速拉曼激活的細(xì)胞分選效率。Su等［55］對(duì)RACE系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，不僅提高了土壤微生物群拉曼活化細(xì)胞彈射和測(cè)序（RACE-Seq）的成功率，而且將精確保護(hù)細(xì)胞免受激光輻照作為方法開發(fā)的優(yōu)先任務(wù)。目前，單細(xì)胞拉曼分選仍在不斷改進(jìn)及發(fā)展，在未來可能應(yīng)用到多個(gè)研究領(lǐng)域。

1.6 熒光激活細(xì)胞分選

熒光激活細(xì)胞分選（FACS）由于其成熟的技術(shù)發(fā)展、高靈敏度和高通量特點(diǎn)，已成為許多生物學(xué)家選擇的細(xì)胞分選方法［41］。FACS是一種具有單細(xì)胞分選能力的流式細(xì)胞儀，是基于大小、粒度和熒光來描述和定義異質(zhì)細(xì)胞群中不同細(xì)胞類型的細(xì)胞分選技術(shù)［32］。FACS是唯一可用的基于內(nèi)染色或細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)（如基因修飾的熒光蛋白標(biāo)記）分離細(xì)胞的技術(shù)，它可以根據(jù)大小、粒度和熒光對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行純化。為了分離純化目標(biāo)細(xì)胞，首先用熒光標(biāo)記的單克隆抗體（mAb）對(duì)其進(jìn)行染色，該抗體可以識(shí)別所需細(xì)胞群上的特定表面標(biāo)記，未染色的細(xì)胞作為陰性對(duì)照［23］。FACS純化需要一個(gè)具有分選能力的流式細(xì)胞儀和相應(yīng)的軟件。利用流式細(xì)胞儀細(xì)胞分選過程中，大量懸浮細(xì)胞以液滴流的形式在激光前傳遞，每個(gè)液滴包含一個(gè)單細(xì)胞，熒光檢測(cè)系統(tǒng)根據(jù)預(yù)先確定的細(xì)胞熒光參數(shù)檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞。該儀器將電荷應(yīng)用于包含目標(biāo)細(xì)胞的液滴上，靜電偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)有助于將帶電液滴收集到適當(dāng)?shù)氖占苤校?6］。最新的技術(shù)簡(jiǎn)化了處理流程，提高了細(xì)胞分選能力，并引入了多參數(shù)測(cè)量?，F(xiàn)在可以用2-3種不同的熒光染料來研究微生物群落，這些染料針對(duì)不同特定的生物分子和生理過程，因此，這樣可以同時(shí)評(píng)估細(xì)胞的生理狀態(tài)、它們的分類地位和功能基因表達(dá)情況，并最終將靶細(xì)胞分離和應(yīng)用于進(jìn)一步的研究［57］。Espina在熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種單一程序，幫助區(qū)分基于活力染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和熒光激活細(xì)胞分選的不可培養(yǎng)現(xiàn)象。利用該技術(shù)在選定的土壤樣品中，通過選擇具有活性和代謝活性的細(xì)菌，培養(yǎng)細(xì)菌的成功率提高了一倍［58］。Ozawa等［59］利用熒光激活細(xì)胞分選從水樣中專門檢測(cè)和分離單個(gè)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞，結(jié)果表明利用基于流式細(xì)胞儀的熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞分離是獲取致病菌的有效工具。熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，在單細(xì)胞分選過程中也可以聯(lián)合其他技術(shù)來達(dá)到單細(xì)胞分選的目的。

2 單細(xì)胞技術(shù)在微生物靶向分離中的應(yīng)用

雖然目前單細(xì)胞分離技術(shù)有很多種，但是微生物單細(xì)胞靶向或者特異性分離技術(shù)卻很少。然而許多研究過程中往往需要獲得樣品中特定類群的純培養(yǎng)物，因此就需要實(shí)現(xiàn)微生物的靶向分離和培養(yǎng)。本文介紹幾種目前主要的單細(xì)胞技術(shù)在微生物靶向分離中的應(yīng)用。

2.1 基于熒光原位雜交技術(shù)的單細(xì)胞分離方法

熒光原位雜交（FISH）是一種強(qiáng)大的可視化群落環(huán)境中微生物種群的方法，可以此為基礎(chǔ)，通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）將目標(biāo)種群從多物種背景中分離出來［60］。2020年，Yilmaz等［61］修改了標(biāo)準(zhǔn)的核糖體RNA靶向熒光原位雜交（FISH）方案，該方案刪除了FISH中細(xì)胞固定步驟，可允許恢復(fù)未修飾的核酸。利用該方法，不僅成功標(biāo)記而且在熒光顯微鏡中觀察到了生物反應(yīng)器污泥和白蟻后腸樣品中的雜交細(xì)胞。然后，他們用群體特異性寡核苷酸探針（使用溶液中無固定FISH）標(biāo)記污泥樣本中的一種細(xì)菌和一種古菌種群，并使用FACS對(duì)雜交種群進(jìn)行分類?；?6S rRNA基因測(cè)序，他們證明了分類的群體對(duì)目標(biāo)生物高度富集，從而使用改進(jìn)的FISH方案確認(rèn)探針特異性。這種方法有助于后續(xù)的基因組測(cè)序和目標(biāo)菌種的分析。最近Batani等提出一種Live-FISH新方法（圖2）［14］，證明了無固定化的細(xì)菌可以在熒光原位雜交過程中存活，并且通過優(yōu)化離心速度和重懸緩沖液等因素可以提高細(xì)胞存活率。接下來，他們證明了標(biāo)記的DNA探針可以被引入活的細(xì)菌細(xì)胞，并提供了與16S rRNA靶向發(fā)生特異性雜交的證據(jù)。Live-FISH標(biāo)記包括4個(gè)步驟，第一步是預(yù)雜交，即樣品溶液與磷酸緩沖液或者人工海水混合培養(yǎng)過夜后室溫離心；第二步是熱激，即在冰浴處理的MgCl2/CaCl2液體中重懸細(xì)胞顆粒，并在冰上黑暗培養(yǎng)后經(jīng)過水浴熱激；第三步是雜交，即通過加入預(yù)溫雜交緩沖液后進(jìn)行黑暗培養(yǎng);第四步是洗滌，即通過室溫離心沉淀和加入預(yù)熱的洗滌緩沖液洗滌后，再重懸于磷酸緩沖液中并置于暗處冰上保存直到進(jìn)行細(xì)胞分選。該方法與熒光激活的細(xì)胞分選（FACS）相結(jié)合，可對(duì)模擬細(xì)菌群落和自然細(xì)菌群落中特定的細(xì)菌分類群進(jìn)行分類，尤其是對(duì)屬于探針目標(biāo)所定義的特定分類組的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性活細(xì)菌，并隨后進(jìn)行分選與培養(yǎng)［14］。Dam等在研究結(jié)合單細(xì)胞基因組學(xué)靶向細(xì)胞分選方法捕獲低豐度微生物暗物質(zhì)時(shí)采用了無固定熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對(duì)烏拉圭釀酒廠廢水處理廠中的綠彎菌進(jìn)行了熒光標(biāo)記，并且利用FACS對(duì)標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分選。使用目標(biāo)細(xì)胞分選富集未培養(yǎng)的綠彎菌，該菌在環(huán)境樣本中的豐度低于總菌群的1%，結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從烏拉圭釀酒廠廢水中共獲得了19個(gè)綠彎菌物種的基因組草圖，該研究提供了一種靈敏的方法來捕獲環(huán)境中豐度極低的目標(biāo)微生物類群［62-63］。Chloroflexi（綠彎菌）雖然在深海、熱泉和工業(yè)廢水中廣泛分布，但其仍是一類難培養(yǎng)微生物。該方法實(shí)現(xiàn)了難培養(yǎng)微生物的靶向分離與培養(yǎng)，為科研工作者提供了研究基礎(chǔ)。

圖2 基于Live-FISH技術(shù)的單細(xì)胞分離方法Fig.2 Single cell separation method based on Live-FISH technique

2.2 基于反向基因組學(xué)的單細(xì)胞分離方法

在最近的一項(xiàng)研究中，Cross等［15］報(bào)道了一種利用基因組信息抗體工程技術(shù)從復(fù)雜群落捕獲特定微生物繼而達(dá)到純培養(yǎng)的方法。此研究填補(bǔ)了非分類特異性細(xì)胞染色之間的空白，這種染色既能標(biāo)記細(xì)胞，又能保持細(xì)胞活力，而且具有一定的分類特異性。該工作被稱為反向基因組學(xué)對(duì)未培養(yǎng)細(xì)菌的定向分離和培養(yǎng)的有效方法，主要研究步驟如圖3所示［15］，包括確定SAG和MAG中膜蛋白編碼基因，選擇預(yù)測(cè)暴露的表位，制備抗體，進(jìn)行蛋白純化和微生物熒光標(biāo)記，對(duì)微生物組樣本中的靶細(xì)胞染色以及最后的靶細(xì)胞的分離、基因組測(cè)序或培養(yǎng)。該研究應(yīng)用反向基因組學(xué)方法分離和測(cè)序單細(xì)胞并成功培養(yǎng)了人類口腔Saccharibacteria（TM7）的3個(gè)不同物種。TM7是基于16S rRNA基因序列提出的第一個(gè)候選細(xì)菌門之一，并已在活性污泥和人類口腔等許多環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)［64］。使用此分類培養(yǎng)方法，研究人員證明了這3個(gè)Saccharibacteria（TM7）物種都是放線菌門下不同的寄生菌，他們還分離和培養(yǎng)了人類口腔SR1細(xì)菌，這是一個(gè)以前未培養(yǎng)的細(xì)菌譜系的成員。該方法中抗體標(biāo)記的細(xì)胞也可以被輸送到其他平臺(tái)，以實(shí)現(xiàn)高通量細(xì)胞分離，例如，微滴或芯片。該研究還表明微生物的反向基因組培養(yǎng)方法可以應(yīng)用于任何環(huán)境下的任何物種，并有可能分離、培養(yǎng)和鑒定微生物樹中尚未培養(yǎng)的新物種。由此可見，隨著分離技術(shù)的進(jìn)步，使微生物特異性分離逐步成為現(xiàn)實(shí)。

圖3 基于反向基因組學(xué)的微生物靶向分離Fig.3 Targeted isolation of microorganisms based on reverse genomics

3 微生物單細(xì)胞分離方法的優(yōu)點(diǎn)與不足

這些單細(xì)胞分離方法各有其特點(diǎn)，對(duì)微生物單細(xì)胞分離具有重要推動(dòng)作用（表1），可將其分為兩類，一是高通量分離方法，包括膜擴(kuò)散培養(yǎng)法、微流控技術(shù)、單細(xì)胞拉曼分選及熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)。膜擴(kuò)散培養(yǎng)法通過對(duì)未培養(yǎng)微生物原位培養(yǎng)來達(dá)到分離微生物的效果，可增加微生物的可培養(yǎng)率，但是該分離培養(yǎng)方法耗時(shí)久、工作量大、不具有特異性，主要是通過獲得大量培養(yǎng)物達(dá)到菌株分離的效果［65］。微流控技術(shù)能夠使用非常少量的樣品和試劑，并以高分辨率和靈敏度進(jìn)行分離和檢測(cè)，具有低成本、分析時(shí)間短、分析設(shè)備占用空間小、對(duì)細(xì)胞微環(huán)境控制能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［66］。微流控技術(shù)也可以與一些其他技術(shù)如流式細(xì)胞儀或者拉曼光譜技術(shù)聯(lián)用來分離單細(xì)胞，但是其通用性比較低，在單細(xì)胞分選過程中除了部分方法外往往需要標(biāo)記，這也可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定的損傷［67-68］。單細(xì)胞拉曼技術(shù)分選效率高，無創(chuàng)、無標(biāo)記，但是該技術(shù)對(duì)儀器要求較高，自發(fā)拉曼光譜信號(hào)比較弱，分選不具有特異性，目前只能通過拉曼光譜對(duì)某些微生物進(jìn)行選擇性分離［69］。熒光激活細(xì)胞分選具有技術(shù)成熟、高靈敏度、高通量的特點(diǎn)，其在基礎(chǔ)研究和臨床研究中均得到了廣泛的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。首先，F(xiàn)ACS是依賴于流式細(xì)胞儀為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，需要大量懸浮細(xì)胞，它不能從低數(shù)量的細(xì)胞群中分離出單個(gè)細(xì)胞。其次，機(jī)器內(nèi)的快速流動(dòng)和非特異性熒光分子會(huì)損害分選細(xì)胞的活力，導(dǎo)致分離失敗［32］。另一類分離方法是靶向分離方法，對(duì)目標(biāo)細(xì)胞具有選擇性，包括Live-FISH及反向基因組學(xué)方法。Live-FISH主要通過對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行活細(xì)胞熒光標(biāo)記，再結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選［14］。該方法靶向分離細(xì)胞效果較強(qiáng)，但耗時(shí)久、對(duì)細(xì)胞破壞性大、成活率低。反向基因組學(xué)方法依賴抗體結(jié)合靶細(xì)胞表面暴露的抗原表位進(jìn)行標(biāo)記，適用性廣泛，但是靶向性不強(qiáng)，結(jié)合流式細(xì)胞分選會(huì)附帶許多非目標(biāo)菌株，也會(huì)損傷細(xì)胞。此外還有一些其他類的單細(xì)胞分選方法，雖然不能做到高通量分離或者靶向分離，但是他們?cè)趩渭?xì)胞分離方面仍具有重要作用，如光鑷技術(shù)、顯微操作技術(shù)等。光鑷技術(shù)在單細(xì)胞分離方面精度高、效率高，但在生物研究中應(yīng)用光鑷通常用于光學(xué)捕獲的紅外（IR）光會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷［38］。顯微操作技術(shù)適用范圍廣，可以分離選定的細(xì)胞，但是分離效率低，容易損傷細(xì)胞而造成細(xì)胞的成活率降低［70］。對(duì)于這些微生物單細(xì)胞分選方法，均有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，因此，在微生物分離過程中需明確研究目的，才能更好地選擇和應(yīng)用合適的分離技術(shù)來達(dá)到研究目標(biāo)。

表1 微生物單細(xì)胞分離方法的優(yōu)點(diǎn)及不足Table 1 Advantages and disadvantages of single cell separation methods for microorganisms

4 總結(jié)與展望

單細(xì)胞分析在生命科學(xué)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景，本文主要概述了多種單細(xì)胞分離方法的研究進(jìn)展，包括具有高通量分選單細(xì)胞的分離方法，具有靶向分離單細(xì)胞的方法，以及其他的一些單細(xì)胞分離方法。這些分離方法各具特色，既有優(yōu)點(diǎn)，也有不足，隨著科技的不斷進(jìn)步和發(fā)展，未來單細(xì)胞分離技術(shù)應(yīng)該在以下幾個(gè)方面進(jìn)行提升。首先，是減小細(xì)胞損傷。雖然目前單細(xì)胞分選技術(shù)為我們的科學(xué)研究提供了技術(shù)支持，但是大多數(shù)的單細(xì)胞分離方法存在損傷細(xì)胞的問題，例如，顯微操作、光鑷技術(shù)、熒光激活細(xì)胞分選等過程中導(dǎo)致的細(xì)胞變形、功能改變，甚至細(xì)胞死亡等。因此，首先要改進(jìn)的就是在保持分選效率的情況下減少對(duì)細(xì)胞的損傷。其次，改進(jìn)單細(xì)胞靶向分離技術(shù)。雖然目前已有研究實(shí)現(xiàn)了環(huán)境中微生物的靶向分離，如Live-FISH技術(shù)、基于反向基因組學(xué)的分離技術(shù)，但是這些技術(shù)對(duì)于單細(xì)胞分離是十分有限的，并不是環(huán)境中的所有目標(biāo)微生物都能實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，許多微生物沒有現(xiàn)有的生物標(biāo)志物，或者目標(biāo)細(xì)胞難以用熒光探針標(biāo)記，可能會(huì)標(biāo)記到非目標(biāo)微生物。目前的應(yīng)用仍只是環(huán)境中豐度高的類群或者特殊的類群，并且這兩種分離方法需要結(jié)合流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞需要大量懸浮細(xì)胞，而且此過程也會(huì)損失和損傷目標(biāo)細(xì)胞。雖然這兩種靶向分離方法有明顯的不足，但也是目前已有的最先進(jìn)的靶向分離方法，期待在未來隨著技術(shù)的進(jìn)步，可以改進(jìn)微生物標(biāo)記探針提高其特異性以及標(biāo)記后的細(xì)胞分選技術(shù)減少活細(xì)胞損失和損傷，從而彌補(bǔ)這些技術(shù)在靶向識(shí)別、高通量分選等方面的不足，更好地為未培養(yǎng)微生物資源等科研服務(wù)。第三, 發(fā)展新型單細(xì)胞分離技術(shù)。目前，Doudna團(tuán)隊(duì)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)復(fù)雜細(xì)菌群落中物種和特定位點(diǎn)的基因組編輯［71］，因此希望未來基因編輯技術(shù)或者其他技術(shù)能夠成功發(fā)展和應(yīng)用到微生物的靶向分離中。第四，拓展單細(xì)胞分離技術(shù)的應(yīng)用。單細(xì)胞分離技術(shù)在很多領(lǐng)域已經(jīng)顯示出其廣泛的應(yīng)用前景，期待在環(huán)境樣本中微生物分離、藥物分子篩選、腫瘤細(xì)胞篩選、細(xì)胞器分選、生物醫(yī)學(xué)和臨床診斷等方面能得到實(shí)際應(yīng)用，真正將科學(xué)研究應(yīng)用到實(shí)處，服務(wù)于人類社會(huì)發(fā)展。