高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定血液和尿液中12種殺鼠劑

游慧圓，劉云富，譚廣輝，吳燕梅

（1. 惠州市職業(yè)病防治院，廣東惠州 516008； 2. 惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東惠州 516008）

殺鼠劑種類繁多，使用廣泛。其中抗凝血?dú)⑹髣┳?944 年面世以來，由于其適口性好，不易產(chǎn)生抗食性，具有廣譜、高效、可口、毒性相對(duì)較低、不易引起二次中毒且有特效解毒藥維生素K1等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于室內(nèi)外殺鼠,是我國(guó)目前使用最廣泛的的殺鼠劑，既有利于徹底消滅投餌區(qū)的鼠群，而又能減少非靶標(biāo)動(dòng)物誤食中毒機(jī)會(huì)。但由于使用范圍廣或管理疏漏，人和動(dòng)物中毒及投毒事件時(shí)見報(bào)道[1-9]。

安妥又名1-萘基硫脲、α-萘硫脲，是一種硫脲類急性殺鼠劑，選擇性強(qiáng)，主要用于防治褐家鼠及黃毛鼠。安妥能引起急性中毒且能致癌，所以國(guó)家已經(jīng)明令禁止在鼠藥中使用安妥，但因其對(duì)鼠類殺滅效果好，市場(chǎng)上仍有銷售，安妥致人、畜中毒事件時(shí)有發(fā)生[10-12]。鼠立死是一種高效、劇毒、急性殺鼠劑，其毒作用為維生素B6 拮抗劑，干擾r-氨基丁酸的氨基轉(zhuǎn)移和脫羧反應(yīng)，中毒癥狀為典型的神經(jīng)性毒劑癥狀具有滅鼠譜廣、使用濃度低的特點(diǎn)。鼠立死的突出優(yōu)點(diǎn)是蓄積毒性微弱，不易發(fā)生二次中毒，有高效解毒劑、毒餌濃度低，是一種理想的急性殺鼠劑，被用于田野滅鼠。毒鼠堿是由馬錢子中提取的一種生物堿，可用作鼠藥以控制嚙齒類動(dòng)物，但其對(duì)大多數(shù)家畜有很高的毒性作用，曾有文獻(xiàn)報(bào)道毒鼠堿所致人員中毒情況[13]。

由于抗凝血?dú)⑹髣┓N類繁多，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，容易混淆，而且不易揮發(fā)，所以目前對(duì)抗凝血?dú)⑹髣┑臋z測(cè)研究主要集中于液相色譜法[14-18]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-26]。見諸報(bào)道的安妥測(cè)定法有液相色譜法[27]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[25,28]，鼠立死用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20,30]或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[29]測(cè)定，而毒鼠堿的測(cè)定方法未見報(bào)道。由于鼠藥種類繁多，臨床救治迫切需要實(shí)驗(yàn)室能夠在短時(shí)間內(nèi)確定毒物種類，所以目前鼠藥測(cè)定方法的研究主要集中于多組分同時(shí)測(cè)定。

筆者利用液相萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 法，建立了血液和尿液樣品中溴鼠靈、殺鼠醚、溴敵隆、殺鼠靈、氯殺鼠靈、克滅鼠、異殺鼠酮、氯敵鼠、敵鼠、鼠立死、安妥、毒鼠堿12種滅鼠劑的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確度高，精密度好，適用于疑似鼠藥中毒病人的全血和尿液樣品中鼠藥的定性、定量測(cè)定，為化學(xué)中毒原因分析和臨床救治提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：6460型，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

MS3型漩渦混合器：MS3型，德國(guó)IKA公司。

全自動(dòng)平行濃縮儀：Auto EVA 80，?？萍瘓F(tuán)（廈門）股份有限公司。

超聲波清洗器：KQ7200DV 型，江蘇金怡儀器科技有限公司。

漩渦振蕩器：SL-0246 型，美國(guó)Scientific Industries（思博明）公司。

高速臺(tái)式離心機(jī)：Allegra 64R 型，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

純水系統(tǒng)：Direct-Q型，美國(guó)密理博有限公司。

乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司。

甲酸、乙酸銨：優(yōu)級(jí)純，天津科密歐有限公司。

10 種殺鼠劑標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，溴鼠靈，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23008-100M；殺鼠醚，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23009-100M；殺鼠靈，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23011-100 A；氯殺鼠靈，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23001-100M；克滅鼠，溶劑為乙腈，編號(hào)為1ST23012-100 A；異殺鼠酮，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23003-100M；氯敵鼠，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST000467-100M；鼠立死，溶劑為甲醇，編號(hào)為1ST23006-100M；安妥，溶劑為乙腈，編號(hào)為1ST000665-100 A；毒鼠堿，溶劑為乙腈，編號(hào)為1ST23016-100 A；天津阿爾塔公司。

溴敵隆標(biāo)準(zhǔn)溶液：質(zhì)量濃度為100 μg/mL，溶劑為乙酸乙酯，編號(hào)為SB05-141-2008，農(nóng)業(yè)保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

敵鼠標(biāo)準(zhǔn)溶液：100 μg/mL，溶劑為甲醇，編號(hào)為1033，北京中衛(wèi)永晟科技有限公司。

質(zhì)量控制樣品：各組分質(zhì)量濃度均為0.1 μg/L，（1）含有牛血中溴鼠靈和溴敵隆，編號(hào)為GDOHNY BZ005；（2）尿中殺鼠醚和殺鼠靈，編號(hào)為GDOHN YBZ017，廣東省職業(yè)病防治院。

實(shí)驗(yàn)用水：經(jīng)超純水機(jī)制取的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取12 種殺鼠劑各0.5 mL 于10 mL 容量瓶中，加入乙腈定容至標(biāo)線，配制成各組分質(zhì)量濃度均為5.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；另取10 只2 mL容量瓶，每5 只1 組，分成2 組，每組分別加入0、20、40、200、400 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，分別以全血/尿液空白基質(zhì)配制校準(zhǔn)工作溶液，配制成各組分質(zhì)量濃度均分別為0.0、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL的血液、尿液基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品預(yù)處理

取1 mL 血樣(或尿樣)于10 mL 離心管中，以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，取上層清液至另一離心管中，渦旋振蕩的同時(shí)加入3 mL 乙腈，再以15 000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至另一10 mL塑料萃取管中，置于40 ℃氮吹儀上濃縮吹干至0.5 mL，取上清液進(jìn)樣。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 色譜儀

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3.0 mm × 150 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；進(jìn)樣體積：6 μL；流動(dòng)相：A 相為5 mmol/L 乙酸銨-0.02 %甲酸-水，B 相為乙腈，A 與B 的體積比為1∶1，流量為0.50 mL/min，梯度洗脫見表1；柱溫：40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜儀

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；含噴射流離子聚焦技術(shù)的電子噴霧離子源；霧化器壓力：276 KPa；干燥氣：空氣，溫度為280 ℃，流量為9.0 L/min；鞘氣：空氣，溫度為350 ℃，流量為11 L/min；毛細(xì)管電壓：正、負(fù)離子模式分別為4 000、3 500 V；噴嘴電壓：正、負(fù)離子模式均為500 V；掃描方式：鼠立死、安妥、毒鼠堿三種殺鼠劑為正離子掃描，其余9 種為負(fù)離子掃描。12 種鼠藥的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 12種鼠藥的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)

1.5 定量方法

以全血和尿液空白基質(zhì)配制校準(zhǔn)溶液，經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)，以色譜峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

試驗(yàn)比較了HLB 固相萃取法和液液萃取法兩種樣品處理方法。結(jié)果表明，HLB固相萃取法用時(shí)過長(zhǎng)，回收率太低，不利于對(duì)中毒樣品的應(yīng)急處理。由于中毒樣品的檢測(cè)有時(shí)效性以及靈敏度的要求，在樣品處理的過程盡量減少轉(zhuǎn)移的次數(shù)。

采用改進(jìn)后3 次轉(zhuǎn)移的方法，同時(shí)對(duì)丙酮、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶液進(jìn)行比較。對(duì)于全血樣品，采用乙腈蛋白沉淀法可獲滿意結(jié)果，鼠藥回收率均可達(dá)到70%以上。而使用乙酸乙酯鼠藥的回收率只有40%左右，丙酮回收率更低，只有20%左右。

采用一邊滴加乙腈一邊渦旋振蕩的方法可以提高乙腈提取率，避免蛋白沉淀物包裹待測(cè)物。另外對(duì)比尼龍濾膜對(duì)待測(cè)組分的吸附作用，發(fā)現(xiàn)尼龍濾膜對(duì)12種殺鼠劑有不同程度的吸附作用，尼龍濾膜對(duì)殺鼠醚、鼠立死的吸附嚴(yán)重，因此樣品不進(jìn)行濾膜過濾，而是采用取上清液直接進(jìn)樣。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

移取殺鼠劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在電噴霧正、負(fù)離子檢測(cè)方式下對(duì)質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇質(zhì)譜響應(yīng)最強(qiáng)的模式為最佳條件。經(jīng)過測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，鼠立死、安妥、毒鼠堿僅在正離子模式下離子化，其它化合物在正負(fù)兩種模式下均可離子化，但在負(fù)離子模式下響應(yīng)更高，因此選擇在ESI正離子MRM模式下監(jiān)測(cè)鼠立死、安妥、毒鼠堿，在ESI負(fù)離子MRM模式下監(jiān)測(cè)另外9種殺鼠劑。

進(jìn)一步對(duì)12 種殺鼠劑的去簇電壓、碰撞能量、駐留時(shí)間等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到12種殺鼠劑的質(zhì)譜條件見1.4。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈的兩種有機(jī)流動(dòng)相對(duì)待測(cè)組分的分離效果以及離子化效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，雖然響應(yīng)值稍低，但其色譜峰形較好。

分別比較了20、10、5、2 mmol/L 的乙酸銨-0.02%甲酸-水4 種不同濃度流動(dòng)相體系對(duì)色譜峰形及響應(yīng)值的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)選擇在Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，1.8 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)為分析柱下，采用5 mmol/L 乙酸銨-0.02%甲酸-水作為流動(dòng)相時(shí)，各目標(biāo)組分的色譜峰形均比較理想，分析靈敏度較高。

2.4 校準(zhǔn)工作曲線與檢出限、定量下限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，分別測(cè)定血液、尿液基質(zhì)系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各標(biāo)準(zhǔn)品的定量離子色譜峰面積（y）對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸處理（軟件自動(dòng)操作，選擇強(qiáng)制過原點(diǎn)），得到12種殺鼠劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)。

按照職業(yè)人群生物監(jiān)測(cè)方法推薦的檢出限和定量下限測(cè)定方法[31]，配制12 種鼠藥0.025 μg/mL 的血樣和尿樣，按規(guī)定方法分析，分別以樣品信號(hào)的3、10倍標(biāo)準(zhǔn)差(n=7)計(jì)算待測(cè)物濃度，所得濃度分別為方法檢出限、定量下限。

12 種殺鼠劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限分別見表3、表4。

表3 12種殺鼠劑的尿中線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表4 12種殺鼠劑的血中線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

由表3、表4 可知，各殺鼠劑在0.05～1.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.995以上。

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

移取空白血樣和尿樣各1 mL，再分別加入12種鼠藥標(biāo)準(zhǔn)品各0.05、0.10、0.5 μg，然后按照1.3 方法進(jìn)行處理后，各進(jìn)行6次平行測(cè)定，最后計(jì)算每種殺鼠劑的平均回收率和測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 12種殺鼠劑的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

由表5 可知，血樣和尿樣中12 種殺鼠劑的加標(biāo)回收率分別為81.2%～106.5%和80.7%～107.8%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.7%～15.4%和1.2%～10.8%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和較好的精密度，滿足方法要求。

2.6 質(zhì)控樣品測(cè)定

運(yùn)用所建方法對(duì)采購(gòu)的鼠藥質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定(牛血中溴鼠靈和溴敵隆、尿中殺鼠醚和殺鼠靈），定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差見表6。

表6 定性時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

由表6 可知，質(zhì)控樣品色譜峰與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間一致、且所選擇的特征離子均在質(zhì)控樣品質(zhì)譜圖中出現(xiàn)、對(duì)應(yīng)的豐度比與標(biāo)準(zhǔn)品的豐度比相比其偏差不超過表中規(guī)定的范圍，則可判定質(zhì)控樣品中含有相應(yīng)的滅鼠劑，定性檢出有目標(biāo)物，檢測(cè)結(jié)果與證書標(biāo)示一致。

3 結(jié)語

建立了血液和尿液樣品中12 種鼠藥的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，該法樣品前處理簡(jiǎn)便快捷，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，精密度和回收率均滿足實(shí)驗(yàn)要求，適用于疑似鼠藥中毒病人血液和尿液樣品中12種殺鼠劑的同時(shí)定性定量測(cè)定，為疑似鼠藥中毒病人的臨床救治提供技術(shù)支撐。