云南地區(qū)宮頸癌癌前病變患者HPV 56 的分子流行病學(xué)調(diào)查

周紫云 ，王瑩瑩 ，嚴(yán)志凌 ，趙凌鋒 ，楊 希 ，許金美 ，張 芍

（1）曲靖市疾病預(yù)防控制中心，云南 曲靖 655000;2）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;3）昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650118）

宮頸癌是全球女性中第四大常見(jiàn)腫瘤，主要致病因素是高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)性感染[1]。80%以上的女性在一生中經(jīng)歷過(guò)至少1 次人乳頭瘤病毒（human pappilomavirus，HPV）感染，但90%以上的HPV 感染可在2 a 內(nèi)自然清除，僅不足1%的患者可能發(fā)展成為癌前病變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），甚至引發(fā)宮頸癌（cervical cancer，CC）[2]。癌前病變一般依據(jù)宮頸上皮內(nèi)瘤變的嚴(yán)重程度劃分為CIN1、CIN2、CIN3。目前，與宮頸癌發(fā)生相關(guān)的高危型HPV 型別主要包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68 等[3]。

1989 年，L?rincz 等[4]在華盛頓特區(qū)1 名婦女的CIN 組織樣本中首次發(fā)現(xiàn)了HPV56 基因型。盡管HPV56 感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的比例在全球范圍來(lái)看相對(duì)較小，但在亞洲地區(qū)，特別是中國(guó)，HPV56 具有相對(duì)較高的檢出率。2014 年，Yang等[5]在中國(guó)西南地區(qū)74 例宮頸癌組織標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HPV56 陽(yáng)性率為1.64%（1/74）。2019 年，Zhao等[6]對(duì)華北地區(qū)HPV56 的感染率研究表明，在宮頸正常組中單一感染HPV56 型陽(yáng)性率為0.66%（61/9 256）；在癌前病變組中單一感染HPV56 型在CIN1 期的陽(yáng)性率為6.80%（7/103），在CIN2 期為0%（0/97）。以上研究數(shù)據(jù)表明，HPV56 在癌前病變組和宮頸癌組中的感染率遠(yuǎn)高于宮頸正常組，HPV56 可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

HPV 基因組分為3 個(gè)功能區(qū)，分別是長(zhǎng)控制區(qū)，早期基因區(qū)和晚期基因區(qū)[7]。長(zhǎng)控制區(qū)主要調(diào)控病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，控制病毒蛋白和感染顆粒的產(chǎn)生；早期基因區(qū)編碼產(chǎn)生E1，E2，E4，E5，E6 和E7 蛋白，其中E6 和E7 蛋白為病毒癌蛋白，在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用；晚期基因編碼產(chǎn)生在病毒顆粒自我組裝以及侵入目標(biāo)細(xì)胞時(shí)起協(xié)調(diào)和識(shí)別作用的L1 和L2 病毒衣殼蛋白[7]。研究表明[8-11]HPV 基因變異可導(dǎo)致致癌風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生改變，特別是E6 和E7。E6 和E7 基因變異可導(dǎo)致編碼氨基酸改變而使致癌能力發(fā)生改變。另外，L1 基因變異導(dǎo)致的L1 氨基酸序列變化可能會(huì)對(duì)病毒的抗原性和感染能力造成影響[12]。研究表明[13-14]，根據(jù)L1 基因的序列變異特征，HPV56 分為A 譜系和B 譜系。

本研究以云南省宮頸癌癌前病變患者為研究對(duì)象，將患者組織樣本進(jìn)行HPV 分型，選取單一感染HPV56 的樣本提取基因組，擴(kuò)增得到HPV56 E6，E7 和L1 基因，并對(duì)獲得基因序列進(jìn)行測(cè)序，以此分析云南地區(qū)HPV56 譜系分布特征及E6，E7 和L1 基因的遺傳變異數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步HPV56疫苗研發(fā)及相應(yīng)的診斷和治療提供參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 樣本采集

選取2022 年2 月至2023 年2 月昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦瘤科宮頸癌癌前病變患者作為研究對(duì)象，采集宮頸組織樣本，將組織樣本保存于組織保存液中，-80℃保存。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《臨床診療指南-婦產(chǎn)科學(xué)分冊(cè)》[15]，研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）所有患者有性生活史；（2）單一宮頸、無(wú)其它宮頸病變。研究對(duì)象排除標(biāo)準(zhǔn)為：（1）未接受過(guò)化療、放療、手術(shù)等抗腫瘤治療；（2）未合并或繼發(fā)其他惡性腫瘤。所有研究對(duì)象均為彼此之間無(wú)血緣關(guān)系并且長(zhǎng)期居住于云南地區(qū)的漢族個(gè)體，研究方案經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（KYCS2021193），所有樣本采集均征得本人知情同意。

1.2 樣本DNA 提取

取-80℃冷凍保存的宮頸組織樣本30～60 mg，于室溫融化。加入鋼珠及600 mL Buffer RLT，置于超聲破碎儀，50 HZ 破碎2 min，取出鋼珠，8 000 r/min 離心3 min。取上清置于新的離心柱，8 000 r/min 離心1 min，而后加入500 μL AW1 于8 000 r/min 離心30 s，棄上清。每個(gè)樣本中再加入500 μL AW2 后14 000 r/min 離心2 min。加入100 μL EB，室溫孵育10 min，然后8 000 r/min 離心1 min。得到的溶液即含釋放的DNA，取出備用。

1.3 HPV 檢測(cè)分型

使用基于核酸分子導(dǎo)流雜交系統(tǒng)的HPV 分型檢測(cè)試劑盒（凱普生物科技有限公司）對(duì)樣本DNA進(jìn)行HPV 分型。

1.4 HPV56 E6、E7、L1 基因擴(kuò)增測(cè)序

根據(jù)分型結(jié)果，選取檢測(cè)出單一HPV56 陽(yáng)性的患者作為研究對(duì)象，擴(kuò)增HPV56 E6、E7、L1基因。根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]設(shè)計(jì)針對(duì)HPV56 E6、E7、L1 基因的擴(kuò)增和測(cè)序引物，交由生工生物工程（上海）有限公司合成。用于設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物和測(cè)序引物的HPV56 序列為X74483.1，各基因的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物，見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體積為50 μL，反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，Tm℃退火5 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共35 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳成像驗(yàn)證后，把PCR 原液送交生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。

表1 HPV56 E6、E7、L1 基因的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物Tab.1 The amplification primers and sequencing primers of E6 E7 and L1 genes of HPV56

1.5 HPV56 E6、E7、L1 基因變異和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析

將測(cè)序所得的HPV56 E6、E7、L1 基因序列分別用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）v 7.0 軟件中的Clustal W 多重比對(duì)工具進(jìn)行比對(duì)，而后分析基因序列的變異情況。用于分析基因變異情況的參考序列下載于GenBank，登錄號(hào)為X74483.1。選用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）v 7.0 軟件中的ML 法來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)bootstrap 值為1 000 對(duì)樹(shù)的可信度進(jìn)行評(píng)估，選用模型為Kimura 2-parameter（Kimura-2 參數(shù)）。構(gòu)樹(shù)參考序列從GenBank 序列數(shù)據(jù)庫(kù)下載，參考序列的登錄號(hào)分別為：EF177176.1、EF177177.1、EF177178.1、EF177179.1、EF177180.1、EF177181.1、KU298915.1、KU298916.1、KU298917.1，KU298918.1 和KU298919.1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究HPV56 型E6、E7 和L1 基因變異發(fā)生數(shù)的錄入及基因變異發(fā)生頻率的計(jì)算等處理均采用Microsoft Excel 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 HPV56 E6、E7、L1 基因擴(kuò)增情況

本研究通過(guò)對(duì)300 例癌前病變患者組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)單一感染HPV56 的樣本有32 例，其中CIN1 期16 例，CIN2 期16 例。從32 個(gè)樣本中分別擴(kuò)增出完整HPV56 E6 序列25 條（CIN1 期14 條，CIN2 期11 條）、HPV56 E7 序列23 條（CIN1 期11 條，CIN2 期12 條）、HPV56 L1 序列28 條（CIN1 期16 條，CIN2 期12 條）。

2.2 HPV56 E6、E7、L1 基因的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析

本研究用從樣本中擴(kuò)增得到的HPV56 E6，E7 和L1 序列來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的HPV56 E6 序列中A 譜系23 例（CIN1 期14 例，CIN2 期9 例），B 譜系2 例（CIN1 期0 例，CIN2 期2 例），見(jiàn)圖1；HPV56 E7 序列中A 譜系21 例（CIN1 期11 例，CIN2 期10 例），B 譜系2例（CIN1 期0 例，CIN2 期2 例），見(jiàn)圖2；28 例HPV56 L1 序列中A 譜系26 例（CIN1 期16 例，CIN2 期10 例），B 譜系2 例（CIN1 期0 例，CIN2期2 例），見(jiàn)圖3。

圖1 HPV56 E6 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of E6 of HPV56

圖2 HPV56 E7 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of E7 of HPV56

圖3 HPV56 L1 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of L1 of HPV56

2.3 HPV56 E6、E7、L1 基因的變異分析

經(jīng)比對(duì)擴(kuò)增得到的HPV56 E6，E7 和L1 基因系列，發(fā)現(xiàn)共存在13 個(gè)遺傳變異位點(diǎn)，其中E6基因中6 個(gè)、E7 基因中4 個(gè)、L1 基因中3 個(gè)，見(jiàn)表2。E6 基因中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)核苷酸變異，分別是A141C（S14R）、T158C（S19S）、A241G（N47S）、A263C（K54N），G279A（D60N）和G437A（P112P），其中A141C（S14R）、A241G（N47S）、A263C（K54N）變異占擴(kuò)增序列的8.0%，T158C（S19S）、G279A（D60N）、G437A（P112P）變異占擴(kuò)增序列的92.0%，見(jiàn)表2。E7 基因中發(fā)現(xiàn)4 個(gè)核苷酸變異，分別為C601A（D10E）、G605A（V12I），G770C（E67Q）和G802C（Q77H），其中C601A（D10E）和G770C（E67Q）變異占擴(kuò)增序列的91.3%，G605A（V12I）變異占擴(kuò)增序列的8.7%，G802C（Q77H）變異占擴(kuò)增序列的13.0%，見(jiàn)表2。L1 基因中發(fā)現(xiàn)3 個(gè)核苷酸變異，分別為A5867G（N126D），G6454T（P321P）和A6868C（I459I），其中G6454T（P321P）發(fā)生100%變異，A5867G（N126D）和A6868C（I459I）變異占擴(kuò)增序列的96.4%，見(jiàn)表2。

表2 HPV56 E6、E7、L1 基因變異情況Tab.2 E6，E7 and L1 gene variation of HPV56

3 討論

HPV56 是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的高危型HPV 之一[16]，其感染率在1.1%～10.9%之間，尤其在亞洲地區(qū)具有相對(duì)較高檢出率[6,17-19]。因此，本研究對(duì)云南地區(qū)CIN 患者中HPV56 型E6、E7 和L1 基因進(jìn)行了測(cè)序，并基于以上3 個(gè)基因的序列數(shù)據(jù)對(duì)云南地區(qū)HPV56 譜系特征及其變異特征進(jìn)行了分析。

在本研究中，HPV56 L1 基因系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)結(jié)果顯示，92.9%的患者感染的HPV56 病毒屬于A 譜系（26/28），而僅有7.1%的患者屬于B 譜系（2/28）。2018 年，Jing 等[13]對(duì)四川地區(qū)HPV56分布特征進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，50.0%的患者感染屬于A 譜系（8/16），50.0%的患者屬于B 譜系（8/16）。該結(jié)果表明，在四川地區(qū)和云南地區(qū)流行的HPV56 型的L1 基因存在一定的差異，所以造成了基于L1 獲得的譜系分析結(jié)果存在差異。2015 年，Wu 等[20]對(duì)四川地區(qū)宮頸癌患者中HPV16 進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，四川地區(qū)HPV16 類型主要屬于歐洲譜系（病例組：86.7%），但是在云南地區(qū)HPV16 以亞洲譜系為主導(dǎo)地位（病例組：72.7%）[21]。該研究結(jié)果之間的差異也充分說(shuō)明四川和云南人群所感染的HPV 譜系是存在一定差異的。

E6 蛋白是HPV 主要的2 個(gè)致癌蛋白之一，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用。HR-HPV E6 蛋白可通過(guò)直接或間接調(diào)控PI3K/AKT/mTOR、p53 等細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵蛋白、從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[22-23]。HPV E6 蛋白含有2 個(gè)CXXC-X29-CXXC 鋅指結(jié)構(gòu)，分別位于E6 蛋白的33-69 和106-142 氨基酸序列區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)A241G（N47S），A263C（K54N）和G279A（D60N）非同義突變均位于HPV56 E6 蛋白的第1 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)，這些位點(diǎn)的變異可能會(huì)導(dǎo)致HPV56 E6 蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域折疊結(jié)構(gòu)的改變或是與E6 靶標(biāo)的結(jié)合而影響E6 蛋白的功能[23-24]。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)A141C（S14R）和A263C（K54N）變異，但2008 年，Hiller 等[25]研究發(fā)現(xiàn)攜帶A141C（S14R）和A263C（K54N）突變的HPV56 變異株的E6 蛋白與HPV56 原型的E6蛋白在促使p53 降解的功能上并無(wú)差異。因此，盡管A141C（S14R）和A263C（K54N）在云南地區(qū)CIN 患者中存在變異，但這2 個(gè)變異可能與CIN和宮頸癌的進(jìn)展無(wú)關(guān)。

E7 蛋白是HPV 另一個(gè)重要的致癌蛋白，主要是通過(guò)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)（Rb）家族結(jié)合促使Rb 家族蛋白水解而刺激細(xì)胞周期失控，進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。HPV E7 蛋白N 端一般含有2 個(gè)保守區(qū)域（CR1 和CR2），與Rb 家族蛋白結(jié)合的LXCXE 基序和酪蛋白激酶II 磷酸化位點(diǎn)位于CR2 區(qū)域內(nèi)，另外，在E7 蛋白的C 端含有1 個(gè)和E6 蛋白相似的CXXC-X29-CXXC 鋅指結(jié)構(gòu)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)4 個(gè)非同義突變中的C601A（D10E）和G605A（V12I）位于E7 蛋白的CR1 區(qū)域內(nèi)，G770C（E67Q）和G802C（Q77H）位于E7 鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域，CR2 區(qū)域的LXCXE 基序未發(fā)現(xiàn)突變，提示CR2 區(qū)域可能在E7 基因中較CR1 及鋅指結(jié)構(gòu)保守。

HPV L1 蛋白是HPV 病毒的衣殼蛋白，是HPV 病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒DNA 導(dǎo)入宿主細(xì)胞并整合進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體過(guò)程中起著重要作用。研究表明L1 蛋白可以作為人體細(xì)胞免疫反應(yīng)靶蛋白被用于HPV 疫苗的研究中[26]。有研究表明，HPV L1 基因變異而引起的氨基酸改變會(huì)影響L1 蛋白的自我組裝和免疫細(xì)胞對(duì)VLPS的識(shí)別從而導(dǎo)致免疫原性產(chǎn)生差異以及造成免疫逃逸發(fā)生[27-28]。Jing 等[13]發(fā)現(xiàn)HPV56 L1 基因中引起K116M 和N126D 氨基酸變化的變異可能具有破壞性，而本研究所發(fā)現(xiàn)的HPV56 L1 基因的3 個(gè)變異位點(diǎn)中有僅A5867G（N126D）為非同義突變，而未發(fā)現(xiàn)存在導(dǎo)致K116M 氨基酸改變的變異。

在HPV 疫苗研究中，預(yù)防性疫苗主要關(guān)注點(diǎn)在于HPV L1 的特征研究，而治療性疫苗則主要關(guān)注于HPV E6 和E7 的特征研究，為此，本研究為了解HPV56 的變異特征和疫苗研發(fā)提供了參考數(shù)據(jù)。本研究的局限性主要在于由于HPV56 在人群中感染比例較小，故納入本研究的樣本數(shù)量有限，從而導(dǎo)致在分析基因變異及HPV56 譜系分布特征代表性可能不足。