山藥皮中黃酮、多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

杭書揚，楊林霄，郭建行，錢格格，劉延奇，2，3*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001；3.河南省冷鏈食品質(zhì)量安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

山藥屬薯蕷科植物，是我國傳統(tǒng)的功能性食材[1-2]，山藥含有多種生物活性成分，其中必需氨基酸、多糖、黃酮類化合物和酚酸是主要成分[3]，它們具有許多潛在功效，廣泛應(yīng)用于治療糖尿病、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)[4-5]等方面。山藥既可以作為家常菜食用，也可剝皮、切片、曬干或風(fēng)干制作中草藥[6]，在處理過程中，產(chǎn)生可達20%的廢棄物——山藥皮[7]。山藥皮中含有的生物活性化合物比可食用部分更多[8]，據(jù)研究，山藥皮提取物的尿囊素、黃酮和總酚含量均高于粉質(zhì)部位提取物，山藥皮提取液中黃酮類化合物含量是粉質(zhì)部位提取液的1.72～2.23 倍[9]。

黃酮、多酚有著抗氧化、抗菌和抗炎等豐富的生物活性，這些性質(zhì)對改善人體健康水平有著積極的作用，因此黃酮、多酚類物質(zhì)一直是食品領(lǐng)域研究的熱點。最近的研究表明，每天攝入超過1 g 的多酚可有效降低慢性疾病的患病率[10]。山藥皮中有著豐富的黃酮、多酚，已有報道通過熱回流法提取鐵棍山藥皮中黃酮類化合物，但提取量僅為0.338 2 mg/g[11]，因此尋找一種高效的提取方法對于開發(fā)山藥皮的營養(yǎng)功能有重要意義。

提取方式作為從山藥皮中獲取酚類物質(zhì)的關(guān)鍵步驟，目前主要有溶劑萃取、機械萃取、超臨界萃取、微波萃取、熱回流等方法。但通過這些方法回收酚類物質(zhì)具有局限性，例如在溶劑萃取中使用額外的溶劑、機械萃取的得率低、超臨界萃取的成本高以及微波輔助萃取中需要水相等[12]。與這些方法相比，超聲輔助提取具有時間和能量需求少、低溫提取和保留提取物質(zhì)量等優(yōu)點。超聲輔助提取是用高強度聲波從山藥皮中提取黃酮、多酚，利用超聲波輻射壓強產(chǎn)生的強烈空化效應(yīng)、機械振動、擾動效應(yīng)等多級效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標成分進入溶劑，促進提取的進行[13]，與超聲輔助提取相關(guān)的變量有頻率、功率、溫度、時間、溶劑類型、液固比，需要精確控制以實現(xiàn)最佳提取。

為研究山藥皮黃酮、多酚的高效提取工藝，本試驗以鐵棍山藥皮為原料，以黃酮、多酚得率為考察指標，選擇乙醇濃度、液固比、超聲時間作為考察因素，利用正交法優(yōu)化提取條件，并對最優(yōu)條件提取的山藥皮粗提物進行抗氧化性試驗，為進一步研究山藥皮的營養(yǎng)功能提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

鐵棍山藥：市售；蘆丁標準品、沒食子酸標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、福林酚：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、NaNO2、Na2CO3、Al（NO3）3、NaOH、復(fù)合磷酸鹽、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、石油醚（均為分析純）：天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 儀器

紫外分光光度計（UV-1800）：上海美普達公司；分析天平（BSA223S）：德國賽多利斯公司；數(shù)控超聲清洗機（SB-4200DT）：寧波新芝生物科技有限公司；循環(huán)式多用真空泵（SHZ-D）：河南金友成儀器設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（YRE-52AA）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9123A）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 山藥皮粗提物提取流程

新鮮山藥洗凈、去皮（皮厚約為0.2 mm）、烘干、磨粉過80 目篩得山藥皮粉末，將山藥皮粉末與乙醇溶液按一定比例置于錐形瓶中進行超聲提取，提取完成后將溶液離心取上清液，減壓濃縮到一定體積后用石油醚進行萃取脫脂處理，旋蒸除去殘留的石油醚后，冷凍干燥得山藥皮粗提物。

2.2 線性關(guān)系考察

2.2.1 多酚含量的測定

參考文獻[14]方法并稍作修改，分別移取0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 沒食子酸標準溶液（0.1 mg/mL）于10 mL 比色管中，加入福林酚0.4 mL 搖勻，再加入0.8 mL Na2CO3（質(zhì)量分數(shù)為15%），加蒸餾水定容到10 mL 混勻后避光反應(yīng)1 h，于760 nm 處測定吸光度。以吸光度（A）對沒食子酸的質(zhì)量濃度（X）進行回歸，得方程Y=0.111 7X+0.116 3，R2=0.996 7。

2.2.2 黃酮含量的測定

參考文獻[15]方法并稍作修改，分別吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 蘆丁標準溶液（0.1 mg/mL）于10 mL棕色比色管；加入0.3 mL NaNO2（質(zhì)量分數(shù)為5%）避光反應(yīng)6 min；加入0.3 mL Al（NO3）3（質(zhì)量分數(shù)為10%）避光反應(yīng)6 min；加入4 mL NaOH（質(zhì)量分數(shù)為4%），去加蒸餾水定容到10 mL 后靜置15 min，于510 nm 處測定吸光度。以吸光度（A）對蘆丁濃度（X）進行回歸，得方程Y=0.011 4X+0.059 7，R2=0.998 3。

2.3 黃酮和多酚得率測定

黃酮得率測定：根據(jù)蘆丁標曲方法進行吸光度的檢測，黃酮得率計算公式如下。

式中：X 為黃酮得率，%；C1為黃酮質(zhì)量濃度，g/mL；V1為提取液的定容體積，mL；m 為山藥皮質(zhì)量，g；N1為稀釋倍數(shù)。

多酚得率測定：根據(jù)沒食子酸標曲方法進行吸光度的檢測，多酚得率計算公式如下。

式中：Y 為多酚得率，%；C2為多酚質(zhì)量濃度，g/mL；V2為提取液的定容體積，mL；m 為山藥皮質(zhì)量，g；N2為稀釋倍數(shù)。

2.4 單因素試驗

準確稱取1.0g 山藥皮粉末，采用超聲輔助提取黃酮、多酚，考察乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）和液固比[30∶10、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1（mL/g）]對山藥皮黃酮、多酚得率的影響。

2.5 正交試驗設(shè)計

分別以超聲時間（A）、乙醇濃度（B）及液固比（C）作為考察因素，以山藥皮中黃酮、多酚的得率為考察指標，優(yōu)化提取工藝。正交試驗因素水平因素見表1。

表1 因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of experimental factors

2.6 抗氧化能力測定

2.6.1 DPPH 自由基清除率測定

參考文獻[16]的方法并有所修改，2 mL 山藥皮粗提物溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均勻，37 ℃恒溫避光反應(yīng)30 min，以VC作陽性對照，于517 nm 波長處測定吸光度，DPPH 自由基清除率計算公式如下。

式中：M 為DPPH 自由基清除率，%；A0為去離子水代替樣品測得的吸光度；A1為樣品溶液測得的吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH 測得的吸光度。

2.6.2 還原力測定

參考文獻[17]的方法測定還原力。將山藥皮粗提物配成一系列濃度梯度溶液，取0.5 mL 樣品溶液，分別加入0.2 mol/L PBS 溶液0.5 mL、1 g/100 mL 鐵氰化鉀溶液0.5 mL，50 ℃反應(yīng)20 min 后加10 g/100 mL的三氯乙酸溶液0.5 mL，4 500 r/min 離心10 min 后取1 mL 上清液，加入0.1 g/100 mL 的氯化鐵溶液0.2 mL，混勻后靜置10 min，以VC作為陽性對照，于700 nm 波長處測定吸光度，并以該吸光度表征還原力。

2.6.3 羥自由基清除率測定

參考文獻[18]并稍作修改，在試管中混合1 mL 不同濃度的粗提物溶液、1 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L）和1 mL 過氧化氫（6 mmol/L）。將混合物在室溫（25 ℃）下儲存10 min，并添加1 mL 水楊酸。輕輕搖動并保持30 min 后，在510 nm 處測定混合物的吸光度。羥自由基清除率計算公式如下。

式中：N 為羥自由基清除率，%；A0為對照組（無樣品）的吸光度；A1為試驗組（無水）的吸光度；A2為空白組（不含水楊酸）的吸光度。

2.6.4 總抗氧化能力測定

參照文獻[19]中總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的測定方法，根據(jù)試劑盒的T-AOC比色法進行測定。以Fe2+濃度表示總抗氧化能力，以系列亞鐵離子濃度（mmol/100 g）為橫坐標，相應(yīng)吸光度為縱坐標，作標準曲線，根據(jù)提取液的吸光度在標準曲線上相應(yīng)的Fe2+濃度，即可得出該樣品的抗氧化能力。

2.7 數(shù)據(jù)處理

各試驗重復(fù)3 次，采用Excel 整理數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 22.0 軟件程序Duncan 檢驗法進行顯著性分析（P＜0.05），采用Origin 2021 軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 超聲時間對黃酮、多酚得率的影響

超聲時間對黃酮、多酚得率的影響見圖1。

圖1 超聲時間對黃酮、多酚得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids and polyphenols

由圖1 可知，在10～20 min 內(nèi)，黃酮、多酚得率與超聲時間呈正相關(guān)關(guān)系，在20～40 min 時，隨著超聲的延長，山藥皮中黃酮、多酚得率逐漸減小，40～50 min 得率有所增加但低于20 min 的得率。這是因為在最初階段超聲處理時間延長時，超聲的空化效應(yīng)促進了植物組織基質(zhì)的溶脹、水合作用、破碎和孔隙形成，從而提高了山藥皮黃酮、多酚的得率[20]，因此選擇20 min 進行后續(xù)試驗。

3.1.2 乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響

乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對黃酮、多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids and polyphenols

由圖2 可知，乙醇濃度分別為70%和60%時，山藥皮中黃酮、多酚提取得率最佳，乙醇濃度是影響產(chǎn)量的最重要因素之一，乙醇濃度的增加會增加酚類化合物的產(chǎn)率，直至達到最大乙醇濃度，然后使產(chǎn)率下降，這種趨勢與Garcia-Castello 等[21]從柚子殘渣中提取黃酮所得結(jié)果相符。這種變化趨勢可能是由于溶劑的介電常數(shù)隨著乙醇濃度的增加而降低，從而導(dǎo)致酚類化合物的溶解度和擴散率增加，但是接近100%的乙醇濃度，即高純度乙醇溶劑會導(dǎo)致山藥皮中組織脫水以及蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致產(chǎn)量降低。對于工業(yè)生產(chǎn)，溶劑濃度低可有效降低生產(chǎn)成本，此外山藥皮黃酮的含量高于多酚，所以選擇70%作為最優(yōu)提取濃度。

3.1.3 液固比對黃酮、多酚得率的影響

液固比對黃酮、多酚得率的影響見圖3。

圖3 液固比對黃酮、多酚得率的影響Fig.3 Influence of liquid-solid ratio on the yield of total flavonoids and polyphenols

由圖3 可知，液固比30∶1～70∶1（mL/g）時，山藥皮中黃酮、多酚得率隨液固比的增加而增加，當(dāng)液固比大于50∶1（mL/g）時，黃酮、多酚物質(zhì)得率增速減慢。這可能是因為在低比例液固比下，山藥皮溶液的黏度較高，由于必須克服高黏度溶液中更強的內(nèi)聚力，因此空化效應(yīng)更困難。初始階段，隨著液固比增加，萃取介質(zhì)的黏度和濃度降低，導(dǎo)致更大的空化效應(yīng)，溶質(zhì)的較高濃度差增加了溶質(zhì)在溶劑中的擴散和溶解，從而增強了萃取過程，在高液固比下，施加在副產(chǎn)品基質(zhì)上的超聲強度更高，導(dǎo)致更多的碎裂、侵蝕和孔隙形成效應(yīng)，從而提高產(chǎn)量。當(dāng)液固比增加到一定程度時候溶劑與溶質(zhì)達到飽和，此后繼續(xù)增加乙醇添加量，也很難增加得率[22]。所以，試驗中選擇液固比50∶1（mL/g）進行后續(xù)試驗。

3.2 正交設(shè)計及結(jié)果

表2 和表3 分別為黃酮、多酚得率正交試驗結(jié)果。表4 和表5 分別為黃酮、多酚得率方差分析結(jié)果。

表2 黃酮得率正交試驗結(jié)果Table 2 Flavonoids yield of orthogonal test

表3 多酚得率正交試驗結(jié)果Table 3 Yield of polyphenols of orthogonal test

表4 黃酮得率方差分析Table 4 Variance analysis of flavonoids yield

表5 多酚得率方差分析Table 5 Variance analysis of polyphenols yield

由表2 和表4 可知：山藥皮中黃酮得率與超聲時間、乙醇濃度、液固比顯著相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)程度依次為B＞A＞C，即乙醇濃度＞超聲時間＞液固比，優(yōu)化的最佳提取條件為A3B1C3[提取時間30 min，乙醇濃度60%，液固比60∶1（mL/g）]。由表3 和表5 可知：山藥皮多酚得率與超聲處理時間和乙醇濃度顯著相關(guān)（P＜0.05），影響次序為B＞A＞C，即乙醇濃度＞超聲時間＞液固比，優(yōu)化的最佳提取條件為A3B1C3[提取時間30 min，乙醇濃度60%，液固比60∶1（mL/g）]。此結(jié)果與正交試驗中最佳組合結(jié)果一致，此時黃酮得率為0.929%，多酚得率為0.519%。

3.3 抗氧化試驗結(jié)果

3.3.1 DPPH 自由基清除率試驗結(jié)果

VC和粗提物的DPPH 自由基清除率見圖4。

圖4 VC 和粗提物的DPPH 自由基清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rate of VC and crude extract

當(dāng)DPPH 自由基還原為1，1-二苯基-2-三硝基苯肼時，顏色由紫色變?yōu)辄S色，導(dǎo)致與樣品提供氫/電子能力相關(guān)的吸收平衡的降低[23]。由圖4 可知，粗提物對DPPH 自由基清除率與樣品濃度呈現(xiàn)正相關(guān)的對應(yīng)關(guān)系，在濃度為1.0 mg/mL 時達到最大值79.96%，其IC50值為0.158 mg/mL，大于VC的IC50值0.016 mg/mL，說明粗提物的DPPH 自由基清除率弱于VC。

3.3.2 還原力試驗結(jié)果

VC和粗提物的還原力見圖5。

圖5 VC 和粗提物的還原力Fig.5 Reducing power of VC and crude extract

抗氧化活性可通過使反應(yīng)體系中Fe3+還原成Fe2+體現(xiàn)，在700 nm 處吸光度大小變化與還原能力的高低呈正相關(guān)[24]。由圖5 可看出，粗提物的還原力隨著濃度的增大顯著增強，但與陽性對照VC相比，各濃度下還原力均低于VC，濃度為1 mg/mL 的粗提物的還原力為0.70，而濃度為1 mg/mL 的VC的還原力可達到2.53。

3.3.3 羥自由基清除率試驗結(jié)果

VC和粗提物的羥自由基清除率見圖6。

圖6 VC 和粗提物的羥自由基清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of VC and crude extract

由圖6 可以看出，粗提物對羥自由基有良好的清除效果。濃度范圍為0.2～0.6 mg/mL 時，粗提物羥自由基清除率顯著高于同等濃度下VC的羥自由基清除率，粗提物IC50值為0.083 mg/mL，小于VC的IC50值0.302 mg/mL，說明粗提物相比于VC有著更好的羥自由基清除率。

3.3.4 總抗氧化能力試驗結(jié)果

VC和粗提物的總抗氧化能力見圖7。

圖7 VC 和粗提物的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of VC and crude extract

在酸性條件下，樣品中的抗氧化物質(zhì)還原Fe3+-TPTZ 產(chǎn)生Fe2+-TPTZ，呈現(xiàn)出明顯的藍色，于593 nm 處有最大的光吸收，在Fe3+-TPTZ 過量的情況下，測定藍色物質(zhì)的生成量，即可獲得待測樣品的總抗氧化能力。由圖7 可看出，粗提物的總抗氧化能力在0.2～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)總抗氧化能力逐步上升，在1.0 mg/mL 時達到峰值為0.68 mmol/100 g，這與其還原力的測定結(jié)果相對應(yīng)。但粗提物抗氧化能力不如VC，陽性對照VC在濃度為0.6 mg/mL 時達到峰值為2.27 mmol/100 g。

4 結(jié)論

通過對山藥皮中黃酮、多酚提取工藝的優(yōu)化，以及山藥皮粗提物抗氧化活性測定試驗得出：在提取時間30 min、乙醇濃度60%、液固比60∶1（mL/g）時，山藥皮中黃酮、多酚得率最高，分別為0.929%和0.519%；在最優(yōu)工藝下提取的乙醇粗提物的抗氧化性試驗結(jié)果表明，粗提物具有良好的DPPH 自由基清除作用（IC50值為0.158 mg/mL）和羥自由基清除作用（IC50值為0.083 mg/mL），具有一定的還原力和總抗氧化能力。因此，超聲輔助乙醇提取山藥皮中黃酮和多酚是一種高效、可行的方法，同時，山藥皮粗提物具有良好的抗氧化活性，為進一步探究山藥皮中的生物活性物質(zhì)提供參考方法。