抗菌肽復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)生物胺的控制及品質(zhì)的影響

韓璐，謝超*，李娜，周華

（1.浙江海洋大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316000；2.舟山市福瑞達(dá)食品有限公司，浙江 舟山 316000）

生物胺（biogenic amine，BA）是一類具有生物活性且含有氨基的有機(jī)化合物的總稱[1-2]，廣泛存在于蛋白質(zhì)含量較高的水產(chǎn)食品中[3]。在水產(chǎn)品體內(nèi)微生物中酶的作用下，水產(chǎn)品會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)，在此過(guò)程中生成大量生物胺，人體攝入過(guò)量生物胺易引發(fā)中毒。在水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)過(guò)程中尸胺、腐胺、組胺和酪胺為主要生成的4 種生物胺[4]，因此，本文選取尸胺、腐胺、組胺和酪胺作為評(píng)價(jià)抗菌肽對(duì)生物胺控制的指標(biāo)，通過(guò)觀察4 種生物胺含量的變化，分析生物胺的生成和水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的程度。

秘魯魷魚(yú)（Dosidicus gigas）是莖柔魚(yú)的俗稱，生長(zhǎng)速度快[5]、體型較大、顏色偏白、肉質(zhì)細(xì)膩、營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的美味食品，且價(jià)格低廉，適合作為食品加工的原料。秘魯魷魚(yú)含有豐富的氨基酸和蛋白質(zhì)[6-7]，極易在貯藏和運(yùn)輸過(guò)程中受微生物的影響產(chǎn)生大量生物胺，從而導(dǎo)致生物胺中毒。生物胺的前體物質(zhì)一般是氨基酸，生物胺主要是由游離的氨基酸經(jīng)微生物的脫羧作用或經(jīng)氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生[8]。組胺是由組氨酸脫羧酶對(duì)組氨酸脫羧作用后產(chǎn)生的一種生物胺，在水產(chǎn)品中毒性最強(qiáng)，因此可選取組胺為評(píng)價(jià)指標(biāo)[9-10]。抗菌肽是一種小分子多肽，在動(dòng)物的非特異性免疫中起著重要的免疫抗菌作用[11-14]，且在水產(chǎn)品中大多具有免疫、廣譜抗菌作用[15]，可用作真菌、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等的抑制劑[16]。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)秘魯魷魚(yú)的研究主要集中在蛋白質(zhì)氧化程度和抗氧化肽方面[17-20]，對(duì)其加工過(guò)程的產(chǎn)胺菌、生物胺的生成以及抗菌肽的研究較少[21]，關(guān)于抑制秘魯魷魚(yú)體內(nèi)生物胺的生成和對(duì)魷魚(yú)的品質(zhì)控制的研究鮮有報(bào)道。

因此本文選取秘魯魷魚(yú)為研究對(duì)象，進(jìn)行海蟹源抗菌肽[22]、牡蠣源抗菌肽和帶魚(yú)源抗菌肽作為單一生物胺抑制劑的單因素試驗(yàn)并調(diào)配復(fù)合保鮮抑制劑，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)得到其最優(yōu)濃度比。驗(yàn)證該復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)以組胺為代表的生物胺的影響，評(píng)價(jià)該復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)品質(zhì)控制的能力，以期為秘魯魷魚(yú)在貯藏加工中安全質(zhì)量的監(jiān)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚(yú)：舟山市福瑞達(dá)食品有限公司，在無(wú)菌條件下，將魚(yú)切開(kāi)，依次去內(nèi)臟團(tuán)、去頭、去皮、洗凈、瀝盡水分備用。腐胺二鹽酸鹽、尸胺、組胺二鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99.0%）：德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司；海蟹源抗菌肽（crab antibacterial peptide，CAP）、牡蠣源抗菌肽（oyster antibacterial peptide，OAP）、帶魚(yú)源抗菌肽（hairtail antibacterial peptide，HAP）：舟山市常青海洋食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA2004）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；冷柜（BC/BD-829HN）：青島海爾股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)（BR4i）：法國(guó)Jouan 公司；高速均質(zhì)器（T18 生物胺ic 型）：德國(guó)IKA 公司；全自動(dòng)凱氏定氮儀（HGK-57）：上海赫冠儀器有限公司；高速組織搗碎機(jī)（DS-1 型）：上海標(biāo)本模型廠；超純水系統(tǒng)（Milli-QELIX51 型）：美國(guó)Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

考察3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和HAP）對(duì)秘魯魷魚(yú)中4 種生物胺含量的影響。3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽的濃度設(shè)定均為1%、2%、3%，每個(gè)水平設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽溶液的配制

試驗(yàn)選取3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽（OAP、CAP 和HAP）作為生物胺抑制劑，以秘魯魷魚(yú)為研究對(duì)象，根據(jù)倪佳丹等[23]、黃明焜等[24]的方法配制3 種生物胺抑制劑溶液，稍作修改，探究3 種生物胺抑制劑溶液對(duì)水產(chǎn)品生物胺的抑制效果。分別稱取1、2、3 g 的OAP、CAP和HAP 并將9 組抑制劑加入超純水定容至100 mL，混勻后即得到濃度為1%、2%、3%的3 種溶液。將以上配制好的溶液，置于4 ℃條件下備用。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，正交試驗(yàn)以秘魯魷魚(yú)為研究對(duì)象，選用3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽為生物胺抑制劑，以3 種抗菌肽抑制劑濃度為自變量，魚(yú)肉樣品在4 ℃下貯藏6 d 后對(duì)組胺的抑制率為響應(yīng)值，評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物胺的抑制作用，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 組胺抑制率的計(jì)算

根據(jù)測(cè)定出的組胺含量，計(jì)算組胺抑制率，評(píng)價(jià)復(fù)合保鮮劑對(duì)組胺的抑制作用，其中抑制率（Y，%）按下式計(jì)算。

式中：X對(duì)照為對(duì)照組組胺含量，mg/kg；X試驗(yàn)為試驗(yàn)組組胺含量，mg/kg。

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

將試驗(yàn)組（即200 g 樣品+10 mL 復(fù)合保鮮抑制劑，用干凈玻璃棒充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍┑聂~(yú)肉漿液和對(duì)照組（200 g 樣品+10 mL 超純水）的魚(yú)肉漿液，分裝后置于4 ℃條件下貯藏，測(cè)定各組樣品的組胺含量。

1.3.6 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVBN）值的測(cè)定

利用半微量定氮法測(cè)定TVB-N 值。取10 g 秘魯魷魚(yú)肉剪碎，移至消化管，加入1.0 g 氧化酶，加少許蒸餾水搖勻，采用凱氏定氮儀進(jìn)行TVB-N 值的測(cè)定。

1.3.7 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[25]中的方法，采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)，結(jié)果以lg（CFU/g）表示。

1.3.8 菌落總數(shù)抑制率的計(jì)算

根據(jù)測(cè)定出的菌落總數(shù)，計(jì)算菌落總數(shù)抑制率，評(píng)價(jià)復(fù)合保鮮劑對(duì)菌落總數(shù)的抑制作用，其中抑制率（A，%）按下式計(jì)算。

式中：B對(duì)照為對(duì)照組菌落總數(shù)，lg（CFU/g）；B試驗(yàn)為試驗(yàn)組菌落總數(shù)，lg（CFU/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2013 與SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌肽對(duì)秘魯魷魚(yú)體內(nèi)多種生物胺的影響

2.1.1 牡蠣源抗菌肽對(duì)生物胺的影響

牡蠣源抗菌肽對(duì)生物胺的影響見(jiàn)圖1。

圖1 牡蠣源抗菌肽對(duì)4 種生物胺含量的影響Fig.1 Effects of oyster antimicrobial peptides on four biogenic amines content

由圖1 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與3 組試驗(yàn)組的魚(yú)肉中4 種生物胺含量均呈上升趨勢(shì)。經(jīng)OAP 處理后的魚(yú)肉中4 種生物胺含量整體上均低于對(duì)照組，且2%OAP 作用下的魚(yú)肉中4 種生物胺含量均低于1%和3%OAP 作用下的含量，由此推斷2%OAP 抑制效果最佳，可能是由于3%OAP 對(duì)魚(yú)肉的結(jié)構(gòu)造成了破壞，導(dǎo)致了OAP 濃度為3%時(shí)比濃度為2%時(shí)更容易產(chǎn)生生物胺。

2.1.2 海蟹源抗菌肽對(duì)生物胺的影響

海蟹源抗菌肽對(duì)生物胺的影響見(jiàn)圖2。

圖2 海蟹源抗菌肽對(duì)4 種生物胺含量的影響Fig.2 Effects of crab antimicrobial peptides on four biogenic amines content

由圖2 可知，在0～2 d 內(nèi)4 種生物胺含量變化較小，可能是由于初期樣品中的微生物基數(shù)較小且游離氨基酸較少，從而產(chǎn)生的生物胺含量較低。經(jīng)3%CAP處理后的秘魯魷魚(yú)肉中4 種生物胺含量最低，由此推斷，3%CAP 的抑制作用更強(qiáng)。在整個(gè)貯藏期間對(duì)照組的4 種生物胺含量均高于試驗(yàn)組，是由于抗菌肽具有免疫、廣譜抗菌作用，可以有效阻止微生物中酶的作用，從而抑制秘魯魷魚(yú)肉中生物胺的生成。因此，再次證實(shí)CAP 可有效抑制生物胺的生成。

2.1.3 帶魚(yú)源抗菌肽對(duì)生物胺的影響

帶魚(yú)源抗菌肽對(duì)生物胺的影響見(jiàn)圖3。

圖3 帶魚(yú)源抗菌肽對(duì)4 種生物胺含量的影響Fig.3 Effects of hairtail antimicrobial peptides on four biogenic amines content

由圖3 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與3 組試驗(yàn)組的魚(yú)肉中4 種生物胺含量均呈上升趨勢(shì)，且在第2 天后試驗(yàn)組的4 種生物胺含量均低于對(duì)照組，表明HAP 對(duì)生物胺的生成起到了有效的抑制作用。第2天后3 種濃度的HAP 處理后的秘魯魷魚(yú)肉中4 種生物胺含量接近，推測(cè)3 種濃度的HAP 對(duì)4 種生物胺的抑制效果相似。

2.2 復(fù)配保鮮抑制劑正交優(yōu)化試驗(yàn)

在前期單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽對(duì)秘魯魷魚(yú)肉中生物胺的綜合抑制作用。選用上述3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽調(diào)配復(fù)合保鮮抑制劑，按其添加劑量不同將其分為9 組復(fù)合保鮮抑制劑，對(duì)牡蠣源抗菌肽、海蟹源抗菌肽及帶魚(yú)源抗菌肽的添加水平設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，通過(guò)正交優(yōu)化試驗(yàn)得出在4 ℃條件下貯藏6 d 后，各水平的樣品中組胺含量和組胺抑制率[對(duì)照組組胺含量為（57.87±1.89）mg/kg]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal test

由表2 可知，在應(yīng)用復(fù)合保鮮抑制劑后第6 組的組胺含量最低，且對(duì)組胺抑制率可達(dá)74.40%，因此第6 組對(duì)組胺抑制效果最優(yōu)。結(jié)合R 值的大小對(duì)比可知，牡蠣源抗菌肽是最優(yōu)因素，其次是海蟹源抗菌肽和帶魚(yú)源抗菌肽。結(jié)合各因素的最佳水平可知，A 為2%、B為3%、C 為1%時(shí)最優(yōu)。因此再次證實(shí)第6 組復(fù)合保鮮抑制劑為最優(yōu)組合，即牡蠣源抗菌肽、海蟹類抗菌肽和帶魚(yú)源抗菌肽的濃度分別為2%、3%、1%，由此得出該試驗(yàn)配制的復(fù)合保鮮抑制劑的最佳濃度比為2∶3∶1。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的分析，優(yōu)化濃度比后制得復(fù)合保鮮抑制劑。樣品貯藏過(guò)程中復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)組胺的抑制率見(jiàn)表3。

表3 復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)組胺含量變化的影響Table 3 Effects of composite preservatives on histamine content

由表3 可知，在貯藏第6 天時(shí)，復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)肉樣品的組胺抑制率可以達(dá)到74.39%。但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合保鮮劑對(duì)組胺的抑制效果有所下降，貯藏第10 天時(shí)，抑制率下降到57.36%。由此推斷，雖然隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)復(fù)合保鮮劑對(duì)組胺的抑制率有所下降，但對(duì)組胺仍有較強(qiáng)的抑制作用。

2.4 復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中品質(zhì)指標(biāo)變化的影響

2.4.1 復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中生物胺含量變化的影響

復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中生物胺含量變化的影響見(jiàn)圖4。

圖4 秘魯魷魚(yú)的生物胺含量變化Fig.4 Changes in biogenic amine content of Dosidicus gigas

由圖4 可知，兩組樣品在0～4 d 時(shí)3 種生物胺含量變化較小，可能是由于初期樣品中的微生物基數(shù)較小且游離氨基酸較少，使得產(chǎn)生的生物胺含量較低。經(jīng)復(fù)合保鮮抑制劑處理后，試驗(yàn)組的3 種生物胺含量均低于對(duì)照組，可能是因?yàn)殡S著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，微生物逐漸增多，且游離的氨基酸在脫羧酶的作用下生成生物胺。腐胺由鳥(niǎo)氨酸脫羧酶作用產(chǎn)生，因此推測(cè)具有鳥(niǎo)氨酸脫羧酶的微生物繁殖較快，試驗(yàn)組在抑制劑處理后阻礙了微生物生長(zhǎng)，極大程度抑制了腐胺的產(chǎn)生。綜上，復(fù)合保鮮抑制劑處理后的樣品抑制了3 種生物胺的生成，從而延緩了魚(yú)體的腐敗時(shí)間，降低了魚(yú)體的腐敗程度，有利于秘魯魷魚(yú)的品質(zhì)控制。

2.4.2 復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中TVBN 值變化的影響

復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中TVB-N值變化的影響見(jiàn)圖5。

圖5 秘魯魷魚(yú)TVB-N 值的變化Fig.5 Changes in total volatile basic nitrogen of Dosidicus gigas

由圖5 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，TVB-N 值逐漸升高，是由于魚(yú)的脂肪等物質(zhì)不斷氧化，在微生物的作用下，產(chǎn)生堿性物質(zhì)。TVB-N 值升高意味著魚(yú)體在微生物的作用下正處于腐敗變質(zhì)過(guò)程。經(jīng)復(fù)合保鮮劑處理后的試驗(yàn)組，由于其微生物的繁殖受到限制，產(chǎn)生的堿性代謝產(chǎn)物也相對(duì)較少，因此TVB-N 值較低[26-27]。結(jié)果表明，在貯藏第10 天時(shí)試驗(yàn)組TVB-N 值為17.87 mg/100 g，僅為對(duì)照組的47.85%，證明該復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)樣品中TVB-N 值產(chǎn)生了明顯的抑制作用，有利于秘魯魷魚(yú)的品質(zhì)控制。

2.4.3 復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化的影響

復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化的影響見(jiàn)圖6。

圖6 秘魯魷魚(yú)的菌落總數(shù)變化Fig.6 Changes in the total number of colonies of Dosidicus gigas

由圖6 可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組與試驗(yàn)組的菌落總數(shù)均呈上升趨勢(shì)，且試驗(yàn)組的菌落總數(shù)均低于對(duì)照組，由此可見(jiàn)復(fù)合保鮮抑制劑具有一定的抑菌作用。貯藏第10 天時(shí)，復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)菌落總數(shù)抑制率達(dá)到了33.02%，有很好的抑菌效果。對(duì)照組與試驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示試驗(yàn)組的微生物數(shù)量增加更緩慢。因此，再次證實(shí)復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)微生物的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[28-29]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以秘魯魷魚(yú)為試驗(yàn)對(duì)象，以牡蠣源抗菌肽、海蟹源抗菌肽和帶魚(yú)源抗菌肽作為單一生物胺抑制劑，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并將3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽配制成復(fù)合保鮮抑制劑進(jìn)行三因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)，優(yōu)化了復(fù)合保鮮抑制劑的最佳濃度比并分析其對(duì)組胺的抑制效果，通過(guò)觀察TVB-N 值、菌落總數(shù)及多種生物胺含量的變化，評(píng)價(jià)貯藏期間該復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)魷魚(yú)品質(zhì)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，3 種水產(chǎn)蛋白抗菌肽均能夠有效減緩魷魚(yú)體內(nèi)生物胺的形成，對(duì)生物胺有明顯的抑制作用；正交試驗(yàn)優(yōu)化了復(fù)合保鮮抑制劑的最佳濃度比為2∶3∶1；驗(yàn)證試驗(yàn)表明到貯藏第6 天時(shí)對(duì)組胺的抑制率為74.39%，第10天時(shí)下降到57.36%，雖然隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)組胺的抑制率有所下降，但是復(fù)合保鮮劑對(duì)組胺仍有較強(qiáng)的抑制作用。試驗(yàn)組的樣品在貯藏過(guò)程中TVB-N 值顯著低于對(duì)照組，且在貯藏第10 天時(shí)試驗(yàn)組TVB-N 值為17.87 mg/100 g，僅為對(duì)照組的47.85%，表明試驗(yàn)組對(duì)TVB-N 值的升高產(chǎn)生了明顯的抑制作用，說(shuō)明該復(fù)合保鮮抑制劑有利于延緩魷魚(yú)品質(zhì)的劣變；貯藏第10 天時(shí)復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)菌落總數(shù)的抑制率達(dá)到了33.02%。研究結(jié)果表明，該復(fù)合保鮮抑制劑不僅有效抑制了生物胺的生成，還有利于魷魚(yú)品質(zhì)的控制。本試驗(yàn)通過(guò)抗菌肽復(fù)合保鮮抑制劑對(duì)秘魯魷魚(yú)生物胺的控制及品質(zhì)的影響進(jìn)行初步分析，可為秘魯魷魚(yú)貯藏期內(nèi)的保鮮提供基礎(chǔ)的理論依據(jù)。