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    中華草龜眼部病原細菌的分離、鑒定及藥敏試驗

    2023-10-23 09:31:18張曉瑩王家軍朱春艷劉張淮張熒熒張洮
    水產(chǎn)養(yǎng)殖 2023年10期
    關(guān)鍵詞:吲哚伊麗莎白環(huán)素

    張曉瑩,王家軍,朱春艷,劉張淮,張熒熒,張洮

    (寶應(yīng)縣農(nóng)業(yè)技術(shù)綜合服務(wù)中心,江蘇 寶應(yīng) 225800)

    中華草龜(Chinemys reevesii),又名烏龜、金龜、泥龜、長壽龜,有延年益壽、吉祥的寓意。屬于爬行綱(Reptilia),龜鱉目(Testudine),龜科(Emydidae),是我國分布最廣、數(shù)量最多的一種龜,因其具有生長速度快、抗病能力強和具有觀賞性等特點,養(yǎng)殖前景十分廣闊。但隨著中華草龜養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展,各類疾病也日益增多。目前已有研究從患病中華草龜,分離出維氏氣單胞菌(Aeromonas Veronii)[1]、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[2]、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)[3]、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)[4]、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)[5]等病原菌。產(chǎn)吲哚金黃桿菌(Chryseobacterium indologenes)屬于金黃桿菌屬(Chryseobacterium),是一類革蘭陰性菌,為條件致病菌,是一種高度耐藥的細菌,目前已從患腐皮病的中華鱉潰爛處[6]、烏鱧肝腎等組織[7]分離出產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C.indologenes),從鯽的脾臟分離出金黃桿菌(Chryseobacterium)[8]。伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia)是Kim 等[9]在2005 年提出的新菌屬,歸屬于黃桿菌科(Flavobacteriaceae),為條件致病菌,廣泛存在于水、土壤等自然環(huán)境中;伊麗莎白菌屬包括米爾伊麗莎白菌(E. miricola)、按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)、腦膜敗血伊麗莎白菌(E. meningoseptica)等,可引起人類腦膜炎、敗血癥和肺炎等疾病[9]。該菌屬已從烏鱧[10]、中華鱘[11]、中華鱉[12]以及蛙類[13-16]體分離出來,感染該菌后,導(dǎo)致動物的肝臟、脾臟和腎臟組織損害嚴重[10-12]。伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia)引起的人類細菌感染,在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢,尤其是按蚊伊麗莎白菌(E.anophelis)引起的感染[17],目前已疑似在患病烏鱧身上分離出該菌[10]。按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)是一類革蘭陰性菌,在我國主要分布在秦嶺-淮河線以南濕潤地區(qū),而濕潤的亞熱帶氣候區(qū)的北移,可能會導(dǎo)致該菌在我國分布范圍更廣[18]?,F(xiàn)對患病的中華草龜進行細菌分離、鑒定及藥敏試驗,以期為中華草龜細菌性疾病的防治和針對性治療提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品

    患病中華草龜攝食量較少,眼球明顯突出,眼部有膿血水滲出。

    1.1.2 試劑

    營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司;DNA 提取試劑盒、Premix Taq Version 2.0均購自TaKaRa 公司;ddH2O 及引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司;測序服務(wù)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供;細菌鑒定板購自碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司;動物用藥敏檢測分析試劑盒購自南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

    1.1.3 儀器

    BSC-1300A2 生物安全柜(蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司)、SHP-160 型生化培養(yǎng)箱(揚州市三發(fā)電子有限公司)、THZ-82B 型空氣搖床(上海梅香儀器有限公司)、BG25 干式恒溫器(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、MIKRO 200R 臺式高速冷凍離心機(德國Hettich 科學(xué)儀器有限公司)、BD PhoenixSpecTM比濁儀(Becton Dickinson & Company)、CFX96 Real-Time PCR 儀(Bio-Rad)、BG-Power 600 型電泳儀(BayGene)、Tanon 3500B 凝膠成像系統(tǒng)(上海天能生命科學(xué)有限公司)及BD 半自動細菌鑒定儀(Becton Dickinson & Company)。

    1.2 方法

    1.2.1 細菌分離與培養(yǎng)

    在無菌條件下,使用無菌接種環(huán),蘸取中華草龜眼部病灶部位,于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線,共接種3 個平板,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑選形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落,進一步純化培養(yǎng)并進行革蘭染色,共挑取2株優(yōu)勢菌,分別命名為2022-11-11-WG-1 和2022-11-11-WG-2。

    1.2.2 生理生化試驗鑒定

    使用比濁儀,配制比濁度為0.5 mcf 的菌液,倒入鑒定板中,將鑒定板放入35~37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育18~24 h,將孵育完成的鑒定板取出,使用BD半自動細菌鑒定系統(tǒng)判讀鑒定結(jié)果。

    1.2.3 16S rDNA 基因序列測定及分析

    將生理生化鑒定方法與分子生物學(xué)鑒定方法相結(jié)合[19]。將分離菌震蕩培養(yǎng)24 h 后,參考DNA 提取試劑盒操作說明,提取純化菌株的DNA,將其作為模板進行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系(25 μL):Premix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,正反向引物各1 μL,模板1 μL。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;56 ℃退火15 s;72 ℃延伸10 s,35 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。一部分擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。16S rDNA 序列擴增使用通用引物,F(xiàn):5'-AAACTCAAAGGAATTGACGG-3'和R:5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3',參考文獻[20]的方法。剩下的PCR 擴增產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司,進行16S rDNA 基因測序。將分離株16S rDNA 測序結(jié)果在NCBI 中進行blast 比對。

    1.2.4 藥敏特性分析

    使用動物用藥敏分析試劑板檢測8種常見水產(chǎn)抗生素的藥物敏感性。挑取純化后的單個菌落于5 mL 生理鹽水中,制成0.5 mcf 濃度的菌懸液制成A 管,取2 支10 mL 的無菌生理鹽水,打開任意一瓶,以無菌的方式向陰性對照孔中分別加入200 μL無菌生理鹽水,從A 管中吸取200 μL 菌懸液,加入10 mL 無菌生理鹽水,倒入V 型槽中?;靹蚝?,利用微量移液器吸取V 型槽中的菌液,加入所有微孔中(陰性對照除外),每孔200 μL,將加樣好的藥敏分析試劑板,放入28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24~28 h 后讀取結(jié)果。

    判斷標準:與陽性對照孔比較,藥敏分析試劑板孔底變渾濁,為陽性(+);藥敏分析試劑板孔底澄明,為陰性(-)。以在微孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為最低抑菌濃度(MIC)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 細菌分離及菌落形態(tài)

    從患病中華草龜眼部分離出兩株優(yōu)勢菌,見圖1(a)(b)。由圖1 可見,菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好,2 株均為革蘭陰性菌。分離菌株培養(yǎng)24 h后,2022-11-11-WG-1 菌落形態(tài)特征為:黃色,凸起,表面光滑,邊緣整齊;2022-11-11-WG-2 菌落形態(tài)特征為:米色,表面光滑,邊緣整齊。

    圖1 2株優(yōu)勢菌

    2.2 細菌生物系統(tǒng)初步鑒定

    將2 株菌株接種到生化反應(yīng)板上,對2種菌株進行30 項生理生化試驗,結(jié)果見表1。由表1 可見,初步鑒定2022-11-11-WG-1 為產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes),2022-11-11-WG-2 為按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)。

    表1 細菌生物系統(tǒng)初步鑒定結(jié)果①

    2.3 16S rDNA 鑒定

    將測序獲得的基因序列在NCBI 中進行blast比對,結(jié)果表明,2022-11-11-WG-1 與金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)相似性為99%(登錄號:MH801979);2022-11-11-WG-2 與按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)(登錄號:OQ210041)和米爾伊麗莎白菌(E. miricola)(登錄號:CP115634)的序列相似性均為99%。

    綜合菌落形態(tài)特征、生理生化特性測定及分子生物學(xué)鑒定方法,初步判定病原菌2022-11-11-WG-1 為產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes),2022-11-11-WG-2 為按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)。

    2.4 藥敏試驗

    根據(jù)美國臨床和實驗室標準化協(xié)會《抗微生物敏感試驗的執(zhí)行標準(CLSI)(2019 版)》,判斷菌株對8種抗生素敏感程度。2種分離菌株對8種常見水產(chǎn)抗生素敏感程度見表2。2022-11-11-WG-1 產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes)和2022-11-11-WG-2 按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis)均對恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及鹽酸多西環(huán)素敏感,對硫酸新霉素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉及磺胺甲惡唑+甲氧芐啶具有較強的耐藥性。

    表2 菌株藥敏特性①mg/L

    3 討論

    本試驗從患病中華草龜眼部分離出產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C.indologenes)和按蚊伊麗莎白菌(E.anophelis)2種菌株。產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes)可引起人類肺炎、敗血癥、膿毒血癥等疾病,是人和動物共患病原菌。產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes)耐藥范圍較廣,楊移斌等[6]建議養(yǎng)殖過程中如發(fā)現(xiàn)中華鱉感染產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes),可選用慶大霉素、新霉素或者阿莫西林內(nèi)服,并配合使用二氧化氯、漂白粉及高鐵酸鉀等外用進行防控;王鑫毅等[7]建議使用米諾環(huán)素、利福平、頭孢西丁、多西環(huán)素、恩諾沙星、依諾沙星、諾氟沙星等7種抗生素對烏鱧產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes)進行治療。本試驗從患病中華草龜眼部分離的產(chǎn)吲哚金黃桿菌(C. indologenes)對恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考及鹽酸多西環(huán)素敏感。

    伊麗莎白菌屬(Elizabethkingia)能感染動物和人類,其致病機制包括侵入宿主細胞、裂解血小板和產(chǎn)彈性蛋白酶等,該菌屬具有多重耐藥性[21]。劉曉琳等[10]從患病烏鱧身上分離出疑似按蚊伊麗莎白菌(E. anophelis),并進行了人工回歸感染試驗,證實該菌對烏鱧有較強致病性,建議將米諾環(huán)素、利福平、多西環(huán)素、磺胺異惡唑作為治療候選藥物。蔡完其等[12]從發(fā)病中華鱉肝臟分離出腦膜敗血伊麗莎白菌(E. meningoseptica)(曾被稱為腦膜炎敗血性黃桿菌),根據(jù)藥敏試驗結(jié)果,配制了鱉必康Ⅲ號對其治療。李旭東等[16]從具有歪頭、破頭與白眼等癥狀的蛙體,分離出米爾伊麗莎白菌(E. miricola),該菌對青霉素、阿莫西林等19種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥,僅對氟苯尼考高度敏感。本試驗中的中華草龜,之所以會感染病原菌,可能與養(yǎng)殖過程中存在相互撕咬、投喂的飼料中存在病原菌、或者是養(yǎng)殖水體中有病原菌等有關(guān)。建議使用恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考或鹽酸多西環(huán)素,治療該患病中華草龜眼部。

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