噻蟲嗪暴露對克氏原螯蝦的病理損傷和生化反應的影響

田貴云，姜虎成，孫夢玲，趙彥華，薛暉*

（1.南京市高淳區(qū)兩湖管理中心，江蘇 南京 211300；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

噻蟲嗪是一種第二代煙堿類高效低毒殺蟲劑，化學式為C8H10ClN5O3S，具有更高的活性、更好的安全性、更廣的殺蟲譜、作用速度快、持效期長等特點，是防治稻飛虱和葉蟬等害蟲的常用藥劑[1]。其作用機理是可選擇性抑制昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)煙酸乙酰膽堿酯酶受體，進而阻斷昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常傳導，造成害蟲出現(xiàn)麻痹性死亡[2]。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），又稱小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda），甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），螯蝦科（Cambaridae），原螯蝦屬（Procambarus），原產(chǎn)北美洲，現(xiàn)分布于世界30 多個國家和地區(qū)，已發(fā)展為分布最廣、養(yǎng)殖最多、養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水蝦類[3]?？耸显r因其肉質鮮美，蛋白質和微量元素含量豐富[4]，深受消費者的青睞，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要的地位，已成為研究稻田綜合種養(yǎng)技術的模式動物[5]。

文獻[6]研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪對水生動物具有嚴重危害。暴露在噻蟲嗪后，中華蟾蜍蝌蚪的總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性逐漸降低，對抗氧化防御系統(tǒng)造成損害；鯽的抗氧化防御系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，影響鯽的正常發(fā)育[7]。中華絨螯蟹暴露在噻蟲嗪中，其神經(jīng)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)也受到損傷[8]。

稻蝦養(yǎng)殖模式中，克氏原螯蝦不可避免會受到農(nóng)藥的毒害，嚴重影響了其正常生長與繁殖[9-10]。目前，關于殺蟲劑噻蟲啉對克氏原螯蝦的毒性作用和安全性評價還未見報道?，F(xiàn)開展噻蟲嗪暴露對克氏原螯蝦的病理損傷和生化反應的影響試驗，探究噻蟲啉對克氏原螯蝦的急性毒性效應和安全濃度（SC），評價克氏原螯蝦對噻蟲啉的耐受能力，擬為環(huán)境農(nóng)藥污染防治和提高水產(chǎn)品安全性等提供科學依據(jù)，為克氏原螯蝦養(yǎng)殖管理提供參考。

1 材料與方法

1.1 時間與地點

2022 年9 月中旬，試驗地位于江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中基地。

1.2 材料

克氏原螯蝦來自江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚中基地。其體表完好、活性強、無疾病，平均體長為（8.5±1.0）cm，平均體質量為（16.5±2.0）g。試驗前，將克氏原螯蝦置于室內整理箱（180 cm×90 cm×20 cm）中暫養(yǎng)7 d，保持24 h 充氧，2 d 換水1 次，換水量為50%，及時清理池底糞便及殘餌。每日08：00 和18：00 各投喂1 次，投喂量為其體質量的5%。暫養(yǎng)期間死亡率<2%，試驗前一天停止投喂。

試驗用水為曝氣后的自來水，水溫為（22.5±1.5）℃，養(yǎng)殖水質符合《漁業(yè)水質標準》（GB 11607—1989）。

1.3 試驗方法

1.3.1 預試驗

采取靜水試驗法，試驗期間不投飼不換水，及時撈出死亡個體并記錄。蝦死亡標準為用玻璃棒觸碰蝦，多次刺激后沒有反應，則判定為死亡。噻蟲嗪質量濃度梯度設置為1，2，4，8，16 和32 mg/L，每個濃度設置3 組平行。共使用18 個聚乙烯桶（240 cm×140 cm×40 cm），每個桶暫養(yǎng)10 只蝦，水體積100 L，持續(xù)充氧。通過預試驗，確定克氏原螯蝦在噻蟲嗪脅迫下全部存活的最高濃度和全部致死的最低濃度。

1.3.2 正式試驗

根據(jù)預試驗的結果，在全部存活的噻蟲嗪最高濃度和全部致死的最低濃度之間，設置5 個等對數(shù)比試驗組，作為正式試驗的濃度，分別為1.43，2.04，2.93，4.16 和5.97 mg/L，同時設置一個空白對照組（0 mg/L）。試驗組和對照組每組設置3 組平行。共使用18 個聚乙烯桶（240 cm×140 cm×40 cm），每個桶暫養(yǎng)10 只蝦，水體積100 L，持續(xù)充氧。每6 h 觀察1 次蝦的行為及體表變化，及時撈出死亡個體并記錄。

1.3.3 慢性毒性試驗

暴露試驗在整理箱（180 cm × 90 cm × 20 cm）中進行。設置3 個試驗組：對照組、52.5 μg/L（1/4 LC50）暴露組、105.0 μg/L（1/2 LC50）暴露組，每組設3 個重復。對照組盛裝100 L 曝氣7 d 以上的自來水，暴露組盛裝100 L 對應濃度的噻蟲嗪溶液。取90 只規(guī)格接近且健康的克氏原螯蝦，平均分成9 份，每份10 只，分別放置于9 個整理箱內。每天定時投喂飼料，記錄暴露時間及水質指標。

1.3.4 抗氧化酶活的測定

分別在噻蟲嗪暴露的7 和14 d 取樣，每個時間點均有52.5 和105.0 μg/L 2組，即4 個試驗暴露組和1 個對照組（0 μg/L）。每組隨機挑選3 只克氏原螯蝦，共15 只，于冰上麻醉15 min 后解剖，取其肝胰腺（n=3），取樣量為0.2 g 左右，使用PBS 沖洗血液，快速放入液氮中，于-80 ℃冰箱保存。測定酶活前，將組織樣品混合生理鹽水勻漿（1∶9，W/V），于4 ℃下3 500 r/min 離心10 min。分別測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）和還原型谷胱甘肽（GSH）值。

1.3.5 蝦組織病理切片制備

每組取3 只克氏原螯蝦的肝胰腺，使用PBS 沖洗其血液。吸干后放入裝有4%多聚甲醛的離心管中固定24 h。隨后用水沖洗組織，用由低濃度到高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精。將樣品浸入石蠟中進行包埋。冷卻后使用切片機進行切片。石蠟切片厚度為5 μm，使用旋轉切片機（RM2016，萊卡，德國）。脫蠟后切片蘇木精-伊紅染色。染色切片的顯微鏡觀察和攝影使用顯微鏡（Eclipse E100，尼康，日本）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計試驗蝦在96 h 內的死亡數(shù)，并計算其死亡率。采用寇氏法（Korbor），計算噻蟲嗪對克氏原螯蝦的96 h 的LC50，SC 按LC50的10%來計算。數(shù)據(jù)采用Excel 進行初步處理，使用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）、Least Significant Difference（LSD）和Waller-Duncan（W）檢驗，使用Graphpad Prism 9 軟件作圖，結果以“平均數(shù)±標準差”表示。病理切片觀察通過Caseviewerr 軟件來實現(xiàn)的。

2 結果與分析

2.1 噻蟲嗪脅迫下克氏原螯蝦的中毒癥狀和行為變化

52.5 μg/L 噻蟲嗪暴露組克氏原螯蝦活動狀況與對照組相似，105.0 μg/L 噻蟲嗪暴露組克氏原螯蝦活力較強，在容器內作快速游動。隨著暴露時間的延長，105.0 μg/L 噻蟲嗪暴露組的克氏原螯蝦游動速度逐漸變慢，活力減弱，對外界的刺激反應遲鈍，最后死亡?？耸显r的中毒死亡過程表現(xiàn)為：反應逐步遲緩，無激烈的抵御反應，大多為側躺彎曲狀，縮尾，當仰臥于水中時，不能自行翻轉，僅附肢微弱擺動，最終死亡。

2.2 噻蟲嗪對克氏原螯蝦的急性毒性

不同濃度噻蟲嗪脅迫下克氏原螯蝦死亡情況見表1。由表1 可見，在24 h 時，只有1.43 mg/L 試驗組克氏原螯蝦未出現(xiàn)死亡，隨著濃度的增加，死亡率逐步上升，在5.97 mg/L 組中克氏原螯蝦死亡率達到100%。在48 h 時，2.93 和4.16 mg/L 的死亡率都維持在40%。在96 h 時，1.43 mg/L 組的死亡率依舊沒有改變，但是其余組都維持在高死亡率60%～100%?？瞻讓φ战M在96 h 內未出現(xiàn)死亡，故排除水質等外界因素對死亡情況的影響。噻蟲嗪對克氏原螯蝦的急性毒性分析結果見表2。

表2 噻蟲嗪對克氏原螯蝦的急性毒性分析結果

2.3 噻蟲嗪暴露使肝胰腺發(fā)生病理損傷

對照組和噻蟲嗪暴露組的肝胰腺的組織學切片見圖1（A）（a）（B）（b）（C）（c）。由圖1 可見，對照組肝胰腺結構整齊，管腔呈星號狀（★）。與對照組相比，噻蟲嗪處理組的肝胰腺有明顯的組織病理學變化。噻蟲嗪（52.5 和105.0 μg/L）暴露組肝胰腺組織都顯示管腔擴張，以及明顯的上皮空泡化（→）。

圖1 不同濃度噻蟲嗪對克氏原鰲蝦幼蝦肝胰腺組織學的影響

2.4 噻蟲嗪暴露導致克氏原螯蝦肝胰腺發(fā)生氧化應激

不同濃度噻蟲嗪對克氏原螯肝臟T-SOD、CAT酶活性和MDA、GPX 和GSH 濃度的影響見圖2（a）（b）（c）（d）（e）。由圖2 可見，肝胰腺中T-SOD 的活性隨著暴露時間和濃度的增加顯著升高，這表明組織中產(chǎn)生了過量的活性氧（ROS），同時引起了抗氧化防御反應。此外，肝胰腺中產(chǎn)生了過量的過氧化氫（H2O2），導致CAT 酶的顯著上升，在高濃度暴露7 d 后，肝胰腺CAT 酶較低濃度暴露組反而下降了。肝胰腺中MDA 含量顯著上升。結合CAT 酶的數(shù)據(jù)，表明高濃度暴露7 d，肝胰腺受到嚴重損傷。GPX 和GSH 作為機體重要的抗過氧化物酶在肝胰腺中顯著也上升。

圖2 不同濃度噻蟲嗪對克氏原螯肝臟T-SOD、CAT 酶活性和MDA、GPX 和GSH 濃度的影響

3 討論

3.1 噻蟲嗪暴露下克氏原螯蝦的LC50 及毒性

甲殼類動物有一個開放的循環(huán)系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，外界有毒物質極易進入體內并引起中毒[11]。在甲殼類急性毒性實驗中，依據(jù)國家標準[12]，農(nóng)藥的級別根據(jù)96 hLC50可分為低毒、中毒、高毒和劇毒，分別為LC50>10 mg/L、1.0 mg/L

3.2 噻蟲嗪暴露對克氏原螯蝦肝胰腺的損傷

甲殼動物的肝胰腺不僅是消化腺，而且是重要的免疫器官，在外源有毒物質代謝和先天免疫系統(tǒng)中起重要作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪對克氏原螯蝦肝胰腺細胞的形態(tài)結構有破壞作用。肝胰腺細胞發(fā)生空泡化，管腔擴大，這些現(xiàn)象表明克氏原螯蝦肝胰腺組織受到明顯的損傷[13]。

3.3 噻蟲嗪對克氏原螯蝦抗氧化酶活性的影響

環(huán)境污染物可能會引起水生動物的氧化應激反應。T-SOD 是甲殼動物體內必需的保護酶。本試驗中，所有噻蟲嗪暴露組與對照組相比，T-SOD 活性都顯著上升。此外，肝胰腺中CAT 酶的顯著上升，表明產(chǎn)生了過量的H2O2，值得注意的是，在高濃度暴露7 d 后，CAT 酶較低濃度暴露組反而下降，推測是高濃度的噻蟲嗪對肝胰腺的損傷程度遠遠高于低濃度的肝胰腺，導致組織無法合成足夠的CAT 酶來消除過量的H2O2，導致?lián)p傷無法及時恢復。丙二醛（MDA）被認為是活性氧誘導組織損傷的主要途徑，也是氧化損傷的生物標志物。在本試驗中，MDA 含量顯著上升，這與溴氰菊酯對克氏原螯蝦的結果一致[14]，結合CAT 酶的數(shù)據(jù)，推斷高濃度暴露7 d，肝胰腺受到嚴重損害。GPX 作為重要的機體抗過氧化物酶[15]，其濃度和GSH 都在肝胰腺中顯著上升，推測是為了應對過量ROS 導致的氧化脅迫作用。

4 結論

噻蟲嗪對克氏原螯蝦的96h LC50為2.1 mg/L，SC 為0.21 mg/L，對克氏原螯蝦毒性屬于中毒級別。當克氏原螯蝦暴露在105 μg/L 的噻蟲嗪14 d 后，肝胰腺發(fā)生了損傷，產(chǎn)生過量的ROS，抗氧化酶TSOD、CAT 的活性和MDA、GPX 的濃度隨著噻蟲嗪的濃度上升，同時抗氧化劑GSH 的濃度也上升了。