循環(huán)腫瘤DNA在婦科惡性腫瘤中的應用

尹萍 徐寒子 朱晨靜

南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所 （南京 210009）

液體活檢是當前精準醫(yī)學時代腫瘤學與檢驗學交叉學科，主要包括循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）、游離細胞DNA （cell-free DNA，cfDNA）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating-tumor DNA，ctDNA）檢測。其中，cfDNA 來源于死亡細胞，包括正常細胞、腫瘤細胞和克隆造血細胞等，通常是較短的DNA片段（平均長度為120 ～ 160 bp），在血漿、腦脊液及尿液中即可被檢測到［1-2］。cfDNA 在人體內(nèi)1 d之中變化很大，臨床建議在每天的同一時間進行檢測。而來源于腫瘤細胞的cfDNA 即為ctDNA。ctDNA 的檢測方法分為單基因或多基因檢測、已知突變的靶向檢測和基于高通量測序（next generation sequencing，NGS）的全基因組檢測，臨床上通常采用NGS，不同的檢測方法對結(jié)果有較大影響［3-4］。與組織活檢相比，基于血液的生物標志物對患者的侵襲風險最小，可以獲得更全面的腫瘤異質(zhì)性。ctDNA 分析可以檢測多種基因組畸變，包括點突變、插入/缺失、擴增（拷貝數(shù)變異）、基因融合和DNA 甲基化等［5］。目前ctDNA 主要應用于腫瘤的早期診斷、復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評估、動態(tài)監(jiān)測及治療指導等。2020 年ESMO 就開始針對不同腫瘤提出不同的NGS 使用建議［3］。婦科腫瘤和其他實體腫瘤一樣都面臨著無法及時早期診斷和證實復發(fā)，組織獲取侵襲風險較高、動態(tài)監(jiān)測靈敏度及特異度不是非常令人滿意的問題，且目前常用的血液學檢測手段對后續(xù)治療無明顯指導作用。基于這些原因，已有很多學者對ctDNA 做了很多研究，他們發(fā)現(xiàn)ctDNA 在這些方面具有一定優(yōu)勢。因此本文綜述了ctDNA 在婦科惡性腫瘤如宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌方向臨床應用進展情況，現(xiàn)報告如下。

1 ctDNA 在宮頸癌中的應用

2020 年中國宮頸癌發(fā)病率位中國女性癌癥第六，而病死率為第七，且在部分城市呈上升趨勢［6-7］。其中Ⅰ期患者占57.3%，Ⅱ期占 33.9%，Ⅲ-Ⅳ期占4.3%，其5 年無病生存期（disease-free survival，DFS）和總生存期（overall survival，OS）隨分期的增加而遞減［8］。尤其復發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移患者預后更差［9］。因此，早診斷早發(fā)現(xiàn)有助于提高患者的DFS 和OS。在中國，目前最普及的宮頸癌篩查和診斷工具是液基薄層細胞檢測（thinprep cytologic test，TCT）和更敏感的 HPV-DNA 測試［10］。已知HPV 感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，有鑒于此，宮頸癌具有特異性ctDNA 即cfHPV DNA檢測［11］。

1.1 早期診斷 GU 等［12］報道，cfHPV DNA 作為宮頸癌ctDNA 的一種特異性診斷，具有中等敏感度［0.27，95%CI： 0.24 ～ 0.30］和高度特異度（0.94，95%CI：0.92 ～ 0.96），其診斷比值比（diagnositic odds ratio，DOR）為15.25（95%CI： 5.42 ～ 42.94），ROC下面積為0.94（95%CI：0.89 ～ 0.99），體現(xiàn)了cfHPV DNA 較高的診斷準確率。這表明cfHPV DNA 可作為宮頸癌的無創(chuàng)早期診斷生物標志物。當然，如果可以檢測到宮頸癌前驅(qū)病變，則更有益于早干預患者的治療。但目前研究結(jié)果不甚理想：一方面，關于是否可以在具有前驅(qū)病變的患者的血漿中發(fā)現(xiàn)cfHPV DNA 存在相互矛盾的報道，且此類研究大多為2016 年之前進行，大部分樣本僅使用少量血清，加之沒有使用新的高靈敏度技術，結(jié)果并不令人信服［13-14］；另一方面，最近使用數(shù)字微滴PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的少數(shù)研究也并未在任何前驅(qū)病變中發(fā)現(xiàn)cfHPV DNA，而ddPCR在檢測cfHPV DNA 方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)PCR［15］。截止目前，cfHPV DNA 可作為宮頸癌早期診斷的生物標志物，但在檢測具有前驅(qū)病變方面未能顯示較為滿意的結(jié)果。一方面，檢測技術需要改進；另一方面，cfHPV DNA 濃度受腫瘤大小、臨床分期及位置等臨床特征影響，需要更多更加細致的研究進行更加全面的分析。

1.2 治療指導 ZHANG等［16-17］對來自中國的126例宮頸癌患者的血漿樣本進行了涵蓋1 020 個基因的NGS 檢測，結(jié)果顯示 PIK3CA 是宮頸癌最常見的突變基因（約 30%），這與PIK3CA 在宮頸癌組織中的檢測結(jié)果一致，提示血漿中ctDNA 的突變基因與腫瘤組織中的突變基因具有一致性。可以根據(jù)ctDNA 提示突變選擇對應靶向藥物。TIAN等［18］發(fā)現(xiàn)，對同一患者化療前后血漿的分析顯示，化療后突變基因數(shù)量的減少與部分緩解（partial response，PR）和疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）顯著相關。及時的療效評估有助于后續(xù)治療方案的選擇。

1.3 復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評估 ctDNA 可以更早反映疾病進展［18］，如JEANNOT 等［19］報道指出，若在治療結(jié)束后3 個月內(nèi)檢測到 cfHPV DNA，則平均約10 個月后患者會出現(xiàn)臨床復發(fā)，提示ctDNA 可能是宮頸癌復發(fā)診斷的生物標志物。

1.4 預后預測 TIAN 等［18］的一項回顧性臨床研究發(fā)現(xiàn)ctDNA 可檢測到PIK3CA、BRAF、GNA11、FBXW7 和CDH1 中任意突變的復發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者，其無進展生存期（progression-free survival，PFS）和OS 明顯短于未檢測到的患者。這些研究也表明了ctDNA 對宮頸癌具有較高的預后預測價值。同樣的，cfHPV DNA 也可對宮頸癌進行預后預測。幾項研究報告結(jié)果均顯示，治療前 cfHPV DNA 的量與宮頸癌組織中HPV DNA 的量具有一致性，并且與增加的腫瘤負荷、更大的腫瘤體積、更晚期的腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險增加以及遠處轉(zhuǎn)移相關；遺憾的是未發(fā)現(xiàn)其與 FIGO 分期相關［14-15，19-21］。TAK 等［22］在超過一半宮頸癌患者的血漿ctDNA 中檢測到HPV E7 和L1 序列。高病毒載量患者（定義為每20 μL E7 或L1 拷貝數(shù)≥ 20）在單變量分析中顯示患者 5 年復發(fā)和死亡風險增加，但多變量分析未能得到相同結(jié)果。雖另有兩項研究則未能證實基線cfHPV DNA 與預后之間的任何關聯(lián)［19，23］，但總體來講多數(shù)研究支持，在治療結(jié)束時或隨訪期間檢測到cfHPV DNA 與DFS 和OS 顯著縮短以及更差的PFS 相關，且治療后持續(xù)存在的cfHPV DNA 與不良預后之間存在相關性［19-20］。

ctDNA 檢測在2022 年開始進入宮頸癌NCCN指南，即無法獲取腫瘤組織的時候可以考慮使用ctDNA 來進行全基因組分析［24］。因此ctDNA 在宮頸癌中的應用愈加廣泛，隨著各項研究的推進，可以探索ctDNA 應用領域的更多可能性。cfHPV DNA 雖尚未進入臨床，但其應用前景也是可觀的。

2 ctDNA 在子宮內(nèi)膜癌中的應用

不管在發(fā)達國家還是在發(fā)展中國家，子宮內(nèi)膜癌都是女性生殖系統(tǒng)主要癌癥之一，且發(fā)病率逐年上升；在中國，城市發(fā)病率高于農(nóng)村，從死亡率來看，過去十幾年內(nèi)子宮內(nèi)膜癌總體保持在一個相對平穩(wěn)的狀態(tài)［25］。

2.1 早期診斷 雖然子宮內(nèi)膜癌預后總體良好，但有近30%的病例確診時已是發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的中晚期，預后較差，早期診斷有助于改善患者預后［25］。對于子宮內(nèi)膜癌的篩查，既往關于細胞學檢查和經(jīng)陰道超聲的研究較多，然而二者均特異性較差。FENG 等［26］發(fā)現(xiàn)對于高風險子宮內(nèi)膜癌，ctDNA 中檢測到的突變基因與基線腫瘤組織中的高度一致。遺憾的是并未進一步探索ctDNA 作為早期診斷標志物的臨床潛在能力。由于女性生殖系統(tǒng)的特殊解剖特點及子宮內(nèi)膜癌的特殊解剖位置，子宮抽吸物的DNA 檢測也在研究之中。有研究［27］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者的子宮抽吸物中都能檢測到對應的基因突變，子宮抽吸物的基因檢測結(jié)果可能對子宮內(nèi)膜癌的早期篩查有臨床意義。該作者隨后發(fā)表了子宮抽吸物基因突變與子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織的一致性的病例報告［28］。不管是子宮抽吸物還是血漿之中的ctDNA 對子宮內(nèi)膜癌的早期診斷都有一定的臨床意義，但目前研究較少，ctDNA 指導子宮內(nèi)膜癌分子分型更可能是將來研究的一個重要方向。

2.2 治療指導 微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI） 最近已成為免疫治療療效預測的泛腫瘤生物標志物。KEYNOTE-158 研究支持了帕博利珠單抗在MSHH/dMMR 狀態(tài)的子宮內(nèi)膜癌患者中的應用獲益，因此指南推薦了子宮內(nèi)膜癌患者進行MSI 狀態(tài)檢測，且建議帕博麗珠單抗用于治療MSH-H/dMMR狀態(tài)的無法切除或轉(zhuǎn)移性實體瘤［29-30］。近年來子宮內(nèi)膜癌分子分型逐漸走入臨床，NGS 檢測有助于辨別其MSI 狀態(tài)。在這種情況下，從ctDNA 中無創(chuàng)檢測MSI 是一種很有前途的診斷和治療后監(jiān)測工具。SILVEIRA 等［31］發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌ctDNA的檢測結(jié)果與臨床上常用的參考五重法之間具有高度一致性（93%），并且它們在治療期間的動態(tài)與臨床反應密切相關。

2.3 復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評估 評估復發(fā)轉(zhuǎn)移風險最常用的是CA125 和HE4，但其敏感性相對較低。FENG 等［26］在67%（6/9）高危子宮內(nèi)膜癌患者的基線血漿樣本中檢測到ctDNA，但未發(fā)現(xiàn)與DFS 的相關性。隨后他們發(fā)現(xiàn)有44%（4/9）的術后患者可檢測到ctDNA，其預測腫瘤復發(fā)的敏感度及特異度分別為100%和83.3%，優(yōu)于CA125 和HE4；然而該項研究樣本較少，仍需要更多數(shù)據(jù)的進一步支撐。

2.4 預后預測 SHINTANI 等［32］發(fā)現(xiàn)術前血漿中檢測到的ctDNA 與較晚的FIGO 分期、病理類型、脈管癌栓浸潤、無復發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）及OS 相關。這表明基線ctDNA 在子宮內(nèi)膜癌復發(fā)風險評估及預后預測中也具有一定價值。

3 ctDNA 在卵巢癌中的應用

2020 年全球癌癥統(tǒng)計顯示，中國卵巢癌發(fā)病率位女性癌癥第十，病死率位女性癌癥第九［6］，嚴重威脅女性健康。

3.1 早期診斷 據(jù)統(tǒng)計，卵巢癌明確診斷時約70%的患者已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，5 年生存率只有不到30%，而早期卵巢癌5 年生存率可達90%，因此早期診斷有助于提升卵巢癌的預后［33］。目前FDA 批準用于診斷的腫瘤標志物只有CA-125 和HE4，敏感度及特異度低，不適用于早期篩查；隨訪期間對CA125 的監(jiān)測也未能得到對OS 有益的證明［34］。影像學檢查如CT 和MRI 等應用于卵巢癌篩查亦未能顯著改善其預后［35］。而組織活檢雖是診斷金標準，但因其具有高侵入性（需要經(jīng)手術取樣），且只能提供靈敏度有限的局部采樣，難以作為臨床早篩手段?，F(xiàn)有篩查缺點驅(qū)使人們不斷尋找更特異和敏感的卵巢癌生物標志物。

對比上述方法，ctDNA檢測具有易操、可重復性高等優(yōu)勢。已有大量研究證實，與良性卵巢腫瘤患者和正常卵巢人群相比，卵巢癌患者ctDNA 水平顯著升高（ctDNA 水平197.176 μg/L：881.181 μg/L，P＜ 0.01）［36］。此外，與Ⅰ期和Ⅱ期（593.401 μg/L）卵巢癌相比，Ⅲ期（1 104.975 μg/L）和Ⅳ期（954.370 μg/L）卵巢癌的 ctDNA 水平也顯著升高（P＜ 0.01）。且ctDNA 對卵巢癌診斷的敏感度（88.9%）及特異度（89.5%）也均高于CA125（敏感度75.0%，特異度52.6%）和HE4（敏感度80.6%，特異度68.4%）［36］。有報告指出聯(lián)合檢測ctDNA 的濃度和完整性更有利于卵巢癌的早期診斷［37］。也有學者對同樣作為潛在血清學標志物的lncRNA 和miRNA 與ctDNA做了比較研究，他們發(fā)現(xiàn)ctDNA 對卵巢癌診斷的特異度和敏感度都優(yōu)于lncRNA 和miRNA［38］，ctDNA 可能是更敏感和特異的卵巢癌早篩生物標志物。

單個ctDNA 的點突變檢測對卵巢癌的早期診斷并沒有很好的特異度及敏感度［39］。或許結(jié)合多個點突變建立診斷模型有助于提高診斷的特異度及敏感度。

DNA 甲基化的改變是腫瘤發(fā)生的早期事件之一，ctDNA 甲基化可能也是卵巢癌早期診斷的潛在標志物。研究者［40］發(fā)現(xiàn)血漿中的DNA 甲基化可以區(qū)分健康人群與卵巢癌人群，他們選取了11個甲基化DNA設計了一個模型，這個模型在卵巢癌診斷中具有高度特異度［96%（95%CI：89% ～ 99%）］和敏感度［79%（95%CI：69% ～ 87%）］。鑒于ctDNA的異常甲基化在卵巢癌患者和健康對照組之間的差異，我們有理由相信其可能是卵巢癌潛在有價值的診斷標志物。另有文獻報道雖然早期上皮性卵巢癌患者和健康對照者的CA125 水平在單因素分析中沒有顯著差異，但兩者ctDNA 的OPCML 甲基化水平顯著不同。這進一步支持了較之傳統(tǒng)標記物，ctDNA 特定甲基化識別早期上皮性卵巢癌更敏感和特異的觀點［41］。當然，ctDNA 甲基化的診斷價值仍需要更多研究的支持。

染色體不穩(wěn)定是另一可以在 ctDNA 中檢測到的卵巢癌早期診斷潛在生物標志物。雖然關于染色體不穩(wěn)定性的研究很少，但初步研究表明它對卵巢癌的早期診斷有一定價值，具有臨床繼續(xù)研究的潛力。如VANDERSTICHELE 等［42］發(fā)現(xiàn)，ctDNA 中染色體不穩(wěn)定性的ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）為0.89 而CA125 僅為0.78，這表明卵巢癌檢測中ctDNA 中染色體不穩(wěn)定性檢測更有意義，在HGSC（AUC 0.94）中尤為明顯。

上述研究表明，在卵巢癌的早期診斷中，ctDNA 的定量、特定的基因突變、甲基化及染色體不穩(wěn)定性的檢測都有一定優(yōu)勢。鑒于目前臨床ctDNA 的檢測可同時包含上述內(nèi)容，若將這幾種方法結(jié)合，將有可能建立合適的預測模型，從而一定程度上提高卵巢癌早期診斷的特異度及敏感度。

3.2 治療指導 對于卵巢癌的治療監(jiān)測，現(xiàn)有方法仍主要依賴于CA125 和CT，但敏感度有限。研究［36］表明，ctDNA 水平與腫瘤負荷顯著相關。隨著腫瘤負荷的增加，ctDNA 也隨之增加。針對卵巢癌，患者體內(nèi)ctDNA 濃度的變化可以動態(tài)反映其病變發(fā)展情況，且優(yōu)于傳統(tǒng)的CA125；SHAO等［36］研究證明了這個觀點，他們發(fā)現(xiàn)ctDNA 達到化療后最低點的中位時間為37（28，54） d，而CA125 為84（42，116） d。微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）概念源于白血病誘導化療達到完全緩解后，在患者體內(nèi)依然殘留白血病細胞的狀態(tài)，轉(zhuǎn)換到實體瘤即指在根治性治療后，傳統(tǒng)影像或?qū)嶒炇曳椒ú荒馨l(fā)現(xiàn)、但通過液態(tài)活檢技術可檢出的體內(nèi)殘存惡性病灶。目前臨床上通常以檢測ctDNA 來評估MRD，從而指導后續(xù)治療并評價預后。在大多數(shù)實體瘤中，MRD 陰性通常與更好的預后相關。與之相反的是，在卵巢癌中尚未有中高級別證據(jù)證實手術后MRD 陰性與更好的卵巢癌預后相關，部分原因可能是近乎全部研究將殘留灶＜ 1 cm 也納入MRD 范圍［43］。

另外，分析ctDNA 的其他變化也有助于了解卵巢癌患者對治療的反應。其中TP53 突變是HGSC 的特征性標志物，可能反映患者的病情。有研究者［44］還發(fā)現(xiàn)化療后未檢測到血清ctDNA 中的TP53 突變，但隨著疾病進展TP53 突變會再次出現(xiàn)。由此可以認為，ctDNA中的TP53突變可能是卵巢癌動態(tài)監(jiān)測的潛在標志物，具有重要的研究價值。TSERPELI等［45］指出在HGSC患者中，ctDNA 中SLFN11 的DNA 甲基化與晚期HGSC 中較差的PFS顯著相關（P= 0.045），而SLFN11 表觀遺傳失活可能是卵巢癌對鉑類藥物耐藥性的預測因子。因此，ctDNA 中基因突變及甲基化在卵巢癌治療監(jiān)測及指導中有一定作用。但是，目前缺乏大量臨床數(shù)據(jù)證實?？偟膩碚f，ctDNA 分析可以評估腫瘤負荷，更好地反映治療反應，從而制定治療方案，為后續(xù)治療提供參考。

3.3 復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評估 卵巢癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的評價目前仍然主要依靠CA125 和CT，但同樣的其對轉(zhuǎn)移病灶的檢出非常有限。HOU 等［46］發(fā)現(xiàn)術后ctDNA 的存在與上皮性卵巢癌PFS 降低的高度相關，且在評估復發(fā)風險方面優(yōu)于CA125。因此，可以認為ctDNA 在復發(fā)轉(zhuǎn)移診斷中的潛力已被公認。

3.4 預后預測 關于卵巢癌的預后，據(jù)報道ctDNA的定量分析有利于對此進行評估。當ctDNA 水平超過一定范圍時（22 000 GE/mL），卵巢癌患者死亡風險增加2.83 倍［47］。在晚期卵巢癌中，ctDNA中SLFN11 的甲基化則與較差PFS 顯著相關［45］。而PARKINSON等［48］發(fā)現(xiàn)經(jīng)過1周期治療后，ctDNA 中TP53 下降＞ 60%是多變量分析中PFS 的獨立預測因素（HR= 0.22，95%CI： 0.07 ～ 0.67，P= 0.008）?；熀? 個月TP53mut ctDNA 水平相較于首次化療后TP53mut ctDNA 水平翻倍與更差的PFS 相關（P= 0.001），而化療后3 個月CA125 水平相較于首次化療后CA125 水平翻倍與PFS 無明顯相關（P=0.674），前者具有更好的預后預測能力［39］。

4 展望

婦科惡性腫瘤行液體活檢尤其ctDNA 檢測對早期診斷、異質(zhì)性評估、復發(fā)轉(zhuǎn)移風險評估、動態(tài)監(jiān)測及后續(xù)治療指導意義明確。目前在宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌三大腫瘤領域都有不同的研究側(cè)重點：宮頸癌集中于cfHPV DNA 的檢測，子宮內(nèi)膜癌則側(cè)重于與分子分型相結(jié)合，而卵巢癌則涉及各個方面。雖然目前只有宮頸癌診療指南加入了ctDNA 檢測，但其在臨床其他癌種的應用潛力不容小覷。目前各項臨床研究仍在起步階段，大量后續(xù)的數(shù)據(jù)支撐仍是必不可少的。過去幾年內(nèi)，NGS 檢測技術得到飛速發(fā)展，但仍有不足：（1）NGS 檢測雖然創(chuàng)傷小且速度快，但其檢測難度及高額的花費讓許多患者止步；因此探索更加經(jīng)濟且敏感度和特異度更高的ctDNA 檢測方法同樣具有臨床意義。（2）目前臨床上NGS 檢測包含基因過多，可以進一步探索更適用于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌或卵巢癌的特異基因。（3）并不是所有人群都需要進行NGS 檢測，需要進一步明確NGS 檢測人群的選擇。

【Author contributions】YIN Ping performed wrote the article.XU Hanzi and ZHU Chenjing revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.