改性苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物色譜固定相用于磷脂分離分析

聶揚(yáng)揚(yáng), 楊觀濤, 王海燕, 喬曉強(qiáng)*

(1. 河北大學(xué)藥學(xué)院, 河北 保定 071002; 2. 保定市清苑區(qū)人民醫(yī)院, 河北 保定 071100)

細(xì)胞或者組織的脂質(zhì)組成變化與多種疾病的發(fā)生息息相關(guān)[1,2]。近年來(lái),人們逐漸認(rèn)識(shí)到脂質(zhì)的重要性,與脂質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)功能及其相關(guān)的分析技術(shù)研究越來(lái)越多地受到研究人員的關(guān)注[3-7]。磷脂是重要的脂類物質(zhì)之一,是生物膜的主要成分,在生命體中起著重要的結(jié)構(gòu)、代謝和功能作用[8-10]。此外,磷脂還參與細(xì)胞死亡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[11],并且與各種神經(jīng)退行性疾病和腫瘤息息相關(guān)[12-14]。由于其生化和臨床的重要性,發(fā)展快速可靠的磷脂分離分析方法對(duì)于識(shí)別和定量生物樣本中的復(fù)雜磷脂分子具有重要意義。

磷脂分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多且含量各異,以最常見的磷脂酰膽堿(PC)為例,PC的主要異構(gòu)體形式包括旋光異構(gòu)、C=C位置異構(gòu)、C=C順反異構(gòu)和sn位置異構(gòu),這些異構(gòu)形式可以延伸出數(shù)以萬(wàn)計(jì)的異構(gòu)體。因此,磷脂分子的極端復(fù)雜性使其分離分析面臨著很大的挑戰(zhàn)性。近年來(lái),磷脂類物質(zhì)的分離分析方法發(fā)展迅速,其中,高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)技術(shù)成為磷脂分離、鑒定和定量的重要技術(shù)[15]。例如,Ansar等[16]基于HPLC-MS法分離和定量了Visudyne脂質(zhì)體配方中的磷脂及其相應(yīng)的降解產(chǎn)物,該方法能夠分離磷脂的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和順反異構(gòu)體。Visudyne的主要脂質(zhì)降解產(chǎn)物包括溶血磷脂酰膽堿、少數(shù)飽和/不飽和溶血磷脂酰甘油以及游離的脂肪酸,每種降解產(chǎn)物含量均小于磷脂總量的1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。Sun等[17]開發(fā)了基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜的方法來(lái)分析人乳、牛奶和羊奶中的磷脂類別與分子種類,共鑒定出11個(gè)磷脂類,包含229種磷脂分子。目前,磷脂分離常用的HPLC色譜柱包括二醇柱、C18柱、氨基柱等[18-23]。近年來(lái),多種新型的色譜固定相被研制出來(lái)以應(yīng)對(duì)復(fù)雜磷脂樣品的分離需求。例如,Liu等[24]以烯丙基三辛基溴化膦為單體,設(shè)計(jì)合成了新型聚膦離子液體鍵合硅膠色譜固定相(PIL@SiO2),可同時(shí)實(shí)現(xiàn)磷脂類和磷脂分子的分離,并成功應(yīng)用于大豆卵磷脂中磷脂的分離分析。李新庭等[25]以溴化1-乙烯基-3-十二烷基咪唑(VDI)為單體,制備了VDI鍵合色譜固定相(Sil-VDI),該固定相具有反相/離子交換混合模式保留機(jī)制和良好的分離性能。作者進(jìn)一步將其用于肺癌細(xì)胞和雞蛋黃磷脂樣品提取物的分離分析,Sil-VDI色譜柱對(duì)2種磷脂樣品均展示了良好的分離選擇性。然而,為了改善復(fù)雜磷脂樣品的分離分析性能,研制新型磷脂色譜分離固定相仍然是目前研究的熱點(diǎn)之一。

苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物(SMA)是一類新型兩親性聚合物,在磷脂和膜蛋白質(zhì)增溶方面得到了廣泛的應(yīng)用[26,27], SMA對(duì)膜蛋白質(zhì)增溶的原理是其可以和膜蛋白質(zhì)周圍的磷脂雙分子層發(fā)生親水、疏水相互作用和靜電相互作用,從而插入其中形成“納米圓盤”[28,29],實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白質(zhì)的增溶?；赟MA與磷脂雙分子層的強(qiáng)相互作用,本文將SMA引入硅膠色譜固定相的制備,并采用蛋氨酸甲酯鹽酸鹽(MME·HCl)對(duì)馬來(lái)酸酐基團(tuán)進(jìn)行開環(huán)修飾,合成了新型的改性SMA修飾色譜固定相(Sil-SMA-MME),并將該固定相用于南極磷蝦油和人血清磷脂提取物的分離分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nicoleti S10傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司); GLK型裝柱機(jī)、不銹鋼色譜柱管(250 mm×4.6 mm)、GALAK型氨基色譜柱(SiO2-NH2)(250 mm×4.6 mm)(無(wú)錫加萊克色譜科技有限公司); P230Ⅱ高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司); ELSD6000蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)(美國(guó)奧泰科技有限公司); STA449C熱重分析儀(德國(guó)耐馳公司); IKA RCT basic磁力攪拌器(艾卡儀器設(shè)備有限公司); SB-100DT超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

球形多孔硅膠(粒徑5 μm,孔徑12 nm,日本Daisogel公司); (3-巰丙基)三乙氧基硅烷(MPS,純度96%)、MME·HCl(純度98%)、苯乙烯(純度99%)、馬來(lái)酸酐(純度99%)、偶氮二異丁腈(AIBN,純度99%)、對(duì)甲苯磺酸(TsOH,純度99%)(北京伊諾凱科技有限公司);N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲基叔丁基醚(MTBE)(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,純度98%)、二硬酯酰磷脂酰膽堿(DSPC,純度95%)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC,純度99%)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE,純度97%)(北京百靈威科技有限公司);溶血卵磷脂(LysoPC,純度97%,天津阿爾塔科技有限公司);二油酰磷脂酰膽堿(DOPC,純度97%,梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司);二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸鈉(DPPS,純度95%,艾美捷科技有限公司);甲醇(MeOH)和乙腈(ACN)(HPLC級(jí),天津賽孚瑞科技有限公司)。

1.2 Sil-SMA-MME固定相的制備

試劑預(yù)處理 稱取硅球2.5 g,放入真空干燥箱中,于100 ℃烘干24 h備用。

巰基化硅球(Sil-SH)的制備 取干燥后的硅球,將其置于250 mL圓底燒瓶中,隨后加入50 mL無(wú)水甲苯使硅球在溶劑中混懸,之后加入5.8 g MPS,在氮?dú)夥諊掠?10 ℃攪拌反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后,離心除去溶液,沉淀的硅球用甲醇洗滌5次,在80 ℃下真空干燥24 h,得到Sil-SH。

苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物接枝硅球(Sil-SMA)的制備 稱取14.7 g (150 mmol)馬來(lái)酸酐,置于500 mL圓底燒瓶中,加入50 mL DMF超聲使其充分溶解,加入上一步得到的Sil-SH,繼續(xù)加入31.3 g (300 mmol)苯乙烯后立即加入60 mL DMF振蕩,使溶液充分混勻,再加入溶于10 mL DMF中的0.69 g AIBN,立即將溶液置于氮?dú)夥諊?于80 ℃攪拌反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束后,離心除去黏稠溶液,沉淀的硅球用DMF離心洗滌至上清液無(wú)色,再用甲醇洗滌2次,于70 ℃下真空干燥24 h,得到Sil-SMA。

Sil-SMA-MME固定相的制備 稱取4.0 g (20 mmol) MME·HCl,置于250 mL圓底燒瓶中,加入30 mL DMF超聲使其充分溶解,取上一步反應(yīng)產(chǎn)物加入溶液中,再加入50 mL DMF振蕩,使溶液充分混勻,稱取TsOH 0.5 g,用10 mL DMF溶解后倒入燒瓶中,在氮?dú)夥諊掠?5 ℃攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)結(jié)束后,產(chǎn)物依次用DMF和甲醇各離心洗滌3次,在70 ℃下真空干燥24 h,得到最終的固定相材料。

以上合成步驟見圖1。

圖1 Sil-SMA-MME固定相制備示意圖

1.3 色譜柱裝填

采取高壓勻漿法裝填Sil-SMA-MME色譜柱。勻漿液為氯仿-環(huán)己醇(1∶4, v/v), 20 mL;頂替液為甲醇-異丙醇(1∶1, v/v)。稱取Sil-SMA-MME 2.1 g,加入勻漿液攪拌使其分散均勻。將固定相材料的混懸液倒入勻漿管中,調(diào)節(jié)裝柱機(jī)壓力使其緩慢上升至35 MPa。待頂替液流出約100 mL后,裝柱完成。使裝柱機(jī)壓力降為0 MPa,靜置30 min后取下色譜柱,安裝剩余的篩板和柱頭,連接高效液相色譜泵,用乙腈沖洗色譜柱,備用。

1.4 樣品配制

1.4.1色譜測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品的配制

本實(shí)驗(yàn)中所有小分子化合物樣品均采用色譜純乙腈配制并經(jīng)過超聲、離心、過膜后備用。酰胺類化合物中氰基乙酰胺質(zhì)量濃度為80 μg/mL,其余小分子化合物質(zhì)量濃度均控制在30～50 μg/mL。

1.4.2磷脂標(biāo)準(zhǔn)品與復(fù)雜磷脂樣品的制備

DPPC、LysoPC、DOPC、DSPC和DMPC采用三氯甲烷-甲醇(1∶1, v/v)配制,其余磷脂類標(biāo)準(zhǔn)品采用三氯甲烷-甲醇(3∶1, v/v)配制。磷脂標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度控制在0.5～1.0 mg/mL,所有樣品均采用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾,-20 ℃冷藏備用。

南極磷蝦油磷脂提取:將磷蝦油膠囊剪開,稱取膠囊內(nèi)容物100 mg,用20 mL正己烷-異丙醇(1∶1, v/v)溶解,所得樣品超聲5 min,用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾,常溫下放置備用。

人血清中磷脂提取物的制備:采用MTBE-MeOH體系,在200 μL人血清中加入400 μL MTBE和80 μL MeOH,渦旋30 s,以3 000 r/min離心15 min,此時(shí)兩相分離,界面出現(xiàn)白色沉淀,取上層有機(jī)相,用氮?dú)獯蹈?并用1 mL二氯甲烷-甲醇(1∶1, v/v)復(fù)溶,用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后冷藏備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

首先采用熱重分析對(duì)Sil-SMA-MME固定相進(jìn)行表征。如圖2a所示,與SiO2相比,Sil-SH、Sil-SMA和Sil-SMA-MME的熱損失逐漸增加,可驗(yàn)證Sil-SMA-MME固定相制備成功。進(jìn)一步采用傅里葉變換紅外光譜法對(duì)Sil-SMA-MME固定相進(jìn)行表征。如圖2b所示,在Sil-SMA的紅外光譜圖中出現(xiàn)了1 495 cm-1和1 455 cm-1處的苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)吸收峰、700 cm-1處的苯環(huán)C-H面外彎曲振動(dòng)吸收峰以及1 830 cm-1和1 735 cm-1處的馬來(lái)酸酐不對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰和對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰,由此可以證實(shí)苯乙烯和馬來(lái)酸酐已經(jīng)成功接枝到硅球表面。與Sil-SMA相比,Sil-SMA-MME固定相紅外光譜圖中1 735 cm-1處吸收峰變小,證明部分酸酐基團(tuán)已與MME發(fā)生?；磻?yīng),可進(jìn)一步驗(yàn)證Sil-SMA-MME固定相制備成功。

圖2 SiO2、Sil-SH、Sil-SMA和Sil-SMA-MME的(a)熱重分析圖和(b)紅外光譜圖

2.2 Sil-SMA-MME色譜柱的保留機(jī)制

Sil-SMA-MME固定相表面的酸酐基團(tuán)經(jīng)修飾后又引入羧酸基團(tuán),因此Sil-SMA-MME色譜柱可具有親水保留特性。選取氰基乙酰胺、苯甲酰胺、2-碘乙酰胺、對(duì)氨基苯甲酰胺和煙酰胺對(duì)Sil-SMA-MME色譜柱的保留機(jī)制進(jìn)行考察。從圖3中可以看出,Sil-SMA-MME色譜柱在高比例乙腈的流動(dòng)相系統(tǒng)中可以很好地保留5種酰胺類物質(zhì)。當(dāng)流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)從95%下降到70%時(shí),5種物質(zhì)的保留逐漸減弱,表現(xiàn)出典型的親水作用色譜保留機(jī)制。

圖3 流動(dòng)相中乙腈體積分?jǐn)?shù)對(duì)親水性酰胺類物質(zhì)保留的影響

2.3 Sil-SMA-MME色譜柱的分離性能考察

2.3.1分離酰胺類化合物

選取5種酰胺類小分子物質(zhì)對(duì)Sil-SMA-MME色譜柱的分離性能進(jìn)行考察。圖4為氰基乙酰胺、2-碘乙酰胺、苯甲酰胺、對(duì)氨基苯甲酰胺和煙酰胺的分離色譜圖。以乙腈-水(96∶4, v/v)為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫,5種物質(zhì)在Sil-SMA-MME色譜柱中色譜峰形良好,其最高柱效達(dá)90 900 N/m(圖4a)。采用SiO2-NH2同樣分離了上述5種物質(zhì),在相同的流動(dòng)相條件下,SiO2-NH2色譜柱對(duì)于酰胺類物質(zhì)的保留更弱,2-碘乙酰胺和苯甲酰胺的色譜峰完全重疊(圖4b)。進(jìn)一步調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例,使保留時(shí)間最長(zhǎng)的煙酰胺與其在Sil-SMA-MME色譜柱上的保留時(shí)間一致,此時(shí),2-碘乙酰胺和苯甲酰胺依舊無(wú)法分離(圖4c)。這說(shuō)明所制備的Sil-SMA-MME色譜柱可提供更高的分離選擇性。

圖4 酰胺類物質(zhì)在(a)Sil-SMA-MME色譜柱和(b, c)SiO2-NH2柱中的分離色譜圖

2.3.2分離核苷/核酸堿基類化合物

進(jìn)一步選用親水性的核苷/核酸堿基類物質(zhì)考察了Sil-SMA-MME色譜柱的分離性能。使用乙腈-水(94∶6, v/v)作為流動(dòng)相對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行洗脫,在8 min內(nèi)尿苷、尿嘧啶和肌苷可在Sil-SMA-MME色譜柱上達(dá)到基線分離,其最高柱效可達(dá)到79 300 N/m(圖5a)。同樣采用SiO2-NH2對(duì)以上3種物質(zhì)進(jìn)行分離。在相同的流動(dòng)相條件下,SiO2-NH2色譜柱對(duì)于核苷/核酸堿基類物質(zhì)的保留更強(qiáng),在15 min內(nèi)只有尿嘧啶出峰(圖5b)。進(jìn)一步調(diào)節(jié)流動(dòng)相中乙腈和水的比例,選用乙腈-水(60∶40, v/v)作為流動(dòng)相,此時(shí)肌苷與其在Sil-SMA-MME色譜柱上的保留時(shí)間一致,但尿嘧啶和尿苷的分離度僅為1.62(圖5c)。

圖5 核苷/核酸堿基類物質(zhì)在(a)Sil-SMA-MME色譜柱和(b, c)SiO2-NH2柱中的分離色譜圖

2.3.3分離苯酚類化合物

選取了4種苯酚類小分子物質(zhì)對(duì)Sil-SMA-MME色譜柱的分離性能進(jìn)行考察。圖6a為對(duì)乙酰氨基酚、對(duì)甲酚、對(duì)氯苯酚和4-叔辛基苯酚在Sil-SMA-MME色譜柱上的分離色譜圖。以流動(dòng)相乙腈-水(40∶60, v/v)進(jìn)行洗脫,4種物質(zhì)在6 min內(nèi)可實(shí)現(xiàn)基線分離,其最高柱效可達(dá)到60 000 N/m。采用SiO2-NH2對(duì)以上4種物質(zhì)進(jìn)行分離,在相同的流動(dòng)相條件下,SiO2-NH2色譜柱對(duì)于苯酚類物質(zhì)的保留更弱,其中對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)甲酚的色譜峰完全重疊,對(duì)氯苯酚和4-叔辛基苯酚也無(wú)法達(dá)到基線分離(圖6b)。調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例,使保留時(shí)間最長(zhǎng)的4-叔辛基苯酚與其在Sil-SMA-MME色譜柱上保留時(shí)間一致,此時(shí)4種物質(zhì)可以達(dá)到基線分離(圖6c),但兩種色譜柱表現(xiàn)出了不同的分離選擇性。

圖6 苯酚類物質(zhì)在(a)Sil-SMA-MME色譜柱和(b, c)SiO2-NH2柱中的分離色譜圖

2.4 Sil-SMA-MME色譜柱用于分離磷脂樣品

2.4.1Sil-SMA-MME色譜柱用于分離磷脂標(biāo)準(zhǔn)品

基于Sil-SMA-MME色譜柱良好的分離選擇性,進(jìn)一步考察了Sil-SMA-MME色譜柱對(duì)磷脂的分離性能。首先選擇不同類別的磷脂DPPS、DOPC和DPPE考察其分離選擇性。如圖7a所示,選用流動(dòng)相為A-B(80∶20, v/v),其中,A相為正己烷-異丙醇-水-冰乙酸-三乙胺(5∶81∶14∶1.5∶0.08, v/v/v/v/v), B相為甲醇,3類磷脂DPPS、DOPC和DPPE可實(shí)現(xiàn)基線分離,且峰形良好。

圖7 (a)不同磷脂類別和(b)不同PC分子種類在Sil-SMA-MME色譜柱中的分離色譜圖

進(jìn)一步采用不同的PC分子LysoPC、DMPC、DSPC和DPPC評(píng)價(jià)了Sil-SMA-MME色譜柱對(duì)不同種類磷脂的分離選擇性。如圖7b所示,選用流動(dòng)相為A-B(25∶75, v/v),其中A相為水,B相為甲醇-乙腈(8∶1, v/v),具有不同酰基側(cè)鏈的4種PC在10 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了基線分離。以上結(jié)果顯示,所制備的Sil-SMA-MME色譜柱可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)磷脂類別和PC種類的分離分析。

2.4.2Sil-SMA-MME色譜柱用于分離復(fù)雜磷脂樣品

南極磷蝦油富含磷脂態(tài)的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等Omega-3多不飽和脂肪酸,具有良好的生物活性,如調(diào)節(jié)血脂、緩解肥胖癥并可提高人體免疫力和減輕腦老化等。磷蝦油磷脂主要由PC、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)組成,其中PC為主要成分。采用南極磷蝦油磷脂提取物考察了Sil-SMA-MME色譜柱對(duì)于復(fù)雜磷脂樣品的分離性能。如圖8a所示,選用流動(dòng)相為A-B(25∶75, v/v),其中A相為水,B相為甲醇-乙腈(8∶1, v/v), Sil-SMA-MME色譜柱可以在10 min內(nèi)分離出6個(gè)主要的色譜峰。

圖8 (a)南極磷蝦油磷脂提取物和(b)人血清磷脂提取物在Sil-SMA-MME色譜柱中的分離色譜圖

血清磷脂主要包括4部分----卵磷脂、溶血磷脂、神經(jīng)磷脂和腦磷脂。血清磷脂的組成發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致多種心血管類疾病的發(fā)生,例如肥胖代謝綜合征和糖尿病。另外,心力衰竭、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等疾病的發(fā)生也與體內(nèi)磷脂的代謝密切相關(guān)?；诖?進(jìn)一步采用人血清磷脂提取物考察了Sil-SMA-MME色譜柱對(duì)復(fù)雜磷脂樣品的分離性能。如圖8b所示,選用流動(dòng)相為A-B(25∶75, v/v),其中A相為水,B相為甲醇-乙腈(8∶1, v/v), 10 min內(nèi)可以觀察到4個(gè)主要色譜峰。顯然,Sil-SMA-MME色譜柱對(duì)復(fù)雜的磷脂樣品顯示了一定的分離潛能。

3 結(jié)論

本研究以苯乙烯和馬來(lái)酸酐為單體,進(jìn)一步結(jié)合MME·HCl開環(huán)修飾,制備了Sil-SMA-MME色譜固定相。填充Sil-SMA-MME色譜柱具有典型的親水作用色譜保留機(jī)制,并且對(duì)于酰胺類和核苷/核酸堿基類以及苯酚類小分子物質(zhì)顯示了良好的分離選擇性。此外,通過調(diào)節(jié)不同的色譜分離條件,Sil-SMA-MME色譜柱可以實(shí)現(xiàn)不同磷脂類別和PC種類的有效分離,并且對(duì)于復(fù)雜的南極磷蝦油磷脂和人血清磷脂樣品顯示了一定的分離潛力。本研究為開發(fā)新型磷脂分離色譜固定相材料提供了新的可行性思路。