針刺大椎時(shí)機(jī)選擇對(duì)發(fā)熱大鼠體溫及下丘腦PGE2 含量變化的影響

吳 限，張 磊，王 悅

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院針灸科，哈爾濱 150040）

發(fā)熱是一種常見(jiàn)的疾病，新型冠狀病毒肺炎以發(fā)熱為主要癥狀之一。目前，西醫(yī)主要使用口服或注射退燒藥、抗生素治療發(fā)熱[1]，中醫(yī)通過(guò)針刺特定穴位治療發(fā)熱，具有廉價(jià)、便捷、見(jiàn)效快等優(yōu)勢(shì)。大椎在人體第7 頸椎棘突下凹陷中，主治外感熱病，是針灸治療發(fā)熱的要穴，退熱作用明顯[2-4]。前列腺素E2（PGE2）是公認(rèn)的發(fā)熱過(guò)程中的重要脂質(zhì)介質(zhì)之一[5]。關(guān)于大椎退熱的最佳針刺時(shí)機(jī)尚無(wú)系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究在不同時(shí)機(jī)針刺大椎對(duì)發(fā)熱大鼠體溫和下丘腦PGE2 含量變化的影響，探求大椎退熱的最佳針刺時(shí)機(jī)及退熱作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠450 只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。

1.2 主要藥物與儀器

干酵母粉（安琪酵母股份有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)：420528010005）；前列腺素E2（PGE2）競(jìng)爭(zhēng)法ELISA 試劑盒（聯(lián)科，貨號(hào)：EK8103）；華佗牌一次性針灸針，規(guī)格0.30 mm×13 mm（蘇州醫(yī)療用品長(zhǎng)有限公司）；電子天平，LS-T302（蘭思儀器有限公司）；電子體溫計(jì)，DT-101A（廣東天際電器有限公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模 將450 只SD 大鼠（雌雄各半）飼養(yǎng)于（24±1）℃、（55±10）%相對(duì)濕度和12 h 明暗循環(huán)的房間中，提供充足食物與飲用水源，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，每日測(cè)量肛溫3 次，單次體溫高于38℃或3 次肛溫波動(dòng)大于0.3℃者淘汰。實(shí)驗(yàn)前10 h 禁食，可自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，每只大鼠測(cè)量肛溫3 次，每次間隔0.5 h，取3 次肛溫平均值為大鼠基礎(chǔ)體溫。隨機(jī)選取10 只作為空白對(duì)照組（標(biāo)記為A），剩余大鼠進(jìn)行建模：背部皮下注射20% 酵母懸液10 mL·kg-1，注射后按壓注射部位1 min 以防液體外滲，建立大鼠發(fā)熱模型。建模后每小時(shí)測(cè)量肛溫1 次，共測(cè)量4 次。4 h 后大鼠體溫較基礎(chǔ)體溫升高0.8℃以上者視為造模成功。

1.3.2 分組設(shè)置 根據(jù)對(duì)常用大鼠發(fā)熱模型的研究[6-7]，SD 大鼠在皮下注射20%干酵母懸液后，體溫會(huì)在經(jīng)歷短時(shí)間的下降后迅速上升，于6 ～7 h到達(dá)體溫峰值并進(jìn)入峰值平臺(tái)期，10 h 時(shí)出現(xiàn)第2個(gè)峰值。本實(shí)驗(yàn)據(jù)此設(shè)置4 個(gè)治療組，分別選擇以大鼠發(fā)熱的體溫上升期、體溫到達(dá)波峰前1h、體溫到達(dá)波峰時(shí)、峰值平臺(tái)期作為針刺時(shí)機(jī)。將成功建模的大鼠隨機(jī)分為B ～G 組。

A 組：空白對(duì)照組（10 只），正常飼養(yǎng)，不做任何處理；B 組：模型對(duì)照組（90 只），建模成功后正常飼養(yǎng)；C 組：治療1 組（90 只），建模成功后即刻針刺大椎；D 組：治療2 組（80 只），建模成功后1 h 針刺大椎；E 組：治療3 組（70 只），建模成功后2 h 針刺大椎；F 組：治療4 組（60 只），建模成功后3 h 針刺大椎；G 組：非經(jīng)非穴組（10只），建模成功后即刻針刺大椎旁開(kāi)0.5 cm 處。

1.3.3 取穴與針刺方法 1）取穴：參照《常用動(dòng)物針灸穴位圖譜》，同時(shí)結(jié)合模擬人體經(jīng)穴并比較解剖學(xué)方法選取大椎：第7 頸椎與第1 胸椎間，背部正中。2）針刺方法：選取大椎，針尖向上斜刺0.3 cm，留針30 min，每15 min 行針1 次。行針時(shí)用捻轉(zhuǎn)瀉法：大拇指作用力向后時(shí)用力捻轉(zhuǎn)，然后輕力向前退回，捻轉(zhuǎn)幅度360°，頻率每分鐘60 次，持續(xù)捻針l min。

1.3.4 數(shù)據(jù)測(cè)量 各組在建模成功后0.5 ～9 h，每0.5 h 隨機(jī)挑選5 只大鼠進(jìn)行肛溫測(cè)量。A 組最后1個(gè)時(shí)間點(diǎn)和B 組所有時(shí)間點(diǎn)和C ～F 組針刺后所有時(shí)間點(diǎn)所取的大鼠，在測(cè)量肛溫后斷頭處死，取下丘腦液氮速凍，-80 ℃凍存。下丘腦PGE3 含量測(cè)定：提取實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織的樣本，加入生理鹽水，制成10% 腦勻漿，離心，分離取上清液，-20℃ 冰箱保存待測(cè)。按照檢測(cè)說(shuō)明書(shū)，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)（ELISA）法測(cè)定大鼠腦組織上清液中的PGE2 含量。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察各組體溫與PGE2 含量變化情況，比較各組退熱起效時(shí)間和解熱時(shí)間：退熱起效時(shí)間為針刺治療開(kāi)始后到體溫下降0.5℃以上所需時(shí)間，解熱時(shí)間為從針刺大椎治療開(kāi)始到體溫下降到正常范圍所需時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組內(nèi)比較用重復(fù)測(cè)量資料方差分析；組間比較用單因素方差分析；兩變量間的關(guān)系用相關(guān)性分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)發(fā)熱大鼠體征的影響

大鼠在注射20%酵母懸液后出現(xiàn)短暫的四肢及口唇蒼白，后隨體溫上升而逐漸出現(xiàn)蜷縮和四肢、口唇、耳部的發(fā)紅發(fā)燙，至體溫顯著升高時(shí)出現(xiàn)呼吸急促、豎毛、肢體末端深紅發(fā)燙。治療組進(jìn)行針刺治療后，大鼠各種發(fā)熱體征均有明顯減弱，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)已基本恢復(fù)至正常狀態(tài)。

2.2 對(duì)發(fā)熱大鼠體溫的影響

模型對(duì)照組在注射20% 酵母懸液6 h 后到達(dá)體溫峰值并進(jìn)入平臺(tái)期，注射后10 h 出現(xiàn)第2 個(gè)峰值，與預(yù)期的大鼠發(fā)熱模型相符。各治療組在針刺大椎穴治療后均對(duì)大鼠體溫產(chǎn)生了不同程度的影響。除空白對(duì)照組外，各組建模成功時(shí)體溫與基礎(chǔ)體溫比較均顯著升高（P＜0.05），提示建模成功。見(jiàn)表1。

表1 各組建模后大鼠體溫比較（±s ，n= 5） ℃

注：與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05

組別 基礎(chǔ)體溫 建模成功時(shí) 建模1.0 h建模1.5 h建模2.5 h建模3.5 h建模5.0 h建模7.0 h建模8.0 h A 組37.32±0.06 37.32±0.06 37.32±0.09 37.32±0.06 37.33±0.08 37.32±0.08 37.32±0.06 37.32±0.06 37.31±0.07 B 組37.34±0.08 38.52±0.13# 38.98±0.11# 39.30±0.12# 39.53±0.11# 39.39±0.11# 39.34±0.11# 39.17±0.08# 38.91±0.11#C 組37.34±0.10 38.44±0.15△38.68±0.11△38.81±0.17△38.79±0.16△38.61±0.13△38.59±0.11△38.08±0.16△37.43±0.14△D 組37.30±0.09 38.47±0.14△38.98±0.17△39.05±0.16△38.91±0.12△38.44±0.15△37.72±0.14△37.34±0.10△37.31±0.09△E 組 37.35±0.10 38.50±0.12△38.97±0.15△39.29±0.20△39.06±0.19△38.20±0.22△37.36±0.10△37.37±0.11△37.35±0.12△F 組 37.34±0.11 38.47±0.16△39.02±0.15△39.34±0.15△39.53±0.17△38.98±0.11△38.31±0.11△37.37±0.12△37.35±0.11△G 組37.36±0.07 38.51±0.10△38.98±0.10△39.32±0.12△39.50±0.10△39.39±0.11△39.38±0.07△39.20±0.11△38.84±0.07△

與空白對(duì)照組進(jìn)行比較：治療1 組在建模8.0 h及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），治療2 組在建模7.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），治療3 組在建模5.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），治療4 組在建模7.0 h 及之后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示治療組均可使發(fā)熱大鼠體溫降至正常水平，各組解熱時(shí)間：治療3 組（3 h）＜治療4 組（4 h）＜治療2 組（6 h）＜治療1 組（8 h）。

與模型對(duì)照組進(jìn)行比較：治療1 組體溫從建模1.0 h，即治療1.0 h開(kāi)始均低于模型對(duì)照組，治療2組、治療3 組、治療4 組體溫分別從建模1.5 h、建模2.5 h、建模3.5 h，即每組治療0.5 h 開(kāi)始低于模型對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），非經(jīng)非穴組在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示4 個(gè)治療組均具有抑制發(fā)熱大鼠體溫升高的作用，治療1 組的抑制作用要慢于其他組，非經(jīng)非穴組無(wú)抑制作用。

治療組體溫變化趨勢(shì)：治療1 組體溫在針刺治療后仍然處于上升趨勢(shì)，于治療2.0 h 后到達(dá)峰值并進(jìn)入1 個(gè)類(lèi)似模型對(duì)照組的峰值平臺(tái)期，于治療6.0 h出現(xiàn)第2 個(gè)峰值，在此期間始終顯著高于治療開(kāi)始時(shí)體溫（P＜0.05），從治療6.5 h 起低于治療開(kāi)始時(shí)體溫并持續(xù)降低至正常水平（P＜0.05）：治療2組體溫在治療后先上升1.0 h 到達(dá)峰值，后持續(xù)降低，在治療2.0 h 及之后顯著低于治療開(kāi)始時(shí)體溫（P＜0.05），在治療5.0 h 出現(xiàn)1 個(gè)回升的小波峰，之后降至正常體溫；治療3 組和治療4 組體溫從治療0.5 h 起持續(xù)降低至正常水平，并顯著低于治療開(kāi)始時(shí)體溫（P＜0.05），其中治療3 組在0.5 h 的體溫降低值已超過(guò)0.5℃，達(dá)到退熱起效時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)，治療4 組未達(dá)到。因此退熱起效時(shí)間治療3 組＜治療4組＜治療2 組＜治療1 組。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠治療后體溫比較（±s ，n= 5） ℃

表2 各組大鼠治療后體溫比較（±s ，n= 5） ℃

注：與A 組比較，# P ＜0.05

組別 治療開(kāi)始時(shí)治療0.5h治療1.0 h治療2.0 h治療5.0 h治療6.0 h治療6.5 h A 組 37.32±0.0637.31±0.0837.32±0.0937.31±0.0637.32±0.0637.32±0.0637.30±0.05 C 組 38.44±0.1538.54±0.12#38.68±0.11#38.87±0.16#38.59±0.11#38.69±0.11#38.39±0.14#D 組 38.98±0.1739.05±0.16#39.11±0.13#38.71±0.12#37.70±0.16#37.34±0.10#37.30±0.09#E 組39.57±0.1939.06±0.19#38.64±0.18#37.83±0.17#37.37±0.11#37.35±0.12#37.36±0.11#F 組39.40±0.1338.98±0.11#38.73±0.11#38.31±0.11#37.35±0.11#37.34±0.14#

2.3 對(duì)發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2含量的影響

治療1 組PGE2 含量從建模1.0 h 起始終低于模型對(duì)照組（P＜0.05），于建模8.0 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療2 組PGE2 含量從建模2.0 h 起始終低于模型對(duì)照組（P＜0.05），于建模7 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療3 組PGE2 含量從建模2.5 h 起始終低于模型對(duì)照組（P＜0.05），于建模5 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；治療4 組PGE2 含量從建模3.5 h 起始終低于模型對(duì)照組（P＜0.05），于建模7 h 和空白對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。提示治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2 的升高，并降至正常水平，與大鼠體溫的變化趨勢(shì)相似。見(jiàn)表3。

表3 建模后大鼠下丘腦PGE2 含量變化比較（±s ，n= 5） pg ·mgprot-1

表3 建模后大鼠下丘腦PGE2 含量變化比較（±s ，n= 5） pg ·mgprot-1

注：與B 組比較，# P ＜0.05

組別建模1.0 h建模2.0 h建模2.5 h建模3.5 h建模5.0 h建模7.0 h建模8.0 h B 組60.42±5.1370.92±4.5968.94±3.4767.64±4.6865.00±4.6167.78±4.0656.71±4.02 C 組48.17±4.67#55.42±4.48#53.87±4.27#50.52±4.39#46.78±4.01#47.59±4.57#34.09±3.93#D 組62.78±4.68#55.60±4.61#48.29±5.98#41.67±3.21#35.47±5.42#29.90±4.41#E 組56.61±5.05#42.45±3.84#35.98±5.73#29.55±5.21#31.42±5.04#F 組58.82±4.52#49.12±6.13#36.08±4.88#31.18±3.60#

2.4 發(fā)熱大鼠體溫與下丘腦PGE2含量變化關(guān)系

為進(jìn)一步探求體溫與PGE2 含量之間的關(guān)系，選擇數(shù)據(jù)完整的C 組建模后體溫與對(duì)應(yīng)PGE2 進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，R2= 0.842 8，見(jiàn)圖1。提示發(fā)熱大鼠體溫與下丘腦PGE2 含量具有十分顯著的正相關(guān)關(guān)系。

圖1 建模后C 組大鼠體溫與下丘腦中PGE2 散點(diǎn)圖分析

3 討論

外感發(fā)熱為中醫(yī)常見(jiàn)病癥，因感受六淫之邪或疫癘之氣，臟腑功能失調(diào)、陰陽(yáng)失衡而致病，又稱(chēng)“發(fā)熱”“寒熱”“壯熱”[8]。干酵母致熱大鼠其體溫先短暫下降，而后迅速上升至峰值并進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的峰值平臺(tái)期的特征，符合中醫(yī)邪襲衛(wèi)表證和氣分熱證的病理機(jī)制[9]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇干酵母致熱大鼠作為研究對(duì)象，根據(jù)其發(fā)熱階段進(jìn)行分組，以實(shí)現(xiàn)在不同時(shí)機(jī)對(duì)大椎進(jìn)行針刺治療觀察發(fā)熱大鼠的體溫變化。

針刺對(duì)發(fā)熱具有良好的治療作用[10-12]，大椎是治療發(fā)熱的要穴。大椎始見(jiàn)于《素問(wèn)·骨空論篇》，為人體督脈穴，也是手足三陽(yáng)經(jīng)的交會(huì)穴，居上屬陽(yáng)，有向上向外之性，有振奮陽(yáng)氣之作用，因此針刺大椎有調(diào)節(jié)全身陽(yáng)氣，解表退熱的作用[13]。本研究結(jié)果表明，無(wú)論在哪個(gè)階段對(duì)大椎穴進(jìn)行針刺治療均可起到抑制發(fā)熱作用，并解熱至大鼠正常體溫，充分證實(shí)了大椎穴其良好的退熱作用，也與近些年來(lái)對(duì)大椎穴退熱效應(yīng)的研究成果相符[14-16]。非經(jīng)非穴組并無(wú)抑制大鼠發(fā)熱的作用，驗(yàn)證了穴位特異性的存在。穴位特異性是指不同穴位對(duì)機(jī)體的治療具有不同的特異效應(yīng)，是針灸選穴基本原則之一，對(duì)穴位特異性進(jìn)行的相關(guān)血流動(dòng)力學(xué)研究亦證明了此特性的存在[17-18]。通過(guò)對(duì)4 個(gè)治療組大鼠體溫變化的分析可知：治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦PGE2升高，并降至正常水平，與大鼠體溫的變化趨勢(shì)相似。

本實(shí)驗(yàn)中各治療組均可抑制發(fā)熱大鼠下丘腦中PGE2 含量升高，并使其降至正常水平，與對(duì)大鼠體溫的抑制作用相似。為進(jìn)一步探求體溫與PGE2含量之間的關(guān)系，選擇了數(shù)據(jù)完整的C 組建模后體溫與對(duì)應(yīng)PGE2 進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示體溫與PGE2 含量成明顯正相關(guān)，即體溫隨PGE2 含量的升高而上升，隨其降低而下降（R2= 0.842 8），提示建模后不同時(shí)間的發(fā)熱大鼠體溫與下丘腦PGE2 含量具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此可推斷不同時(shí)間對(duì)發(fā)熱大鼠大椎行針刺后的退熱機(jī)制可能是通過(guò)降低包括PGE2在內(nèi)的中樞性發(fā)熱介質(zhì)的釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

《素問(wèn)·針解篇》[19]曰：“補(bǔ)瀉之時(shí)者，與氣開(kāi)闔相合也?！奔匆罁?jù)氣血盛衰來(lái)進(jìn)行針刺補(bǔ)瀉。氣血迎時(shí)為盛，去時(shí)為衰，本實(shí)驗(yàn)中大鼠體溫到達(dá)波峰時(shí)乃氣血最盛之時(shí)，根據(jù)子午流注法“逢時(shí)而刺”“瀉則乘其盛”思想，此時(shí)進(jìn)行大椎的瀉法針刺療效顯著。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步探討大椎退熱機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)，并為科學(xué)解釋子午流注針?lè)ㄌ峁┝怂悸放c啟發(fā)。

綜上所述，在不同時(shí)機(jī)針刺發(fā)熱大鼠大椎穴均有退熱療效，可使大鼠體溫恢復(fù)正常，以體溫到達(dá)峰值時(shí)進(jìn)行針刺退熱效果最佳。針刺退熱具有穴位特異性。針刺發(fā)熱大鼠大椎可能是通過(guò)抑制PGE2等內(nèi)源性脂類(lèi)介質(zhì)的釋放實(shí)現(xiàn)退熱機(jī)制。