基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討補(bǔ)腎活血湯治療中樞性老年性聾的機(jī)制

周穎東，張夢(mèng)嫻，王青玲，康浩然，郭向東 （. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

老年性聾（age-related hearing loss，ARHL）是隨著衰老而發(fā)生的進(jìn)行性聽(tīng)力損失。在發(fā)達(dá)國(guó)家，約有1/3的65歲老年人存在不同程度的聽(tīng)力下降，這不僅影響他們的生活質(zhì)量，還會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知障礙[1]。目前認(rèn)為[2]，老年性聾是一種由噪音暴露、遺傳等多因素共同作用而導(dǎo)致的疾病，其分子機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激、凋亡、自噬等，病理改變包括毛細(xì)胞丟失、血管紋萎縮、螺旋神經(jīng)節(jié)及聽(tīng)覺(jué)中樞的退行性變，而由聽(tīng)覺(jué)中樞退行性變導(dǎo)致的聽(tīng)力下降稱(chēng)為中樞性老年性聾。盡管抗氧化劑在延緩耳蝸毛細(xì)胞丟失方面取得了一定的進(jìn)展，但多數(shù)抗氧化劑僅針對(duì)單一靶點(diǎn)發(fā)揮作用，其臨床療效有待確認(rèn)，并且有關(guān)中樞性老年性聾治療藥物的研究較少。由于老年性聾的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，單一針對(duì)耳蝸的靶向治療難以在其治療中取得較好的療效，因此需要尋找包括且不限于針對(duì)聽(tīng)皮層的綜合治療方案。

中醫(yī)認(rèn)為，耳與腦相通，腎精通過(guò)腦髓來(lái)滋養(yǎng)耳[3]?！夺t(yī)林改錯(cuò)》中對(duì)耳聾的描述，氣血瘀滯阻塞耳與腦連接的通道是導(dǎo)致耳聾的原因。這些理論將腎-腦-耳-氣血聯(lián)系在一起，也成為補(bǔ)腎活血法治療老年性聾的理論基礎(chǔ)。補(bǔ)腎活血湯（BushenHuoxueDecoction，BSHXD）由當(dāng)歸、獨(dú)活、紅花、熟地黃、酒萸肉、醋沒(méi)藥、鹽菟絲子、杜仲、酒蓯蓉、枸杞子、鹽補(bǔ)骨脂等11 種中藥組成，在臨床上治療老年性聾具有較好的療效，我們推測(cè)補(bǔ)腎活血湯能夠通過(guò)延緩聽(tīng)皮層的衰老來(lái)治療老年性聾，但該機(jī)制推論尚缺乏現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是使用生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，整合疾病相關(guān)基因、預(yù)測(cè)藥物治療疾病潛在靶點(diǎn)及通路，從而認(rèn)識(shí)藥物作用機(jī)制的一種新型藥物研發(fā)模式，現(xiàn)已成為闡釋中藥復(fù)方科學(xué)依據(jù)的有效途徑，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可最大限度地發(fā)揮中醫(yī)藥多化合物、多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)[4]。在本研究中，我們使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選補(bǔ)腎活血湯與中樞性老年性聾的共同靶點(diǎn)，利用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本質(zhì)論（Gene Ontology，GO）分析這些分子的生物過(guò)程和信號(hào)通路，通過(guò)蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析篩選出核心靶點(diǎn)，并選取自然衰老的C57BL/6J 小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究旨在將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，系統(tǒng)探討補(bǔ)腎活血湯治療中樞性老年性聾的潛在分子機(jī)制，為老年性聾的防治提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 補(bǔ)腎活血湯與老年性聾共同靶點(diǎn)獲取 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.tcmip.cn/ETCM）、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）檢索并篩選補(bǔ)腎活血湯活性成分和作用靶點(diǎn)。活性成分滿(mǎn)足口服生物利用度≥30%、類(lèi)藥性≥0.18 和血腦屏障≥-0.3 條件。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）對(duì)靶點(diǎn)名稱(chēng)規(guī)范化。3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果合并且去除重復(fù)值。在Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.disgenet.org）輸入關(guān)鍵詞“age related hearing loss”“presbycusis”，檢索老年性聾病理機(jī)制靶點(diǎn)，結(jié)果合并且去除重復(fù)值。使用在線(xiàn)工具Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）獲得補(bǔ)腎活血湯與老年性聾共同靶點(diǎn)，并保存韋恩圖。通過(guò)Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 GO功能與KEGG通路富集分析 將補(bǔ)腎活血湯與老年性聾共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進(jìn)行GO 功能與KEGG 通路富集分析。使用微生信在線(xiàn)工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 條形圖與KEGG 氣泡圖。

1.1.3 PPI 分析與核心基因的篩選 將補(bǔ)腎活血湯與老年性聾共同靶點(diǎn)導(dǎo)入在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)STRING（https://string- db.org/）進(jìn)行PPI 分析， 并將結(jié)果輸入Cytoscape 3.9.0 軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。我們選取degree（度值）前十位的基因作為核心靶點(diǎn)進(jìn)一步分析，并使用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制核心靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠，30周齡28只、8周齡7 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（30±2）g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：2022114782，于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0027，飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫（24±2）℃，濕度55%～68%，12 h 明暗循環(huán)，充足的食物和水。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理編號(hào)為：DWLL202106202。

1.2.2 藥物及試劑 補(bǔ)腎活血湯配方顆粒由熟地黃18 g、菟絲子18 g、補(bǔ)骨脂18 g、獨(dú)活6 g、當(dāng)歸6 g、杜仲6 g、肉蓯蓉6 g、枸杞子6 g、山萸肉6 g、沒(méi)藥6 g、紅花3 g組成，均購(gòu)自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。PI3K 抑制劑LY294002，批號(hào)：HY-10108，美國(guó)MCE 公司；Bax（批號(hào)：GTX32465）、Caspase-3（批號(hào)：GTX110543），美國(guó)Genetex 公司；PI3K（批號(hào)：17366）、AKT（批號(hào)：9272）、mTOR（批號(hào)：2983）、p-PI3K（批號(hào)：4257）、p-AKT（批號(hào)：4060）、p-mTOR（批號(hào)：5536），美國(guó)Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參抗體GAPDH，批號(hào)：GB12002，中國(guó)Servicebio 公司；Alexa Flour488，批號(hào)：111-545-003，美國(guó)Jackson 公司；一步法TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒，批號(hào)：KGA7062，中國(guó)凱基生物公司；總蛋白提取試劑盒（批號(hào)：BC3710-100T）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020），中國(guó)Solarbio公司。

1.2.3 主要儀器 MF52-M 熒光生物顯微鏡，廣州明美光電技術(shù)公司；JY-BMB石蠟包埋機(jī)，湖北錦源醫(yī)療科技有限公司；DYY-6D 電泳儀、DYCZ-24DH 電泳槽、WD9413C凝膠成像分析儀，北京六一公司。

1.2.4 動(dòng)物模型復(fù)制、分組及給藥方法 所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)選擇了自然衰老的30周齡C57BL/6J小鼠28只作為中樞性老年性聾小鼠模型，用聽(tīng)性腦干測(cè)試檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀57BL/6J 小鼠因其自身的基因缺陷在不加以特殊干預(yù)情況下即表現(xiàn)出加速衰老表型，是老齡化研究的常用動(dòng)物模型，在4月齡時(shí)即表現(xiàn)出明顯的聽(tīng)力損失，并隨年齡增長(zhǎng)進(jìn)一步加重[5]。將小鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)腎活血湯組、LY294002（LY）組、補(bǔ)腎活血湯+LY組，每組7只。根據(jù)人與小鼠體表面積折算等效劑量，補(bǔ)腎活血湯組以12.87 g·kg-1灌胃給藥[6]，LY組以1.5 g·kg-1PI3K 抑制劑LY294002腹腔注射給藥，補(bǔ)腎活血湯+LY 組予以等量補(bǔ)腎活血湯灌胃和LY294002 腹腔注射，模型組灌胃及腹腔注射等量生理鹽水，每日1 次，持續(xù)12周。對(duì)照組選用7只8周齡青年小鼠。

1.2.5 標(biāo)本采集與病理學(xué)檢測(cè) 小鼠深度麻醉后，頸椎脫臼法處死，迅速取出腦組織置于4%多聚甲醛中，4 ℃下固定過(guò)夜。石蠟包埋并連續(xù)切片。將石蠟切片常規(guī)烤片，二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水合，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，氨水堿化促藍(lán)，伊紅復(fù)染5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀(guān)察，根據(jù)海馬形態(tài)與位置定位聽(tīng)皮層區(qū)域并拍攝。

1.2.6 轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）染色 聽(tīng)皮層石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟和水合，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)。TdT酶反應(yīng)液室溫避光孵育60 min。Streptavidin-TRITC工作室溫避光孵育30 min， DAPI（1∶1 000）染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)10 min，封片，熒光生物顯微鏡拍攝，以ImageJ 1.53a軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)與分析。

1.2.7 免疫熒光染色檢測(cè)Caspase-3 蛋白表達(dá) 聽(tīng)皮層石蠟切片烤片、脫蠟和水合，檸檬酸鈉抗原修復(fù)。1%山羊血清封閉液室溫封閉30 min。一抗Caspase-3（1∶800）4 ℃孵育過(guò)夜。二抗Alexa Flour 488 Donkey anti-Rabbit（1∶500）避光孵育2 h，DAPI（1∶1 000）染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)10 min，封片，熒光生物顯微鏡拍攝，以ImageJ 1.53a進(jìn)行量化與分析。

1.2.8 免疫印跡（Western Blot，WB）法測(cè)定Bax、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、GAPDH 蛋白水平 參照?qǐng)D譜[7]快速分離聽(tīng)皮層組織，聽(tīng)皮層組織稱(chēng)質(zhì)量，冰上切碎、裂解并勻漿，離心收集上清液。檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液，以100 ℃、5 min變性。制膠，上樣（40 μg蛋白質(zhì)/孔），電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗Bax（1∶1 500）、Caspase-3（1∶5 000）；PI3K（1∶1 500）、AKT（1∶1 500）、mTOR（1∶1 500）、p-PI3K（1∶1 500）、p-AKT（1∶1 500）、p-mTOR（1∶1 500）、GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)山羊抗兔IgG 室溫孵育60 h，顯影。使用ImageJ 1.53a進(jìn)行量化與分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程見(jiàn)圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Figure 1 Experimental flow chart

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血湯與老年性聾共同靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過(guò)TCMSP、ETCM 和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并篩選獲得滿(mǎn)足條件的補(bǔ)腎活血湯活性成分219種，所有成分作用靶點(diǎn)去除重復(fù)項(xiàng)后共有1 583 個(gè)。通過(guò)Genecards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)總共獲得了8 968 個(gè)老年性聾相關(guān)靶點(diǎn)。將藥物的作用靶點(diǎn)與老年性聾相關(guān)靶點(diǎn)輸入在線(xiàn)工具Venny 2.1總共獲得了1 118個(gè)補(bǔ)腎活血湯-老年性聾共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2。將這些結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。

圖2 補(bǔ)腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點(diǎn)的Venn 圖Figure 2 Venn diagram of common targets of Bushen Huoxue Decotion（BSHXD） and age-related hearing loss（ARHL）

圖3 補(bǔ)腎活血湯（BSHXD）-活性成分-共同靶點(diǎn)-老年性聾（ARHL）相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 The interaction network of BSHXD-active compounds-common targets-ARHL

2.2 GO 功能和KEGG 通路富集分析通過(guò)GO功能標(biāo)注分析，共得到2 599 個(gè)GO 功能，包括1 947 個(gè)生化過(guò)程（BP），398個(gè)分子功能（MF）以及254個(gè)細(xì)胞組分（CC），見(jiàn)圖4。在BP中前10位包括：RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的負(fù)向調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、DNA 模板化、凋亡過(guò)程的負(fù)向調(diào)控、細(xì)胞增殖的正向調(diào)控、藥物反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞、細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控。KEGG分析顯示這些靶基因涉及205條信號(hào)通路，其中最重要的10條通路是代謝通路、癌癥通路、神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、神經(jīng)退行性變-多種疾病通路、鈣信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、阿爾茨海默病、癌癥蛋白多糖、PI3K-AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路，見(jiàn)圖5。

圖4 補(bǔ)腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點(diǎn)的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of common targets of BSHXD and ARHL

圖5 補(bǔ)腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點(diǎn)的KEGG 富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis of common targets of BSHXD and ARHL

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心靶點(diǎn)篩選在String 數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)一步分析了1 118個(gè)共同靶點(diǎn)的相互作用，并繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖6。degree 值排前10 位的基因分別是SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、JUN、HSP90AA1、HDAC1。再進(jìn)一步分析這些核心靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，見(jiàn)圖7；分析這些核心靶點(diǎn)與KEGG 富集分析結(jié)果的關(guān)系，見(jiàn)圖8。

圖6 補(bǔ)腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 6 PPI network of common targets of BSHXD and ARHL

圖7 補(bǔ)腎活血湯與老年性聾（ARHL）核心靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Figure 7 PPI network of core targets of BSHXD and ARHL

圖8 KEGG 前10 位通路與核心靶點(diǎn)的弦圖Figure 8 Chord diagram of top 10 KEGG pathways and core targets

2.4 聽(tīng)皮層HE 染色見(jiàn)圖9。對(duì)照組聽(tīng)皮層神經(jīng)元染色均勻，形態(tài)飽滿(mǎn)，排列整齊致密，細(xì)胞核呈類(lèi)圓形，細(xì)胞膜、核膜清楚。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元染色不均勻，排列雜亂、分布疏松，可見(jiàn)神經(jīng)元壞死，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜，核膜不清晰，層次散亂。與模型組比，補(bǔ)腎活血湯組神經(jīng)元排列較整齊，神經(jīng)元病理表現(xiàn)較模型組有明顯改善。LY 組與補(bǔ)腎活血湯+LY 組神經(jīng)元病理表現(xiàn)與補(bǔ)腎活血湯組近似。

圖9 各組小鼠聽(tīng)皮層病理變化（HE 染色，×400）Figure 9 Pathological changes of auditory cortex in mice of each group（HE staining，×400）

2.5 聽(tīng)皮層細(xì)胞Caspase-3 的免疫熒光檢測(cè)見(jiàn)圖10。在聽(tīng)皮層中Caspase-3主要在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。模型組小鼠聽(tīng)皮層Caspase-3（P＜0.001）表達(dá)明顯上調(diào)；相比于模型組，補(bǔ)腎活血湯組、LY 組、補(bǔ)腎活血湯+LY 組Caspase-3 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.001）；相對(duì)于補(bǔ)腎活血湯組和LY組，補(bǔ)腎活血湯+LY組的Caspase-3表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 聽(tīng)皮層Caspase-3免疫熒光與量化分析（ ±s，n=15）Figure 10 Immunofluorescence and quantitative analysis of Caspase-3 in auditory cortex（ ±s，n=15）

2.6 聽(tīng)皮層細(xì)胞TUNEL 染色見(jiàn)圖11。模型組小鼠聽(tīng)皮層細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多（P＜0.001）；而相比于模型組，補(bǔ)腎活血湯組、LY組與補(bǔ)腎活血湯組+LY 組凋亡陽(yáng)性細(xì)胞明顯降低（P＜0.001）；相對(duì)于補(bǔ)腎活血湯組和LY 組，補(bǔ)腎活血湯+LY 組的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低（P＜0.05）。

圖11 各組聽(tīng)皮層組織TUNEL 染色結(jié)果（ ±s，n=15）Figure 11 TUNEL staining of auditory cortex（ ±s，n=15）

2.7 WB 檢測(cè)聽(tīng)皮層PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)見(jiàn)圖12。模型組小鼠聽(tīng)皮層Bax、Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001）；而相比于模型組，補(bǔ)腎活血湯組、LY 組與補(bǔ)腎活血湯+LY組Bax、Caspase-3 表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001），但3 組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖12 各組聽(tīng)皮層組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)（ ±s，n=15）Figure 12 Expression of apoptosis-related proteins in auditory cortex（ ±s，n=15）

補(bǔ)腎活血湯干預(yù)后衰老C57 小鼠聽(tīng)皮層PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況見(jiàn)圖13。模型組小鼠聽(tīng)皮層p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）；而相比于模型組，補(bǔ)腎活血湯組、LY 組與補(bǔ)腎活血湯+LY 組可明顯下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達(dá)（P＜0.01，P＜0.001），但3組間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖13 各組聽(tīng)皮層組織PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白的表達(dá)（ ±s，n=15）Figure 13 Expression of proteins in PI3K /AKT /mTOR pathway in auditory cortex（ ±s，n=15）

3 討論

補(bǔ)腎活血湯是基于中醫(yī)耳腎相關(guān)理論、在臨床上能夠有效治療老年性聾的藥物。為了研究補(bǔ)腎活血湯能否通過(guò)延緩聽(tīng)皮層的衰老來(lái)治療老年性聾，我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索并篩選補(bǔ)腎活血湯中可透過(guò)血腦屏障的的活性成分和其對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，以及老年性聾相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 118個(gè)補(bǔ)腎活血湯與老年性聾的共同靶點(diǎn)。通過(guò)GO 與KEGG 富集分析進(jìn)一步分析這些共同靶點(diǎn)，共獲得2 599 個(gè)GO詞條與205條可能的信號(hào)通路。因此，我們有理由相信補(bǔ)腎活血湯可以通過(guò)多途徑對(duì)中樞性老年性聾有治療作用。通過(guò)PPI 分析獲得度值前10 位的核心靶點(diǎn)，在這些核心靶點(diǎn)中，SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、CTNNB1 和HDAC1 參與了細(xì)胞凋亡途徑，TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA和HSP90AA1參與了PI3K/AKT 信號(hào)通路。我們推測(cè)，補(bǔ)腎活血湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路和凋亡途徑起到對(duì)聽(tīng)皮層細(xì)胞的保護(hù)作用，并在補(bǔ)腎活血湯治療中樞性老年性聾中充當(dāng)重要角色。值得注意的是，有研究[8]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號(hào)通路參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，對(duì)此，我們進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

越來(lái)越多的研究[9-10]表明，細(xì)胞凋亡與阿爾茲海默癥、帕金森等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。也有證據(jù)[11]顯示，聽(tīng)皮層細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致中樞性老年性聾的主要原因之一。Bax是Bcl2蛋白家族中的促凋亡蛋白之一，正常情況下，Bax與Bcl2相互作用，不具有促凋亡活性，而在線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡內(nèi)在通路中，胞漿中的Bax被激活并轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體，引起線(xiàn)粒體外膜通透性改變，隨后引發(fā)一系列改變完成細(xì)胞程序性死亡的過(guò)程[12-13]。Caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶，其激活在神經(jīng)元凋亡中起著重要的作用，是線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑介導(dǎo)凋亡的共同終末剪切酶[14]。D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠衰老后聽(tīng)力明顯下降，并且在聽(tīng)皮層中發(fā)生細(xì)胞凋亡，伴隨著Caspase-3的明顯升高[15]。衰老小鼠聽(tīng)皮層中Bax、Caspase-3與細(xì)胞凋亡成正相關(guān)，抑制凋亡途徑可延緩年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失[16]。本研究的免疫熒光、TUNEL和WB結(jié)果顯示，衰老聽(tīng)皮層組織中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且Caspase-3、bax的表達(dá)增加。

PI3K/AKT 信號(hào)通路與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖密切相關(guān)，可被多種類(lèi)型的細(xì)胞應(yīng)激激活[17]，該通路也參與了聽(tīng)皮層的衰老過(guò)程。在D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠衰老模型中觀(guān)察到p-PI3K 與p-AKT 在聽(tīng)皮層內(nèi)上調(diào)[18]。我們的研究結(jié)果與此前的研究一致，衰老小鼠聽(tīng)皮層PI3K/AKT 信號(hào)通路被激活，使用補(bǔ)腎活血湯或PI3K抑制劑都能明顯抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/AKT 通路最重要的下游分子之一，受PI3K/AKT 信號(hào)調(diào)節(jié)。mTOR 的過(guò)度激活可加速衰老小鼠的聽(tīng)力損失，導(dǎo)致聽(tīng)皮層細(xì)胞凋亡的增加[19]，而注射mTOR抑制劑雷帕霉素可以對(duì)大腦皮層神經(jīng)元起保護(hù)作用，預(yù)防老年性聾[20]。最近研究[21]表明，抑制PI3K/AKT/mTOR 可延緩耳蝸毛細(xì)胞衰老。此外，PI3K/AKT 信號(hào)通路還可通過(guò)調(diào)控下游的Bax 和Caspase-3 而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[22]。與此前的研究一致，本研究的TUNEL 染色、免疫熒光和WB 的結(jié)果均顯示，衰老小鼠聽(tīng)皮層mTOR被激活，使用補(bǔ)腎活血湯或PI3K 抑制劑都能明顯抑制mTOR 的激活，并明顯降低衰老小鼠聽(tīng)皮層細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的含量。這說(shuō)明補(bǔ)腎活血湯對(duì)凋亡的抑制作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)補(bǔ)腎活血湯進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎活血湯可能是通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與抑制細(xì)胞凋亡途徑對(duì)聽(tīng)皮層衰老發(fā)揮治療作用，提示補(bǔ)腎活血湯有望成為一種治療中樞性老年性聾安全、有效的藥物。然而，我們的研究并沒(méi)有驗(yàn)證補(bǔ)腎活血湯的其他有效通路，有必要通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探索補(bǔ)腎活血湯治療中樞性老年性聾的作用機(jī)制。