葉酸修飾的克班寧聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物納米粒的制備及其體外抗腫瘤活性研究

潘 蕊，張海亮，趙笑雨，唐鈞澤，吳健銘，鄭永仁，程 欣, 2, 4*

葉酸修飾的克班寧聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物納米粒的制備及其體外抗腫瘤活性研究

潘 蕊1, 3, 4，張海亮1, 4，趙笑雨1，唐鈞澤1，吳健銘1，鄭永仁5，程 欣1, 2, 4*

1. 云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500 2. 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點實驗室，云南 昆明 650500 3. 云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500 4. 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室，云南 昆明 650500 5. 云南中醫(yī)藥大學科學技術(shù)處，云南 昆明 650500

制備葉酸修飾的克班寧聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物納米粒（folic acid modified crebanine polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid copolymer nanoparticles，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs），并考察其體外釋放及抗腫瘤活性。以克班寧為模型藥，用PEG-PLGA共聚物、葉酸等為材料，通過超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備FA-Cre@PEG-PLGA NPs，采用激光粒度儀、透射電子顯微鏡和熒光顯微鏡對FA-Cre@PEG-PLGA NPs的粒徑、ζ電位及形態(tài)進行表征，紫外光譜法測定并計算克班寧的包封率和載藥量，比較FA-Cre@PEG-PLGA NPs和克班寧原料藥72 h的體外釋放規(guī)律，通過溶血實驗考察二者生物學特性，CCK-8實驗考察兩者對正常肝L02細胞存活率的影響及對肝癌Bel-7402細胞體外增殖抑制作用。細胞劃痕法考察納米粒和原料藥對肝癌Bel-7402細胞遷移能力的影響。熒光顯微鏡觀察納米粒在不同時間點對肝癌Bel-7402細胞的攝取情況。FA-Cre@PEG-PLGA NPs的平均粒徑為（247.67±2.49）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.139±0.027，ζ電位為（?9.40±0.54）mV，透射電子顯微鏡下呈圓球狀核殼結(jié)構(gòu)，熒光顯微鏡下觀察納米粒，其氣化后明場呈藍色光點、暗場呈紅色光點。FA-Cre@PEG-PLGA NPs中克班寧的包封率為83.78%，載藥量為67.78%。FA-Cre@PEG- PLGA NPs與克班寧原料藥體外釋放均符合Ritger-Peppas模型；安全性評價結(jié)果顯示，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs相比于克班寧原料藥在50～300 μg/mL內(nèi)具有良好的生物相容性。FA-Cre@PEG-PLGA NPs對人正常肝L02細胞毒性較低，相比于克班寧原料藥有一定的安全性。體外增殖抑制結(jié)果顯示，兩者對Bel-7402腫瘤細胞的增殖抑制率均呈現(xiàn)出劑量依賴性和時間依賴性，且FA-Cre@PEG-PLGA NPs聯(lián)合超聲輻照后對Bel-7402肝癌細胞具有更強的殺傷作用。細胞劃痕實驗表明，克班寧原料藥、FA-Cre@PEG-PLGA NPs對Bel-7402腫瘤細胞遷移均有抑制作用，呈劑量依賴性，且納米粒聯(lián)合超聲抑制細胞遷移效果更顯著。細胞攝取實驗表明，相同時間下超聲聯(lián)合納米粒能有效增強腫瘤細胞的攝取。成功制得FA-Cre@PEG- PLGA NPs，而且體外具有良好的緩釋效果和抑瘤作用，為FA-Cre@PEG-PLGA NPs應用于肝癌的治療研究提供實驗依據(jù)。

葉酸；聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸；克班寧；納米粒；抗腫瘤活性；體外釋放；超聲乳化-溶劑揮發(fā)法

克班寧是一種異喹啉類阿樸菲型生物堿，提取自防己科千金藤屬植物云南地不容H. S. Lo的塊根中[1-2]。研究表明，克班寧具有鎮(zhèn)靜[3]、鎮(zhèn)痛[4]、抗炎[5-6]、抗心律失常[7]等作用。近期研究表明克班寧對多種腫瘤細胞有明顯的增殖抑制作用，如對人肝癌SMMC-7721細胞[8]、人肺腺癌A549細胞[9]、宮頸癌細胞系（KB-3-1和KB-V1）[10]等腫瘤細胞均具有明顯的細胞毒性。

作為一種新型的腫瘤治療方法，納米粒療法正逐漸應用于癌癥治療的臨床研究，納米顆粒具有良好的可降解性，可以被遞送到腫瘤組織，具有較強的高滲透長滯留效應（enhanced permeability and retention effect，EPR）[11-12]。聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸（polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid，PEG-PLGA）共聚物中含有親水段聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和兩親性的聚乳酸羥基乙酸（polylactic acid hydroxyacetic acid，PLGA）共聚物。PEG具有良好的親水性，能延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)和滯留時間并提高穩(wěn)定性。PLGA具有良好的生物相容性和安全性，在體內(nèi)可降解為無毒的聚乳酸[13]。用PEG修飾PLGA后，可提高PLGA的親水性，減少巨噬細胞的識別和吞噬，延長體內(nèi)的循環(huán)時間。有學者認為PEG也可通過EPR效應增加納米粒腫瘤蓄積[14-15]。葉酸是一種小分子維生素，具有相對分子質(zhì)量小、無免疫原型、價廉易得、與受體親和力強等優(yōu)點，可與葉酸受體（folate receptor，F(xiàn)R）尤其FRα亞型在體內(nèi)發(fā)生特異性結(jié)合。葉酸受體在許多惡性腫瘤如肝癌、乳腺癌、宮頸癌等癌細胞表面過度表達，而在正常細胞中幾乎不表達或表達水平極低[16-18]。為得到具有葉酸靶向性的運載系統(tǒng)，通過化學修飾將葉酸分子的羧基與PEG-PLGA中PEG的氨基端連接，從而得到靶向運載體聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸-葉酸（polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid-folic acid，PEG-PLGA-FA）。將藥物包裹于PEG-PLGA-FA載體內(nèi)，將賦予其葉酸靶向功能，特異性地選擇FRα高表達的惡性腫瘤細胞，大大降低藥物的不良反應，從而促進其在細胞水平或體內(nèi)的吸收。

針對克班寧毒性較大[19]、半衰期短[20]、水溶性差[21]等缺點，本實驗以PLGA-PEG-FA為載體，制備葉酸修飾的克班寧聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸共聚物納米粒（FA-Cre@PEG-PLGA NPs），期望通過納米粒的小粒徑被動靶向和葉酸的主動靶向作用改善克班寧自身缺點，提高藥物安全性和腫瘤細胞靶向性，為后續(xù)用于治療腫瘤的新型納米制劑研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

190Plus PALS型納米激光粒度儀，美國布魯克海文儀器公司；HT7700型透射電子顯微鏡，HITACHI公司；JY98-IIIDN型超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Sigma3-30k型超高速冷凍離心機，德國Sigma公司；Cary 60型紫外分光光度計，美國安捷倫有限公司；MF52-N型熒光倒置顯微鏡，廣州市明美光電技術(shù)有限公司；4750E型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Nuaire公司；DMil LED型倒置顯微鏡，德國Leica公司；Multiskan型酶標儀，美國Thermo公司；DP-50型便攜式超聲診斷儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 試劑

克班寧，云南中醫(yī)藥大學藥劑實驗室自制，批號20141101，質(zhì)量分數(shù)99.2%；PLGA，濟南岱罡生物科技有限公司，批號20140921；PEG-PLGA-FA，重慶浦諾維生物科技有限公司，批號RO018242；液態(tài)氟碳（PFP），美國Strem Chemicals公司，批號28403300；細胞膜熒光探針DiR碘化物，美國Biotium公司，批號20160814；聚乙烯醇（PVA），美國Sigma公司，批號SLBR4157V；CCK-8試劑，西安瑞禧生物科技有限公司，批號20010335；胎牛血清（批號2144324）、青霉素-鏈霉素（雙抗，批號2233204）、DMEM培養(yǎng)基（批號2211070）、磷酸鹽緩沖液（PBS），上海達特希爾生物科技有限公司，批號2237244；耦合膠，天津津亞科技發(fā)展有限公司，批號20190393。

1.3 細胞株

正常肝L02細胞、肝癌Bel-7402細胞，均由云南中醫(yī)藥大學藥劑實驗室提供。

1.4 動物

SPF級KM小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0010，本課題經(jīng)云南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準（批準號R-062022082），實驗動物飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，使用許可證號為SYXK（滇）K2022- 0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 FA-Cre@PEG-PLGANPs的制備

采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備FA-Cre@PEG- PLGA NPs，稱取克班寧30 mg溶于2 mL的醋酸乙酯中，依次加入PLGA 25.5 mg、5 mg/mL DiR溶液0.1 mL和PFP 300 μL，避光冰浴下，超聲破碎儀上乳化180 s，另精密稱取PLGA-PEG-FA 76.40 mg溶于2 mL醋酸乙酯并加入上述溶液中，避光冰浴下，超聲破碎儀上乳化90 s后加入25 mL 0.5% PVA溶液再次進行超聲乳化。隨后加入75 mL純水稀釋，室溫下通風櫥內(nèi)避光攪拌過夜。最后將所得乳液于冷凍離心機內(nèi)4 ℃ 16 000 r/min離心（離心半徑7.6 cm）5 min，按此方法共離心3次，棄去上清液，收集沉淀，沉淀以5 mL純水分散，備用。4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。如圖1所示，所制備的FA-Cre@ PEG-PLGA NPs為帶有淡藍色乳光的澄清液體，放置后未產(chǎn)生沉淀或絮凝現(xiàn)象。

2.2 FA-Cre@PEG-PLGANPs的表征

2.2.1 納米粒的粒徑、ζ電位測定 取適量納米粒以純水稀釋5倍，通過激光粒度儀測定納米粒的平均粒徑和ζ電位，重復操作3次，記錄平均值。結(jié)果見圖2-A、B，測得FA-Cre@PEG-PLGA NPs的平均粒徑為（247.67±2.49）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.139±0.027，ζ電位為（?9.40±0.54）mV。

圖1 FA-Cre@PEG-PLGA NPs的外觀

2.2.2 FA-Cre@PEG-PLGA NPs的穩(wěn)定性考察 將FA-Cre@PEG-PLGA NPs分別于7、15、30、60、90、120、150、180 d取樣觀察并測定粒徑及ζ電位。結(jié)果表明，納米粒外觀仍呈淡藍色，震搖后均勻分散，粒徑、ζ電位無明顯變化，結(jié)果如表1所示，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs在180 d內(nèi)平均粒徑為（256.09±4.90）nm，RSD為1.92%；平均ζ電位為（?10.28±0.54）mV，RSD為5.44%；平均PDI為0.144±0.007，RSD為4.89%。表明納米粒在180 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 FA-Cre@PEG-PLGA NPs的粒徑(A)和ζ電位圖(B)

表1 FA-Cre@PEG-PLGA NPs穩(wěn)定性考察(, n = 3)

2.2.3 納米粒的形態(tài)觀察 取適量納米粒稀釋后滴在碳膜銅網(wǎng)上放置5 min，濾紙吸取多余液體，滴加2%磷鎢酸溶液染色5 min，自然揮干，采用透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)。如圖3-A所示，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs呈圓球狀核殼結(jié)構(gòu)，形態(tài)較規(guī)整，粒子間未見明顯黏連與聚集。另取適量FA-Cre@PEG-PLGA NPs滴于載玻片上。滴入熱水使納米粒稀釋氣化，于熒光顯微鏡下觀察，得納米粒明場圖和暗場圖。并取等量的熱水滴于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察熱水的明場圖和暗場圖，并與納米粒氣化后的圖像進行對比。如圖3-B～E所示，納米粒氣化后明場呈藍色光點，暗場呈紅色熒光點。

2.3 FA-Cre@PEG-PLGANPs中克班寧含量測定方法的建立

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密稱取克班寧2.5 mg對照品置于燒杯中，加適量無水乙醇溶解，用生理鹽水定容于25 mL棕色量瓶中，稀鹽酸調(diào)pH值備用，分別量取0.25、0.50、1.00、1.50、3.00、4.00、5.00 mL于25 mL量瓶中，再加入生理鹽水定容，紫外分光光度計280 nm測定吸光度（）值。另取適量無水乙醇于量瓶中，加入生理鹽水定容作為空白對照。用值對質(zhì)量濃度（）作線性回歸方程。得回歸方程為＝0.061 3－0.013 5，2＝0.999 8，結(jié)果表明克班寧在1～20 μg/mL線性關(guān)系良好。

A-透射電鏡圖 B-納米粒明場圖 C-納米粒暗場圖 D-熱水明場圖 E-熱水暗場圖（×400）

2.3.2 精密度試驗 取2、6、16 μg/mL3個不同質(zhì)量濃度克班寧溶液，測定值，同日內(nèi)重復3次，連續(xù)進樣3 d，計算日內(nèi)日間精密度。結(jié)果表明3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度RSD分別為0.50%、0.16%、0.06%，日間精密度RSD分別為0.51%、0.16%、0.06%，RSD均小于5.0%，符合方法學要求。

2.3.3 重復性試驗 制備6份納米粒樣品，每份取0.5 mL，分別置于25 mL棕色量瓶中，用生理鹽水定容，同時以生理鹽水作為調(diào)零溶液，在280 nm處測值。結(jié)果，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs值的RSD為0.49%，表明本方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取2 μg/mL克班寧溶液，在室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h時測定值，考察穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，克班寧溶液值的RSD為1.01%，穩(wěn)定性良好，表明克班寧溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密量取已測定含量的樣品0.5 mL測定1值，之后分別加入樣品含量的2、12、20 μg/mL對照品0.5 mL，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度平均回收率為102.05%、101.96%、101.21%，RSD為0.42%、0.27%、0.16%，說明該法測定克班寧含量回收率高、準確可靠。

2.4 包封率和載藥量測定

取適量的FA-Cre@PEG-PLGA NPs（投藥量1）用無水乙醇稀釋后，分別用超聲診斷儀探頭和超聲清洗機超聲30 min，得濾液（1），測定其280 nm波長處的吸光度，通過線性回歸曲線方程計算出克班寧總質(zhì)量濃度（1）。取同樣體積的納米粒純水稀釋，離心30 min，取濾液（2），用紫外分光光度法測定并計算出游離克班寧質(zhì)量濃度（2）。按照下式計算包封率和載藥量，得FA-Cre@PEG-PLGA NPs的包封率為83.78%，載藥量為67.78%。

包封率＝(1－2)/1

載藥量＝(11－22)/1

2.5 體外釋藥規(guī)律分析

采用透析袋法[23]測定2種制劑體外釋藥行為。分別取適量的FA-Cre@PEG-PLGA NPs溶液和克班寧無水乙醇溶液于提前處理的透析袋中，透析袋兩端系緊。生理鹽水（稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 6.8）為接受液，在37 ℃，100 r/min條件下，于1、2、4、8、12、24、36、48、72 h取樣，并補加10 mL預熱的生理鹽水。樣品測定前經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，用紫外分光光度法測定含量。在280 nm下測量吸光度，計算累積釋放率，繪制體外釋放曲線。結(jié)果見圖4，克班寧原料藥在釋放介質(zhì)中釋放迅速，48 h釋放度達到90.67%，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs僅前12 h屬于快速釋藥期；12～72 h屬于緩慢釋藥期，72 h累積釋放率為53.16%。相對于克班寧原料藥，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs有一定的緩釋效果。通過軟件Origin 2018利用不同釋放模型處理克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs納米粒在生理鹽水中的釋放數(shù)據(jù)。結(jié)果如表2所示，F(xiàn)A-Cre@PEG- PLGA NPs中零級方程2為0.778 1，一級方程2為0.916 1，Higuchi模型2為0.934 2，Ritger-Peppas模型2為0.974 3。其中以Ritger-Peppas模型擬合度最高，符合該模型釋放規(guī)律。Ritger-Peppas模型可以描述為Q＝kt，可以代表藥物釋放機制，從FA-Cre@PEG-PLGA NPs模型擬合結(jié)果可知，釋放指數(shù)（）＝0.315 1，當＜0.45時，為Fick擴散[22]，即藥物首先溶解成溶液后再從制劑中擴散出來進入介質(zhì)，其釋藥受擴散速率的控制。

2.6 FA-Cre@PEG-PLGANPs安全性評價

2.6.1 溶血實驗 預先采集適量小鼠血液，收集在涂有肝素的離心管中，離心，棄去上清液。用生理鹽水將離心所得的紅細胞輕柔洗滌3次，配制成體積分數(shù)2%的紅細胞懸液。用生理鹽水將FA-Cre@ PEG-PLGA NPs和克班寧原料藥分別配制成質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250、300 μg/mL的溶液，并與體積分數(shù)2%紅細胞懸液混合，作為樣品液。體積分數(shù)2%紅細胞懸液與生理鹽水混合作為陰性對照；與純水混合作為陽性對照。將混合液于37 ℃恒溫孵育2 h，3000 r/min離心半徑7.6 cm，離心5 min，取上清液至于96孔板中，在405 nm處測定值，并計算溶血率。

圖4 體外釋放曲線

表2 釋藥模型擬合方程結(jié)果

溶血率＝(樣－陰)/(陽－陰)

樣表示不同質(zhì)量濃度的樣品的吸光度，陰表示陰性對照的吸光度，陽表示陽性對照的吸光度

如圖5和表3所示，克班寧原料藥組僅在50～150 μg/mL，溶血率＜5%的標準值；而FA-Cre@ PEG-PLGA NPs在50～300 μg/mL，溶血率分別為0.17%、0.40%、0.76%、0.94%、1.29%、1.70%，溶血率較低，且納米粒在較高質(zhì)量濃度（300 μg/mL）時，溶血率仍小于2%，表明FA-Cre@PEG-PLGA NPs相比于克班寧原料藥在50～300 μg/mL具有良好的生物相容性。

2.6.2 細胞培養(yǎng) 將正常肝L02細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素）的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱（5% CO2、37 ℃）中傳代培養(yǎng)，維持細胞處于對數(shù)生長期。

從左到右依次為陰性對照組、陽性對照組和50、100、150、200、250、300 μg·mL?1FA-Cre@PEG-PLGA NPs組以及50、100、150、200、250、300 μg·mL?1克班寧原料藥組

表3 2種克班寧制劑溶血率(, n = 3)

2.6.3 細胞超聲方法 超聲探頭對準96孔板底部，涂抹耦合膠進行間斷式超聲，每孔超聲8 min，暫停1 min，超聲2次后，再超聲7 min，每孔共計超聲25 min。

2.6.4 細胞超聲輻照損傷試驗 設(shè)置超聲組與未超聲組。超聲組方法如下：取對數(shù)生長期的正常肝L02細胞接種于96孔板（細胞密度1×104），培養(yǎng)24 h外部添加超聲輻照后，分別培養(yǎng)24、48 h，加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀在450 nm波長處讀取值。未超聲組除不添加超聲外，其余處置方式與超聲組均相同。超聲輻照后細胞死亡率按下式計算。結(jié)果如表4所示，正常肝L02細胞24、48 h細胞死亡均＜3%，表明此超聲條件不會引起細胞大量死亡，超聲輻照處置對正常肝L02細胞損傷較小，安全性較好。

細胞死亡率＝(未超聲－超聲)/未超聲

表4 超聲輻照處置對正常肝L02細胞損傷影響(, n = 6)

2.6.5 CCK-8法檢測正常肝L02細胞的活力 超聲組：將對數(shù)生長期的正常肝L02細胞接種于96孔板（細胞密度1×104），待細胞貼壁后分別給予不同質(zhì)量濃度的克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs，并設(shè)置對照孔（不含克班寧）和空白孔（不含克班寧和細胞），外部添加超聲輻照，未超聲組除不添加超聲輻照外其余條件不變。分別孵育24、48 h后，加入CCK-8 10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀在450 nm波長處讀取值，計算細胞存活率。

細胞存活率＝(實驗－空白)/(對照－空白)

結(jié)果如表5所示，不同質(zhì)量濃度的克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs對正常肝L02細胞存活率出現(xiàn)不同程度的影響。經(jīng)計算，未進行超聲24、48 h后克班寧原料藥的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為（208.5±16.0）、（127.6±9.4）μg/mL，克班寧原料藥對正常肝L02細胞存活率影響較強，存在一定的肝毒性；FA-Cre@PEG-PLGA NPs在未進行超聲24、48 h后IC50值分別為（497.9±28.1）、（380.0±25.8）μg/mL，其在質(zhì)量濃度50～300 μg/mL時，細胞存活率仍大于50%；且與克班寧原料藥相比，在50～250 μg/mL時存在顯著性差異（＜0.05），表明未超聲時FA-Cre@PEG-PLGA NPs對正常肝L02細胞毒性較低，安全性較好。

超聲輻照處置24、48 h后，克班寧原料藥的IC50值分別為（186.2±14.2）、（117.1±10.3）μg/mL；FA-Cre@PEG-PLGA NPs的IC50值分別為（221.8±19.9）、（150.3±13.8）μg/mL。FA-Cre@PEG-PLGA NPs超聲輻照處置24、48 h后分別與FA-Cre@PEG- PLGA NPs未超聲24、48 h后相比，在50～300 μg/mL時細胞存活率顯著降低，存在極顯著性差異（＜0.01）；FA-Cre@PEG-PLGA NPs超聲輻照處置24、48 h后分別與克班寧原料藥超聲輻照24、48 h相比，在50～250 μg/mL時，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs對正常肝L02細胞毒性略低于克班寧原料藥，在300 μg/mL時FA-Cre@PEG-PLGA NPs對L02細胞毒性略高于克班寧原料藥，且在50～250 μg/mL時存在顯著性差異（＜0.05）。表明FA-Cre@PEG- PLGA NPs對正常肝L02細胞毒性較低，相比于克班寧原料藥有一定的安全性。但FA-Cre@PEG- PLGA NPs對正常肝L02細胞仍有一定的細胞增殖抑制作用，推測在納米粒制備過程中，大部分克班寧被包載進入納米粒，但仍有部分克班寧以小分子形式附著在PLGA外殼上，使FA-Cre@PEG-PLGA NPs與正常肝L02細胞共孵育時，附著在PLGA上的克班寧被細胞吞噬，從而產(chǎn)生毒性作用。

表5 2種克班寧制劑對正常肝L02細胞存活率的影響(, n = 6)

同一處置方法下，同一質(zhì)量濃度與原料藥組24 h比較：**＜0.01；同一處置方法下，同一質(zhì)量濃度與原料藥組48 h比較：##＜0.01；同一質(zhì)量濃度，同一時間下與納米粒未超聲組比較：&&＜0.01

**< 0.01bulk drug group for 24 h, under the same disposal method and the same mass concentration;##< 0.01bulk drug group for 48 h, under the same disposal method and the same mass concentration;&&< 0.01nanoparticles without ultrasound group, under the same mass concentration at the same time

2.7 FA-Cre@PEG-PLGANPs的體外抗腫瘤活性研究

2.7.1 細胞培養(yǎng) 將肝癌Bel-7402細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，維持細胞處于對數(shù)生長期。

2.7.2 細胞超聲輻照損傷試驗 超聲方法按“2.6.3”和“2.6.4”項下方法，同樣設(shè)置超聲組與未超聲組，對肝癌Bel-7402細胞進行超聲輻照損傷實驗。結(jié)果如表6所示，肝癌Bel-7402細胞24、48 h細胞死亡率均＜3%，表明此超聲條件下對肝癌Bel-7402細胞損傷較小，這種處置方法對實驗影響較小，可作為體外細胞超聲來源。

表6 超聲輻照處置對Bel-7402細胞損傷影響(, n = 6)

2.7.3 腫瘤細胞增殖抑制能力的檢測 采用CCK-8試劑盒檢測克班寧原料藥和FA-Cre@PEG- PLGA NPs對肝癌Bel-7402細胞增殖抑制的影響。將對數(shù)生長期的Bel-7402細胞接種于96孔板（細胞密度1×104），待細胞貼壁后，同樣設(shè)置超聲組與未超聲組，操作步驟同“2.6.5”項，計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率＝(對照－實驗)/(對照－空白)

結(jié)果如表7顯示，隨著藥物劑量的增加，克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs對肝癌Bel- 7402細胞的增殖均產(chǎn)生了不同程度的抑制，呈現(xiàn)出劑量依賴性。未超聲條件下，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs對腫瘤細胞的增殖抑制效果稍弱于克班寧原料藥；但在超聲處置24 h和48 h后，F(xiàn)A-Cre@PEG- PLGA NPs對腫瘤細胞的殺傷能力得到增強，特別是超聲處置48 h后納米粒對細胞增殖抑制率均高于原料藥，在50～100 μg/mL和300 μg/mL時存在顯著性差異（＜0.05）。FA-Cre@PEG-PLGA NPs超聲輻照24 h后與FA-Cre@PEG-PLGA NPs未超聲24 h后相比，在300 μg/mL時細胞增殖抑制率顯著升高，存在極顯著性差異（＜0.01）；FA-Cre@PEG- PLGA NPs超聲輻照48 h后與FA-Cre@PEG-PLGA NPs未超聲48 h后相比，在50～100 μg/mL和300 μg/mL時存在顯著性差異（＜0.05）。

表7 2種克班寧制劑在未超聲、超聲條件下對肝癌Bel-7402細胞增殖抑制率的影響(, n = 6)

同一處置方法下，同一濃度與原料藥組48 h比較：#＜0.05##＜0.01；同一濃度，同一時間下與納米粒未超聲組比較：&＜0.05&&＜0.01

#< 0.05##< 0.01bulk drug group for 48 h, under the same disposal method and the same mass concentration;&< 0.05&&< 0.01nanoparticles without ultrasound group, under the same mass concentration at the same time

經(jīng)計算，未超聲24 h后克班寧原料藥和FA- Cre@PEG-PLGA NPs的IC50值分別為（211.2±12.0）、（285.1±13.1）μg/mL；未超聲48 h后克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs的IC50值分別為（171.5±10.0）、（219.4±13.3）μg/mL；超聲輻照24 h后克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs的IC50值分別為（180.3±11.2）、（182.3±12.9）μg/mL；超聲輻照48 h后克班寧原料藥和FA-Cre@ PEG-PLGA NPs的IC50值分別為（161.1±10.2）、（145.0±10.0）μg/mL。超聲組24、48 h后FA-Cre@ PEG-PLGA NPs的IC50相比于未超聲組降低1.56倍、1.51倍?？税鄬幵纤幊暻昂髮Ω伟〣el-7402細胞增殖抑制率的影響變化不大。

FA-Cre@PEG-PLGA NPs未超聲處置時對肝癌Bel-7402細胞抑制率低于克班寧原料藥，由“2.5”項體外釋放結(jié)果可知，48 h納米粒內(nèi)藥物釋放緩慢，猜測克班寧包裹在納米粒內(nèi)，因此，對腫瘤細胞抑制率低于原料藥；超聲處置后對肝癌Bel-7402細胞增殖抑制率顯著提升，推測FA-Cre@PEG-PLGA NPs在超聲輻照區(qū)破碎，激發(fā)納米粒相變釋藥，改善藥物在細胞內(nèi)的蓄積，提高納米粒對肝癌Bel-7402細胞的增殖抑制率。結(jié)果表明，F(xiàn)A-Cre@PEG-PLGA NPs聯(lián)合超聲輻照后，對肝癌Bel-7402細胞增殖抑制作用增強。

2.7.4 細胞形態(tài)觀察 將細胞接種于6孔板中，然后于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使其貼壁生長，棄去原培養(yǎng)基并補加1 mL含不同質(zhì)量濃度（0、50、150、300 μg/mL）的原料藥和納米粒的培養(yǎng)基，其中納米粒分為未超聲組與超聲組。繼續(xù)孵育48 h后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。結(jié)果如圖6所示，當原料藥組、納米粒未超聲組、納米粒超聲組質(zhì)量濃度為0 μg/mL時，肝癌Bel-7402細胞呈不規(guī)則多邊形，細胞間連接緊密、分界清晰，未見明顯縫隙，表面光滑；50 μg/mL原料藥組、納米粒未超聲組、納米粒超聲組處理48 h后，肝癌Bel-7402細胞分布密度降低，其中原料藥組、納米粒超聲組細胞密度低于納米粒未超聲組；而150 μg/mL和300 μg/mL原料藥組、納米粒未超聲組、納米粒超聲組處理48 h后，細胞分布密度顯著降低，大量細胞出現(xiàn)變圓、皺縮，其中300 μg/mL納米粒超聲組相比于同濃度的原料藥組和納米粒未超聲組，細胞尤為稀疏。該結(jié)果進一步證實納米粒聯(lián)合超聲輻照后對肝癌Bel-7402細胞生長具有顯著的抑制作用, 并呈明顯的劑量效應。

圖6 不同克班寧制劑對肝癌Bel-7402細胞形態(tài)的影響(×200)

2.7.5 對腫瘤細胞遷移能力的影響 采用細胞劃痕實驗分析克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs對肝癌Bel-7402細胞遷移能力的抑制作用。提前在6孔板底部用筆畫3條均分的直線，將對數(shù)生長期的肝癌Bel-7402細胞接種于6孔板（細胞密度1×104）中。待細胞貼壁長滿后，用10 μL微量移液器的槍頭垂直于定位橫線垂直方向均勻劃線，PBS洗滌細胞2次，除去細胞碎片。將劃下的細胞清洗干凈后，加入不同處置的藥物繼續(xù)培養(yǎng)，分為空白組和50、150、300 μg/mL 3個不同質(zhì)量濃度的原料藥組、納米粒未超聲組、納米粒超聲組。將6孔板放入培養(yǎng)箱中，分別于0、24、48 h用倒置顯微鏡拍照并記錄，使用Image J軟件對圖像進行分析，并計算劃痕面積恢復率。

劃痕面積恢復率＝(0 h劃痕面積－24 h或48 h劃痕面積)/0 h劃痕面積

結(jié)果見圖7和表8，空白組的Bel-7402細胞迅速向“傷口”位置轉(zhuǎn)移。原料藥組、納米粒未超聲組、納米粒超聲組對細胞抑制效果存在差別。相比于空白組，這3個組均對Bel-7402細胞的遷移存在抑制，使Bel-7402細胞遷移“愈合”劃痕的速度降低，并且均表現(xiàn)出劑量依賴性。同一質(zhì)量濃度下各組24、48 h對Bel-7402細胞遷移抑制效果排序為納米粒未超聲組＜原料藥組＜納米粒超聲組。表明克班寧原料藥以及超聲聯(lián)合納米粒處置均可顯著抑制腫瘤細胞的遷移（與空白組相比＜0.01）；且超聲聯(lián)合納米粒處置48 h遷移能力顯著下降（與原料藥組相比，＜0.01；與納米粒未超聲組相比＜0.01）。

2.7.6 細胞攝取實驗 將肝癌Bel-7402細胞接種于6孔板中，孵育24 h后，加入含游離DiR或FA-Cre@ PEG-PLGA NPs的培養(yǎng)液，其中FA-Cre@PEG- PLGA NPs分為未超聲組和超聲組。再分別培養(yǎng)6、12 h后，用PBS洗滌細胞3次，熒光倒置顯微鏡進行熒光成像。結(jié)果如圖8所示，僅含有培養(yǎng)基的Bel- 7402細胞，6、12 h后細胞均未出現(xiàn)紅色熒光，表明無腫瘤細胞自發(fā)熒光對實驗的干擾。同時，12 h游離DiR組、6 h納米粒未超聲組、6 h納米粒超聲組僅觀察到Bel-7402細胞的細胞膜出現(xiàn)紅色熒光，且6 h納米粒超聲組的紅色熒光更明顯。12 h納米粒未超聲組、12 h納米粒超聲組細胞內(nèi)也出現(xiàn)紅色熒光，且12 h納米粒超聲組細胞內(nèi)紅色熒光更明顯。與游離DiR組相比，納米粒未超聲組紅色熒光強度增強，推測PEG-PLGA-FA修飾納米粒后，賦予其主動靶向功能，提高葉酸高表達的Bel-7402細胞對納米粒的攝取能力；與納米粒未超聲組相比，納米粒超聲組紅色熒光強度增強，推測經(jīng)超聲輻照處置后，納米粒內(nèi)DiR大量釋放，被細胞攝取。表明聯(lián)合超聲處置可以提高Bel-7402細胞對納米粒的攝取能力。

A-空白組 B-原料藥組 C-納米粒未超聲組 D-納米粒超聲組

A-blake group B-prodrugs group C-NPs non-ultrasound group D-NPs ultrasound group

圖7 細胞劃痕結(jié)果(×40)

Fig. 7 Results of cell scratch assay (× 40)

表8 不同克班寧制劑對Bel-7402細胞遷移能力的影響(, n = 3)

同一時間下與空白組比較：*＜0.05**＜0.01；同一質(zhì)量濃度，同一時間下與原料藥組比較：#＜0.05##＜0.01；同一質(zhì)量濃度，同一時間下與納米粒未超聲組比較：&＜0.05&&＜0.01

*< 0.05**< 0.01blank group at the same time;#< 0.05##< 0.01bulk drug group, under the same mass concentration at the same time;&< 0.05&&< 0.01nanoparticles without ultrasound group, under the same mass concentration at the same time

3 討論

癌癥是全球主要的公共衛(wèi)生問題，每年造成數(shù)百萬人死亡，嚴重威脅人們的健康。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，惡性腫瘤已成為世界上主要的致死性疾病之一，2022年美國新增癌癥病例190.1萬例，新增死亡病例60.9萬例，發(fā)病率與死亡率呈逐年上升趨勢[23]。其中肺癌、肝癌、胃癌是我國東、中、西部各地區(qū)常見的惡性腫瘤死亡原因[24-25]。2020年肝癌雖然在我國癌癥新發(fā)病類型中僅占9%，但在死亡病例中占13%，位于癌癥死亡病例的第2。表明肝癌致死率較高，嚴重威脅我國人群健康。手術(shù)、化療、免疫治療等仍是臨床上常用的藥物治療方法，但各類藥物的不良反應及耐藥性的產(chǎn)生也是臨床亟待解決的問題。

圖8 6、12 h Bel-7402細胞對各組攝取的熒光圖(×200)

近年來，隨著分子生物學和超聲成像技術(shù)的發(fā)展，應用超聲微泡介導肝癌的靶向治療成為研究的熱點，并有望為肝癌患者提供一種更安全、有效的治療方法。臨床上超聲檢查具有實時觀察、技術(shù)簡單、無創(chuàng)等優(yōu)點，可作為診斷肝臟腫瘤的第一步[26-27]。微泡是常用的超聲增強顯影劑，納米級微泡如液態(tài)氟碳微泡較微米級微泡具有更強的穿透力，可以穿越血管內(nèi)皮進入組織間隙，滲入到腫瘤的空隙中，使循環(huán)時間更長[28-30]。因此，超聲聯(lián)合納米造影劑運載體系是一種很有前途的非侵入性靶向載藥技術(shù)，有望實現(xiàn)深部腫瘤更好的治療效果。

本實驗采用超聲乳化-溶劑揮發(fā)法制備FA- Cre@PEG-PLGA NPs。將克班寧包載于PEG-PLGA納米粒中，并對其表面進行葉酸修飾，擬使納米粒具有主動靶向腫瘤細胞的能力。通過對FA-Cre@ PEG-PLGA NPs進行表征，得到粒徑較小，分布較均勻的納米粒。在前期體外釋放接收液的篩選上，嘗試了3種接收液，在pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液中溶解度低，累積釋放率不足20%；在10%聚山梨酯80-生理鹽水溶液中，聚山梨酯80在生理鹽水中不穩(wěn)定，使得克班寧最大吸收峰從280 nm移至272 nm，以上接收液均無法滿足漏槽條件。而克班寧在生理鹽水溶液中溶解度大，可達到漏槽條件。由于體內(nèi)腫瘤部位為酸性微環(huán)境，選擇微酸性釋放液更能模擬體內(nèi)腫瘤靶部位的釋放特性，因此選擇生理鹽水（稀鹽酸調(diào)pH 6.8）作為接收液。但選擇的接收液中含有鹽溶液，若采用高效液相色譜法測定克班寧含量對色譜柱損傷較大，故本實驗采取紫外光譜法進行測定。

后續(xù)體外釋放實驗表明，F(xiàn)A-Cre@ PEG-PLGA NPs具有緩釋能力，符合Ritger-Peppas模型釋放規(guī)律，釋放機制為Fick擴散。溶血實驗表明納米粒具有更好的生物相容性。本實驗使用低強度超聲，添加的超聲輻照對正常肝L02細胞和肝癌Bel-7402細胞傷害小，死亡率均＜3%，安全有效，可作為體外聯(lián)合超聲治療來源。正常肝L02細胞體外安全性實驗和肝癌Bel-7402細胞增殖抑制試驗結(jié)果顯示，未聯(lián)合超聲輻照時，克班寧原料藥和FA-Cre@PEG- PLGA NPs對2種細胞均有一定的增殖抑制性，并在一定的范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度相關(guān)性。

但納米粒對2種細胞的細胞毒性相較于克班寧原料藥低，有一定的安全性。納米粒分別與L02細胞、Bel-7402細胞共孵育時仍有一定的細胞增殖抑制作用，可能原因：①納米粒用葉酸修飾，因此未超聲時納米粒也容易與葉酸高表達的肝癌細胞表面的受體結(jié)合，介導細胞內(nèi)吞作用使納米粒被細胞吞噬從而發(fā)揮毒性作用。②部分克班寧未包裹進入納米粒內(nèi)部，附著在納米粒外殼上，在與細胞孵育過程中慢慢被細胞吞噬，產(chǎn)生毒性作用。當外部添加超聲輻照后克班寧原料藥和FA-Cre@PEG-PLGA NPs對L02細胞和Bel-7402細胞增殖抑制率均提高，在對Bel-7402細胞增殖抑制率上，尤以納米粒提升較為顯著，推測超聲激發(fā)納米粒相變釋藥，增加藥物在腫瘤細胞內(nèi)的蓄積，達到增強抗腫瘤活性的效果。細胞劃痕實驗可用于量化細胞遷移能力，從實驗結(jié)果看出，各實驗組均有一定的抑制腫瘤細胞遷移的能力，并表現(xiàn)出劑量依賴性。且超聲聯(lián)合納米粒處置方式展現(xiàn)出更強的抗腫瘤遷移能力。細胞攝取實驗也表明超聲聯(lián)合納米粒處置方式可以提高Bel-7402細胞對納米粒的攝取能力。

本研究結(jié)果僅限于克班寧納米粒的制備和初步體外評價，后續(xù)將對FA-Cre@PEG-PLGA NPs超聲下相變能力、細胞攝取機制、組織分布、體內(nèi)安全性等進行全面研究，為其進一步的開發(fā)應用提供更完整的實驗數(shù)據(jù)。本研究有望為肝癌的治療研究提供思路，也有望為腫瘤治療提供一種超聲微泡介導靶向治療策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and anti-tumor activity study of folic acid modified crebanine polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid copolymer nanoparticles

PAN Rui1, 3, 4, ZHANG Hai-liang1, 4, ZHAO Xiao-yu1, TANG Jun-ze1, WU Jian-ming1, ZHENG Yong-ren5, CHENG Xin1, 2, 4

1. College of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory of External Drug Delivery System and Preparation Technology in University of Yunnan Province, Kunming 650500, China 3. College of Chinese Materia Medica and Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Utilization, Kunming 650500, China 4. Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines, Kunming 650500, China 5. Science and Technology Office, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To prepare folic acid modified crebanine polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid copolymer nanoparticles (FA-Cre@PEG-PLGA NPs) and investigate theirrelease and anti-tumor activity.FA-Cre@PEG- PLGA NPs were prepared by ultrasonic emulsion-solvent evaporation method with crebanine as a model drug, polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid (PEG-PLGA) copolymer and folic acid (FA) as materials. The particle size, potential and morphology of FA-Cre@PEG-PLGA NPs were characterized by laser particle size measurement, transmission electron microscopy and fluorescence microscope. The encapsulation rate and drug loading capacity of crebanine were determined and calculated by Ultraviolet spectroscopy. Meanwhile, therelease patterns of FA-Cre@PEG-PLGA NPs and crebanine bulk drug at 72 h were compared. The biological properties were investigated by hemolysis assay. The safety evaluation on L02 cells and the proliferation inhibition on Bel-7402 cells were investigated by CCK-8 assay. The proliferation of Bel-7402 cells was quantified by cell wound scratch assay. Finally, the uptake capacity of nanoparticles to Bel-7402 cells at different time points was observed by fluorescence microscope.The average particle size of FA-Cre@PEG-PLGA NPs was (247.67 ± 2.49) nm, with a polydispersity index (PDI) of 0.139 ± 0.027 and a ζ potential of (?9.40 ± 0.54) mV. The transmission electron microscopy revealed a core-shell structure, while the fluorescence microscopy showed blue dots in the bright field and red dots in the dark area after gasification. The encapsulation rate of crebanine in nanoparticles was 83.78% and the drug loading was 67.78%. The release of FA-Cre@PEG-PLGA NPs and crebanine bulk drug conformed to the Ritger-Peppas model. The safety evaluation showed that FA-Cre@PEG-PLGA NPs had good biocompatibility within the range of 50—300 μg/mL compared with crebanine bulk drug. The FA-Cre@PEG-PLGA NPs showed lower toxicity to L02 cells than crebanine bulk drug. The proliferation inhibition results showed dose-dependent and time-dependent effects on the proliferation of Bel-7402 cells. Moreover, the FA-Cre@PEG-PLGA NPs combined with ultrasound irradiation had stronger killing effect on Bel-7402 cells. The cell wound scratch experiments showed that both the crebanine bulk drug and FA-Cre@PEG-PLGA NPs inhibited the migration of Bel-7402 cells in a dose-dependent manner, and the nanoparticles combined with ultrasound irradiation could inhibit the migration of tumor cells more significantly. The cell uptake experiment showed that nanoparticles combined with ultrasound irradiation could effectively enhance the uptake of tumor cells at the same time.The FA-Cre@PEG-PLGA NPs were successfully prepared, and exhibited good slow-release effect and antitumor effect, providing an experimental basis for the application of FA-Cre@PEG-PLGA NPs in the treatment of liver cancer.

folic acid; polyethylene glycol-polylactic acid hydroxyacetic acid; crebanine; nanoparticles; anti-tumor activity;release; ultrasonic emulsion-solvent evaporation method

R283.6

A

0253 - 2670(2023)20 - 6643 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.009

2023-04-28

云南省科技廳——云南中醫(yī)藥大學應用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項重點項目（202001AZ070001-008）；云南省科技廳生物醫(yī)藥重大科技專項（202002AA100007）；云南省科技人才平臺計劃（202105AG070012）；云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室開放課題（202210SS2205）；云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室開放課題（202210SS2206）；國家中醫(yī)藥管理局“十二五”重點學科——傣藥學

潘 蕊（1999—），碩士研究生，研究方向為藥物新劑型研究。Tel: 18468224320 E-mail: 547349550@qq.com

通信作者：程 欣（1977—），博士，副教授，碩士生導師，研究方向為納米醫(yī)藥、藥物新劑型等研究。Tel: 15987162031

[責任編輯 鄭禮勝]