自噬流調(diào)控在白內(nèi)障眼病中的研究進(jìn)展

王從玉,李鵬飛,王思文,鮑思潔,石海紅,管懷進(jìn)

0 引言

白內(nèi)障是全球致盲性眼病的主要原因,表現(xiàn)為晶狀體透明度喪失,嚴(yán)重影響患者的視力[1]。而手術(shù)干預(yù)是目前治療白內(nèi)障唯一有效的治療方法。因此,探討白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制就顯得尤為重要。白內(nèi)障的病因較為復(fù)雜,包括基因突變引起的晶狀體先天發(fā)育異常、衰老引起的氧化損傷、糖尿病引起的糖代謝異常以及術(shù)后炎癥因子刺激導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cells,LECs)增生等因素,都與白內(nèi)障的形成有關(guān)。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)自噬流的調(diào)控可通過改變LECs的狀態(tài),參與白內(nèi)障的病理生理過程。因此,為了系統(tǒng)地了解自噬流調(diào)控對白內(nèi)障眼病的影響,本文對其展開綜述。

1 自噬流及其調(diào)控通路

1.1自噬流細(xì)胞自噬是一系列自噬膜結(jié)構(gòu)逐漸成熟的動態(tài)過程。目前將自噬雙層膜形成、自噬體形成、自噬溶酶體形成以及自噬溶酶體降解的動態(tài)過程定義為自噬流(autophagic flux),亦稱為“自噬潮”[2]。主要包括:(1)自噬起始:含Atg1/ULK1的復(fù)合物啟動自噬。(2)自噬體形成:Beclin1/Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ)復(fù)合物、Atg9-Atg2-Atg18復(fù)合物和Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合物、以及依賴于Atg3、Atg4和Atg7的LC3,介導(dǎo)自噬體的延長和成熟[3-4]。(3)自噬體和溶酶體的運輸和融合:此過程需要Rab7[5-6],EPG5[6-7],HOPS[8-9],PLEKHM1[10]和SNAREs的參與[11-12]。(4)自噬完成:此過程需要溶酶體內(nèi)的水解酶降解自噬體,并通過轉(zhuǎn)運體將降解產(chǎn)物釋放到細(xì)胞質(zhì)中,重新合成新的生物大分子或參與其他代謝途徑[13-14]。

1.2調(diào)控自噬流的信號通路mTOR通路是目前白內(nèi)障自噬流調(diào)控通路研究最多的一條通路,它是多條信號通路的匯聚點,如下所示:(1)PI3K-AKT-mTOR信號通路:PI3K激活的結(jié)果是活化AKT,AKT磷酸化mTOR分子并激活mTOR,進(jìn)而抑制自噬,或通過磷酸化TSC1/2,阻止其對小G蛋白Rheb的負(fù)調(diào)控,進(jìn)而使Rheb累積,而后上調(diào)mTOR,抑制自噬啟動。(2)AMPK-mTOR信號通路:生理狀態(tài)下,細(xì)胞內(nèi)AMPK處于失活狀態(tài),環(huán)境刺激因素,如缺氧、饑餓等可引起細(xì)胞內(nèi)能量降低,導(dǎo)致AMP/ATP的比值增高,從而激活A(yù)MPK;當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量下降時,LKB1可磷酸化激活A(yù)MPK,活化的AMPK通過抑制mTORC1的活性,進(jìn)而誘導(dǎo)自噬。AMPK/mTOR/ULK1通路作為調(diào)控自噬的重要路徑而備受關(guān)注,在營養(yǎng)缺乏時,激活的AMPK通過抑制mTOR,來催化ULK1磷酸化從而激活自噬,是一種正向調(diào)控機(jī)制;相反,在營養(yǎng)充足時,PI3K-AKT活化下游的mTOR磷酸化ULK1,抑制自噬。(3)MAPK信號通路:包括ERK、JNK和p38激酶家族通路,在許多細(xì)胞活動中起作用,如生長增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞運動或死亡。在這一過程中改變自噬信號通路會影響自噬進(jìn)程,參與白內(nèi)障的發(fā)生[15]。

2 自噬流調(diào)控在白內(nèi)障眼病中的作用機(jī)制

2.1先天性白內(nèi)障先天性白內(nèi)障(congenital cataract,CC)的發(fā)生機(jī)制:晶狀體主要由未分化的單層立方上皮細(xì)胞以及其分化而來的纖維細(xì)胞組成,在上皮細(xì)胞分化為成熟的纖維細(xì)胞過程中會伴隨著線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜性細(xì)胞器的降解,形成無細(xì)胞器區(qū)(organell-free-zone, OFZ),細(xì)胞器的異常降解會導(dǎo)致晶狀體細(xì)胞發(fā)育異常,影響其透明度,從而引發(fā)CC的形成[16]。而自噬不僅能回收利用LECs中受損細(xì)胞器和錯誤折疊蛋白,而且在LECs分化成晶狀體纖維細(xì)胞過程中參與細(xì)胞器的降解中同樣發(fā)揮重要作用[17]。

目前,研究顯示存在FYCO1、Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(Pik3c3)、CHMP4B、EPG5、ERCC6、TDRD7等基因的突變/敲除,通過影響自噬流的運行,導(dǎo)致CC的形成。FYCO1基因突變是導(dǎo)致常染色體隱性遺傳性CC的原因之一,其主要通過抑制自噬體向溶酶體轉(zhuǎn)運過程,導(dǎo)致晶狀體纖維細(xì)胞中細(xì)胞器降解失敗,從而使晶狀體發(fā)生混濁,形成CC[18]。Pik3c3又稱為Vps34,是唯一一個Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KⅢ),有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在特異性敲除Pik3c3的鼠模型中,自噬流的發(fā)生在胚胎時期即受到抑制[17]。CHMP4B是3個人類直系同源的哺乳動物Vps32基因之一,其在常染色體顯性遺傳性CC患者中發(fā)生基因突變,進(jìn)而調(diào)控自噬流的降解過程參與白內(nèi)障的形成[19]。EPG5是特異性自噬基因epg-5的人類同系物,編碼一個關(guān)鍵的自噬降解階段的調(diào)節(jié)因子(異位P顆粒自噬蛋白5),與自噬溶酶體的形成有關(guān)。已有研究證實EPG5基因突變在Vici綜合征中具有致病作用,而Vici綜合征是一種隱形遺傳性多系統(tǒng)疾病,可表現(xiàn)為CC[20]。Cockayne綜合征是因ERCC6或ERCC8基因突變所導(dǎo)致的遺傳性疾病,多伴發(fā)CC,而ERCC6是DNA修復(fù)機(jī)制核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)的重要成員,因此,其表達(dá)的缺失與CC的形成密切相關(guān)。近來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn),ERCC6與溶酶體膜蛋白VCP存在相互作用,進(jìn)而影響自噬體與溶酶體的結(jié)合而導(dǎo)致LECs內(nèi)自噬流的降解異常。所以,ERCC6在CC中也可能通過調(diào)節(jié)自噬流的降解階段來參與白內(nèi)障的形成過程,但其在CC中具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索[21]。此外,最近的一項研究發(fā)現(xiàn)在CC患者中存在TDRD7基因突變,TDRD7在眼組織中大量表達(dá)[22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TDRD7可能直接與自噬關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Tbc1d20 mRNA結(jié)合并下調(diào)其表達(dá),抑制自噬體和溶酶體的融合,從而破壞自噬流,導(dǎo)致晶狀體纖維細(xì)胞中錯誤折疊蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器的降解異常,進(jìn)而導(dǎo)致人和小鼠晶狀體發(fā)育異常[23]。

晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白對維持晶狀體透明度的重要性不言而喻,所以編碼晶狀體蛋白的基因點突變可導(dǎo)致CC形成。研究證實晶狀體縫隙連接蛋白α(Gja8b)基因突變會導(dǎo)致斑馬魚LECs中細(xì)胞器降解功能障礙,通過誘導(dǎo)自噬下調(diào)可能是導(dǎo)致CC發(fā)生的主要致病機(jī)制[24]。α晶狀體蛋白是晶狀體內(nèi)重要的伴侶蛋白,是兩種多肽αA-和αB-晶狀體蛋白的低聚物,其分子伴侶活性使其在維持晶狀體的透明過程中發(fā)揮重要的作用。Wignes等[25]研究發(fā)現(xiàn)αB-晶狀體蛋白R120G(aBR120G)突變小鼠LECs中持續(xù)存在錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集體,表明自噬清除功能受損,p62蛋白累積,最終導(dǎo)致CC形成。同樣,αA-R49C突變導(dǎo)致LECs中p62累積,蛋白質(zhì)聚集,細(xì)胞死亡以及突變蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中錯誤定位,而增強(qiáng)自噬可促進(jìn)LECs中蛋白質(zhì)降解,從而減少晶狀體混濁,提示自噬缺陷與CC的致病機(jī)制相關(guān)[26],通過激活自噬流來防止晶狀體中蛋白質(zhì)聚集的研究,將為后續(xù)揭示CC的發(fā)病機(jī)制提供明確方向。

2.2年齡相關(guān)性白內(nèi)障年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC)形成的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[27]。自噬流調(diào)控LECs的凋亡是近年來研究的熱點話題,多項研究結(jié)果表明自噬流的增強(qiáng)或通暢可以減少LECs的凋亡,延緩ARC的發(fā)生發(fā)展。已有學(xué)者證實,晶狀體組織中自噬流起始階段的關(guān)鍵蛋白Atg5和Atg4a缺失導(dǎo)致自噬流起始階段異常,從而加速LECs的凋亡,最終導(dǎo)致小鼠ARC的發(fā)生[17,28]。此外,還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自噬溶酶體降解通路降解錯誤折疊的氧化損傷修復(fù)蛋白MSH3和XRCC5,進(jìn)而調(diào)控LECs的凋亡,參與ARC的發(fā)生發(fā)展[29-30]。

近年來多項研究證實,非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)在ARC的自噬流過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。ncRNA可以通過多種機(jī)制參與調(diào)控靶基因信使RNA(mRNA)的表達(dá)而得以廣泛運用,主要包括微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)。許多研究探索發(fā)現(xiàn)miRNA通過調(diào)控自噬流的靶基因來參與ARC的發(fā)生發(fā)展[31]。研究發(fā)現(xiàn),miR-23b-3p在LECs中顯著上調(diào),通過抑制SIRT1及其下游FOXO來抑制自噬流起始階段蛋白Atg7和Beclin1在LECs中表達(dá),從而減弱自噬對錯誤折疊蛋白和損傷細(xì)胞器的清除,導(dǎo)致ARC的發(fā)生[32]。Let-7c-3p通過靶向沉默LECs中的自噬流起始階段基因Atg3表達(dá),進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬和凋亡[33]。此外,let-7c-5p通過抑制NER基因ERCC6的表達(dá)阻止自噬溶酶體降解階段,通過減少ERCC6的表達(dá)之后導(dǎo)致自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1和p62增加,表明自噬降解階段受阻,隨后該團(tuán)隊深入研究發(fā)現(xiàn)ERCC6所編碼的蛋白CSB能夠與一種參與自噬溶酶體降解的標(biāo)記物VCP相互作用參與自噬降解。因此,let-7c-5p通過調(diào)控ERCC6/VCP通路影響自噬體的降解過程,參與ARC的發(fā)生發(fā)展[34]。此外,Has_circ_0004058通過miR-186/Atg7軸促進(jìn)自噬小體的形成來抑制SRA01/04細(xì)胞凋亡[35]。有研究表明,自噬相關(guān)的lncRNA參與白內(nèi)障的形成,敲低lncRNA的晶狀體模型抑制了LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化,從而減弱LECs中的自噬活性[36]。lncRNA能否在白內(nèi)障體內(nèi)模型中調(diào)控自噬基因或者自噬通路來控制白內(nèi)障的發(fā)生,還有待進(jìn)一步探索和研究。

然而,也有一些學(xué)者持相反觀點,認(rèn)為ARC的形成與自噬流的過度激活有關(guān),通過減弱自噬通量后,可減輕氧化應(yīng)激和DNA損傷誘導(dǎo)的LECs衰老[37]。同時,有研究發(fā)現(xiàn)自噬降解底物p62的缺失與衰老相關(guān)的疾病有關(guān),并證實p62可以通過延緩衰老來促進(jìn)小鼠的壽命[38]。最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)ARC患者的LECs中自噬水平顯著增高,而p62蛋白水平顯著降低,最終導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降[39]。因此在氧化應(yīng)激下,晶狀體中過度活躍的自噬可能會導(dǎo)致細(xì)胞活力喪失,進(jìn)一步促進(jìn)ARC發(fā)生[40]。

最新的研究發(fā)現(xiàn),許多藥物可以調(diào)控自噬流的進(jìn)程。在ARC衰老小鼠模型的LECs中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低劑量二甲雙胍通過激活A(yù)MPK途徑和加速自噬溶酶體的降解過程,抑制衰老小鼠晶狀體混濁,從而延緩ARC進(jìn)程[41]。Xu等[42]研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖顯著增加自噬降解底物蛋白p62的表達(dá),抑制成熟的自噬小體LC3的降解,通過損害自噬流和線粒體功能誘發(fā)LECs衰老,而二甲雙胍可以通過降低ROS含量、增加ATP和MMP水平來改善線粒體功能,抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的LECs衰老。目前的研究可以證明,自噬流調(diào)控是ARC發(fā)生的重要機(jī)制,因此,開發(fā)調(diào)控自噬流通路的藥物可以為ARC的防治開辟新途徑。

2.3糖尿病性白內(nèi)障糖尿病性白內(nèi)障(diabetic cataract,DC)是糖尿病的常見并發(fā)癥,是糖尿病患者視力受損和失明的主要原因。DC的潛在機(jī)制尚不清楚,氧化損傷和EMT機(jī)制比較公認(rèn)。研究顯示,在DC患者的前囊膜LECs中Atgs的表達(dá)、AMPK及其下游調(diào)節(jié)因子TFEB和FOXO3的活性受到抑制,初步表明自噬活性下降與DC發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[43]。

在DC的發(fā)病機(jī)制研究中,高糖會導(dǎo)致LECs氧化損傷,而自噬能夠顯著減輕高糖誘導(dǎo)的LECs氧化損傷[44]。例如,補清顆粒通過促進(jìn)LECs內(nèi)Beclin1蛋白表達(dá),減弱mTOR在小鼠晶狀體中對自噬流的抑制作用,從而促進(jìn)自噬流的發(fā)生達(dá)到對DC小鼠起到治療作用;深入研究發(fā)現(xiàn),補清顆粒還通過影響線粒體自噬相關(guān)受體蛋白BNIP3/NIX、PINK1/PARKIN的表達(dá),上調(diào)線粒體自噬活性以清除受損線粒體,減輕高糖誘導(dǎo)的LECs線粒體損傷,延緩DC的發(fā)展[45-47]。此外,Liu等[48]研究發(fā)現(xiàn)在DC的小鼠模型LECs中,伴隨著持續(xù)的高糖刺激下,LC3水平雖然顯著升高,但是自噬降解底物蛋白p62先降低后升高,表明自噬流雖然在早期高糖刺激下增強(qiáng),但在持續(xù)高糖刺激后發(fā)現(xiàn)自噬流被阻斷。隨后的實驗發(fā)現(xiàn),超氧化物歧化酶2和過氧化氫酶先增加后降低,提示高糖誘導(dǎo)LECs中ROS生成增多,而隨著高糖刺激時間的延長,LECs內(nèi)抗氧化防御機(jī)制下調(diào),從而導(dǎo)致LECs發(fā)生氧化損傷導(dǎo)致自噬流降解階段異常,進(jìn)而誘發(fā)DC。

據(jù)報道,LECs的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)也是DC的發(fā)病機(jī)制之一[49],在DC的發(fā)展過程中,自噬參與LECs的EMT過程,研究證實高糖促進(jìn)EMT,而雷帕霉素不僅能夠激活自噬并且顯著抑制EMT通路,同時使參與EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail和p62水平下降,因此激活自噬可能改善DC中的晶狀體纖維化[50]。然而,過度活躍的自噬會加劇DC進(jìn)展。程榮等[51]在1型糖尿病模型鼠LECs中檢測到自噬功能失調(diào),自噬水平明顯增高,表現(xiàn)為自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、p62水平升高。盡管糖尿病模型鼠LECs中自噬體明顯增加,但是自噬小體和溶酶體結(jié)合能力出現(xiàn)明顯異常,成為誘發(fā)DC的關(guān)鍵。Li[52]研究表明高糖會激活HLECs中的自噬,過度活躍的自噬促進(jìn)HLECs遷移并增加TGF-β的表達(dá),參與DC的發(fā)生發(fā)展。據(jù)報道,miR-30a在DC患者的LECs組織中表達(dá)下降,同時,miR-30a可以通過靶向自噬起始階段基因Beclin1降低高糖誘導(dǎo)的自噬水平[53]。

先前的研究表明抗氧化劑如甘氨酸、姜黃素、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和谷胱甘肽乙酯(GSH-EE),能夠延緩DC的發(fā)生發(fā)展[54-56]。最新的研究表明,姜黃素類似物C1可以激活TFEB,增強(qiáng)溶酶體的生物合成和保護(hù)性自噬,從而減輕高糖誘導(dǎo)的DC[57]。此外,也有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇作為一種有效的抗氧化劑,通過激活p38激酶家族信號通路(MAPK)激活自噬,從而抑制高糖誘導(dǎo)的HLECs氧化損傷[44]。盡管已經(jīng)證明有藥物可以控制DC的進(jìn)展,但這些藥物尚未應(yīng)用于人類眼科疾病的臨床,未來還需要更深入的研究。

2.4后發(fā)性白內(nèi)障后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsular opacification,PCO)是白內(nèi)障手術(shù)后最常見的術(shù)后并發(fā)癥,主要由術(shù)后晶狀體囊內(nèi)殘留LECs的增殖、遷移和EMT等形成[58]。防止PCO的有效方式是在白內(nèi)障摘除術(shù)中盡量消除晶狀體囊袋內(nèi)的LECs或抑制殘留的LECs增生和遷移。

近來,一些學(xué)者開發(fā)載藥人工晶狀體,通過加入藥物激活自噬,從而抑制LECs的增生和遷移[59]。據(jù)報道,環(huán)孢素A是一種免疫抑制劑,在體外可以抑制LECs增殖[60]。深入研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)環(huán)孢素A處理后的LECs中LC3Ⅱ表達(dá)顯著增加,而細(xì)胞存活率嚴(yán)重下降,隨后通過體外實驗發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A誘導(dǎo)細(xì)胞自噬性死亡,防止PCO的形成,揭示自噬在PCO防治方面的重要作用[61]。同樣,在載藥人工晶狀體中注入聚氨基酰胺(PAMAM)聚合物后,發(fā)現(xiàn)自噬增強(qiáng),LC3Ⅱ水平增加,有效地抑制白內(nèi)障術(shù)后PCO發(fā)生,并且不會對其他眼部組織造成損害[62]。

此外,有研究首次在ARC患者術(shù)后分析LECs凋亡的情況,發(fā)現(xiàn)1%臺盼藍(lán)誘導(dǎo)LECs自噬性細(xì)胞死亡,表明1%臺盼藍(lán)染色有助于降低白內(nèi)障術(shù)后PCO發(fā)生率[63]。Liu等[64]研究發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷(sulforapgane,SFN)可誘導(dǎo)ROS,并激活MAPK信號通路,通過增加LC3Ⅱ和自噬囊泡的形成,促進(jìn)HLECs自噬性死亡,從而延緩PCO進(jìn)程。最近一項預(yù)防PCO的研究表明PP242在體外顯著抑制mTORC1和mTORC2介導(dǎo)的信號通路,抑制LECs的增殖和遷移,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,需要進(jìn)一步研究確定自噬和mTOR信號通路在LECs死亡中的調(diào)節(jié)機(jī)制[65]。關(guān)于細(xì)胞死亡和自噬與PCO之間的聯(lián)系的研究將在未來引起人們的廣泛關(guān)注。

EMT是術(shù)后PCO形成的重要機(jī)制。而有研究發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障手術(shù)刺激導(dǎo)致房水中的TGF-β2顯著升高,是觸發(fā)EMT的關(guān)鍵因素[66],EMT導(dǎo)致后囊膜混濁,被稱為纖維性白內(nèi)障[67],抑制EMT可能是治療PCO的有效途徑之一。Sun等[68]研究證實TGF-β2促進(jìn)LECs中初級自噬小體LC3Ⅰ向成熟自噬小體LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化和p62的降解,從而促進(jìn)自噬小泡的形成和自噬溶酶體的融合降解過程,說明過度活躍的自噬將導(dǎo)致LECs發(fā)生EMT,進(jìn)而誘發(fā)PCO。Atg7基因沉默通過降低LC3脂質(zhì)化,抑制TGF-β2在LECs中誘導(dǎo)的纖維化作用,延緩PCO的發(fā)展。此外,自噬抑制劑可通過抑制Smad2/3的磷酸化,減弱TGF-β2途徑,這表明調(diào)控TGF-β/Smad信號通路抑制自噬,可能延緩LECs中EMT。Li等[69]研究表明柚皮素(NRG)可通過減弱Smad2/3磷酸化,抑制HLECs自噬和EMT,為預(yù)防和治療PCO提供了自噬相關(guān)的見解。目前,對于自噬流調(diào)控與PCO關(guān)系的研究,主要是檢測自噬標(biāo)志物水平,具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3 總結(jié)和展望

綜上所述,自噬在白內(nèi)障中起著雙重作用,良性自噬可以減少氧化應(yīng)激以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),而在其他條件下,毒性自噬的上調(diào)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。雖然自噬在白內(nèi)障中的作用得到了一定的研究,但其在白內(nèi)障中的具體作用機(jī)制、分子通路、相互作用等還有很多未知,有待進(jìn)一步研究。同時,針對自噬流調(diào)控機(jī)制的藥物和非編碼RNA等干預(yù)靶標(biāo)值得早日在動物體內(nèi)模型中開展轉(zhuǎn)化實驗。因此,深入研究并了解自噬在白內(nèi)障眼病中的調(diào)控機(jī)制,可以為白內(nèi)障患者的防治提供針對性的選擇。