分子改造羰基還原酶CpCR提高其催化合成2-苯乙醇能力

陳孟軍,呂育財(cái),龔大春,郭金玲*

1(三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌,443002)2(湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心(三峽大學(xué)),湖北 宜昌,443002)

2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)是一種有玫瑰香味和良好理化性質(zhì)的高級(jí)芳香醇,天然存在于玫瑰、茉莉等植物的葉、花及提取的精油中[1],不僅如此,2-PE還可作為食品添加劑對(duì)葡萄酒、黃酒、面包等發(fā)酵食品中風(fēng)味物質(zhì)起增效作用[2],其作為殺菌劑、植物保鮮劑以及作為底物合成高附加值藥物,在日化用品、醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用[3]。目前,2-PE的生產(chǎn)方法主要有植物提取、化學(xué)合成和生物合成3種。植物提取法和化學(xué)合成法因原料和副產(chǎn)物問(wèn)題造成成本高及產(chǎn)品質(zhì)量差[4]。與之相比,生物合成法以生產(chǎn)周期短,反應(yīng)條件溫和、環(huán)保,原料廉價(jià)易得等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為研究熱點(diǎn)[5]。

目前國(guó)內(nèi)外發(fā)酵生產(chǎn)2-PE所用菌種主要有釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[6]、克魯維酵母(Kluyveromyces)[7]、畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)[8]等,但其生產(chǎn)率低,不適合工業(yè)化。基因工程改造的菌株,如WANG等[9]構(gòu)建的重組釀酒酵母YS58(G1-A8-A10-A2)GDH在最佳反應(yīng)條件下,5 L發(fā)酵罐2-PE產(chǎn)量高達(dá)6.3 g/L。YANG等[10]構(gòu)建的重組大腸桿菌上調(diào)艾氏途徑中苯乙醛合成酶PAAS的表達(dá),2-PE產(chǎn)量為0.39 g/L。ZHANG等[11]通過(guò)過(guò)量表達(dá)苯丙酮酸途徑中磷酸烯醇式丙酮酸合酶ppsA和轉(zhuǎn)酮酶tktA,構(gòu)建的重組大腸桿菌2-PE產(chǎn)量為0.32 g/L。雖然基因工程菌都有較高的2-PE產(chǎn)量,但高濃度的2-PE對(duì)細(xì)胞的毒性已成為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2-PE的瓶頸問(wèn)題[7]。酶法合成則不會(huì)受到產(chǎn)物對(duì)微生物的抑制[12]。然而,大多數(shù)天然酶的活性、穩(wěn)定性和選擇性不符合非天然過(guò)程要求,不適合工業(yè)應(yīng)用[13]。因此,可以獲得穩(wěn)定性好、酶活性高的蛋白質(zhì)工程技術(shù)受到廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)工程通過(guò)理性設(shè)計(jì)和半理性設(shè)計(jì)提高酶的催化性能[14-18],但由于理性設(shè)計(jì)模型的限制,往往會(huì)導(dǎo)致改造效果不佳,因而半理性設(shè)計(jì)成為一種新的分子改造手段。近年來(lái),利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的信息以及預(yù)測(cè)算法來(lái)預(yù)選合適的靶點(diǎn)[19],已被用于增加近平滑假絲酵母羰基還原酶的活性與穩(wěn)定性[14-15],馬氏克魯維酵母醛酮還原酶的活性與立體選擇性[16-17],腈水合酶的熱穩(wěn)定性[19]。半理性設(shè)計(jì)的方法已成為研究者改進(jìn)生物催化劑有力且有效的新策略[19]。

本文擬通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建羰基還原酶CpCR突變文庫(kù),利用2,4-二硝基苯肼(2,4 dinitrophenylhydrazine,DNPH)高通量篩選陽(yáng)性突變株,通過(guò)測(cè)序技術(shù)確定氨基酸突變位點(diǎn),再利用半理性設(shè)計(jì)進(jìn)行虛擬飽和突變,發(fā)現(xiàn)更好的突變位點(diǎn),然后采用定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建和評(píng)價(jià),篩選得到2-PE產(chǎn)率高的突變酶,并研究催化時(shí)間、溫度、pH、底物濃度等因素對(duì)羰基還原酶CpCR催化轉(zhuǎn)化2-PE的影響,為酶法合成2-PE提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株pACYC Duet-1EscherichiacoliBL21 (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存;即用型易錯(cuò)PCR試劑盒,北京天恩澤基因科技有限公司;限制性酶切酶SalI和PstI,New England Biolabs;質(zhì)粒載體pACYCDuet-1,上海生工生物工程有限公司;DNPH、苯乙醛(phenylacetaldehyde, PAAH),2-苯乙醇,1-(4-氯苯基)乙醇,進(jìn)口或分析純;葡萄糖脫氫酶,安琪酵母股份有限公司;Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2試劑盒,Vazyme/諾唯贊生物科技有限公司。

SX-700蒸汽滅菌器、MX-307落地高速冷凍離心機(jī),日本Tomy公司;SWCJ-2FD超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司;LRH-250A生化培養(yǎng)箱,泰宏醫(yī)療器械有限公司;UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),島津企業(yè)管理有限公司;ZQLY-180S恒溫培養(yǎng)搖床,上海知楚儀器有限公司,JY92-IIDN超聲破碎儀、FL-GC9720氣相色譜儀、C1000 Touch PCR儀、Doc XR+ Gel凝膠成像儀,Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 突變文庫(kù)的構(gòu)建及高通量篩選

采用易錯(cuò)PCR的方法,易錯(cuò)PCR引物如下所示。

ep-F:5-ATTGCCTGCAG(Pst I)ATGACTAAAGCAGTACCAGACA-3;ep-R:5-ACTTGTCGAC(Sal I)TAAGCTTTGAATGCTTTGTCG-3。

反應(yīng)體系為:3 μL Mix,20 ng pACYCDuet-1-cpcr模板,3 μL dNTP,3 μL MnCl2,1 μL ep-F(10 μmol/L),1 μL ep-R(10 μmol/L),0.5 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL),17.5 μL dd H2O。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,64 ℃退火20 s,72 ℃延伸45 s,循環(huán)30次,72 ℃繼續(xù)延伸5 min。

使用限制性內(nèi)切酶將PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體pACYC Duet-1 的PstI和SalI位點(diǎn)之間,再轉(zhuǎn)化至E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,培養(yǎng)1 h,將重組細(xì)胞涂布至含有25 μg/mL氯霉素的LB平板上,37 ℃下避光過(guò)夜培養(yǎng)構(gòu)建隨機(jī)文庫(kù)[20]。

利用DNPH能與醛或酮發(fā)生縮合反應(yīng),生成紅色或黃色的二硝基苯腙沉淀,且所生成的硝基苯腙沉淀可被堿性溶液溶解而生成紅棕色的溶液這一高靈敏度特征反應(yīng)對(duì)易錯(cuò)PCR突變庫(kù)進(jìn)行96深孔板(2.2 mL)高通量篩選[21](圖1)?？刂泼阜磻?yīng)體系體積為100 μL:粗酶液20 μL,10 μL 0.1 mol/L的葡萄糖溶液,10 μL的GDH,60 μL 10 mmol/L的PAAH溶液。30 ℃,200 r/min催化40 min后加入100 μL 4 g/L的DNPH后繼續(xù)反應(yīng)30 min。加入1 mL的100 g/L KOH溶液顯色,混勻靜置10 min后取上清液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。確定反應(yīng)體系中不同含羰基組分生成的苯腙衍生物最大吸收波長(zhǎng)。

圖1 DNPH法篩選流程Fig.1 Screening process for DNPH method

1.2.2 半理性設(shè)計(jì)改造及驗(yàn)證

1.2.2.1 半理性設(shè)計(jì)改造

利用Discovery Studio 2017軟件將羰基還原酶CpCR(PDB號(hào):4OAQ)與底物PAAH分子進(jìn)行半柔性CDOCKER對(duì)接,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,酶與底物結(jié)合口袋以及輔酶結(jié)合部位附近的氨基酸殘基對(duì)酶活性有重要影響[22-23],因此,在易錯(cuò)PCR篩選出的氨基酸殘基位點(diǎn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合酶與底物結(jié)合口袋及輔酶結(jié)合部位附近的對(duì)接結(jié)果,對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。利用Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2試劑盒進(jìn)行定點(diǎn)突變,構(gòu)建突變文庫(kù),經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后培養(yǎng)并保藏菌種待用。

1.2.2.2 酶活力及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以PAAH為底物,突變體酶與wtCpCR的酶活力測(cè)定及計(jì)算方法參照文獻(xiàn)[21]。選用0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mmol/L等不同濃度,測(cè)定wtCpCR和突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值。計(jì)算催化常數(shù)kcat及催化特異常數(shù)kcat/Km。比較野生型酶CpCR和突變體酶對(duì)PAAH的親和能力和催化效率。

1.2.2.3 羰基還原酶及其突變體的熱穩(wěn)定性研究

取適量酶溶液,置于50 r/min、30 ℃的水浴鍋中進(jìn)行溫育。定時(shí)取樣,測(cè)定剩余酶活力,確定各種酶在不同體系中的半衰期。取適量酶溶液置于4～50 ℃條件下保溫2 h,測(cè)定不同溫度下剩余酶活力,計(jì)算該酶的T50(酶活力降低至初始酶活力的50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度)值,考察該酶溫度穩(wěn)定性。

1.2.3 2-PE的轉(zhuǎn)化合成和檢測(cè)方法

1.2.3.1 2-PE的轉(zhuǎn)化合成

篩選得到的突變株經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)后,濕菌體加入適當(dāng)體積的磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.5)重懸,超聲破碎(工作4 s,停6 s,總時(shí)間25 min)后,10 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液即為粗酶液。酶催化體系為:總體系10 mL,包含1 mL粗酶液(比酶活力約為3 U/mg),0.1 g葡萄糖,0.2 mL GDH,質(zhì)量濃度為800 mg/L的PAAH溶液。30 ℃,200 r/min反應(yīng)12 h。

1.2.3.2 2-PE的檢測(cè)方法

取0.5 mL轉(zhuǎn)化后的樣品,加入0.1 mL 0.966 mg/mL的內(nèi)標(biāo)物[1-(4-氯苯基)乙醇],用3倍體積的正己烷萃取反應(yīng)溶液,10 000 r/min離心2 min取上相。用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。色譜條件:DB-FFAP色譜柱(30 m×0.250 mm×30.25 μm);柱溫采用程序升溫:初溫80 ℃,保持5 min后以10 ℃/min速率升至200 ℃;進(jìn)樣口溫度260 ℃,載氣N2,流速0.7 mL/min分流進(jìn)樣,分流比10∶1。FID檢測(cè)器260 ℃,H240 mL/min;空氣 400 mL/min;尾吹氣 30 mL/min。進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 影響酶催化合成2-PE的因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 催化時(shí)間

取適量粗酶液,按照1.2.2節(jié)的方法轉(zhuǎn)化合成2-PE,分別在0、2、4、6、8、10、12 h取樣,氣相色譜檢測(cè)PAAH和2-PE含量,計(jì)算轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率,考察酶完成催化反應(yīng)所需時(shí)間。

1.2.4.2 溫度

取適量粗酶液,按照1.2.2節(jié)的方法在28～38 ℃條件下轉(zhuǎn)化合成2-PE,氣相色譜檢測(cè)PAAH和2-PE含量,通過(guò)產(chǎn)率考察酶最適催化溫度。

1.2.4.3 pH

分別配制pH 5.5～8.5的0.1 mol/L的磷酸緩沖液,按照1.2.2節(jié)的方法分別破碎得到粗酶液,用不同pH的磷酸緩沖液配制800 mg/L的PAAH溶液,以1.2.4.2節(jié)中最適溫度條件下轉(zhuǎn)化合成2-PE,檢測(cè)PAAH和2-PE含量,計(jì)算產(chǎn)率,考察酶最適催化pH。

1.2.4.4 底物濃度

取適量粗酶液,在不同質(zhì)量濃度底物PAAH溶液(400～1 600 mg/L)條件下催化合成2-PE,按照1.2.2節(jié)的方法,在1.2.4.2和1.2.4.3中最適溫度和pH條件下轉(zhuǎn)化合成2-PE,以產(chǎn)率高低確定最適底物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)2-PE突變株的篩選

在DNPH法篩選的酶反應(yīng)體系中,除了底物PAAH外,其他成分包括輔酶NADPH、葡萄糖、GDH、羰基還原酶CpCR都可能與DNPH反應(yīng),從而影響DNPH檢測(cè)法的準(zhǔn)確性。圖2為PAAH和反應(yīng)體系中含有羰基的其他組分與DNPH反應(yīng)后的全波長(zhǎng)掃描對(duì)比圖,結(jié)果顯示堿性條件下PAAH與DNPH生成的對(duì)應(yīng)的苯腙在510 nm波長(zhǎng)處具有特征吸收峰,而其他干擾組分的特征吸收峰均在350～430 nm,說(shuō)明反應(yīng)體系中除底物以外的其他組分對(duì)DNPH檢測(cè)法干擾很小,這一結(jié)論與周婕妤[24]的結(jié)論基本一致。

圖2 NADPH、葡萄糖、GDH、CpCR、PAAH與DNPH反應(yīng)的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.2 Absorbance spectrums of NADPH, glucose, GDH, CpCR and PAAH with DNPH

根據(jù)易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系構(gòu)建了隨機(jī)突變文庫(kù),突變后大部分突變菌株失活,僅有約10%的突變體保持對(duì)PAAH的還原活性,序列比對(duì)后根據(jù)突變氨基酸殘基序列將突變體CpCR分為40～120、121～200、201～280、281～360四部分,以底物PAAH的轉(zhuǎn)化率和OD510值為篩選標(biāo)準(zhǔn)的易錯(cuò)PCR結(jié)果如圖3所示,OD510值越小、轉(zhuǎn)化率越高的突變體為正突變體,選擇正突變體的氨基酸殘基位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的半理性設(shè)計(jì)和酶的改造。

圖3 易錯(cuò)PCR篩選結(jié)果Fig.3 Screening of mutants from Error-prone PCR

2.2 半理性設(shè)計(jì)改造及驗(yàn)證

2.2.1 半理性設(shè)計(jì)改造

易錯(cuò)PCR篩選出的正突變體經(jīng)測(cè)序、序列比對(duì)后得到Ile52、Thr54、Ala121、Leu165、Thr171、Pro284、Pro285、Lys289等氨基酸殘基突變位點(diǎn)。CpCR(PDB號(hào):4OAQ)與PAAH分子對(duì)接如圖4-a所示,圖4-b展示了酶與底物結(jié)合口袋及輔酶結(jié)合部位的氨基酸殘基位點(diǎn),圖4-c表示酶與底物對(duì)接的氫鍵相互作用強(qiáng)弱。

結(jié)合易錯(cuò)PCR篩選結(jié)果分別對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變。計(jì)算其結(jié)合突變能,結(jié)果如圖5所示,根據(jù)突變自由能比較[ΔΔGmut=ΔΔGfold(mutant)-ΔΔGfold(wild type)],選擇突變能最低的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變,得到S50N、Q60W、A97K、L165D、T171F、P284E和L309W等7個(gè)突變體。

圖5 不同氨基酸殘基飽和突變能Fig.5 Saturation mutation energy of different amino acid residues

2.2.2 酶活力及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

以wtCpCR作為參照,不同突變體酶的相對(duì)酶活力如圖6-a所示,實(shí)驗(yàn)表明,T171F和L165D酶活力分別為11.46和11.96 U/mg,相比wtCpCR分別提高了10.14%和12.86%,說(shuō)明171位和165位的氨基酸飽和突變?cè)鰪?qiáng)了酶的催化能力。其余突變體酶的相對(duì)酶活力均有不同程度的減小。L309W的酶活力降至wtCpCR的10.43%,說(shuō)明309位的亮氨酸是酶催化活性的關(guān)鍵位點(diǎn)。如圖6-b所示,T171F和L165D催化合成2-PE的產(chǎn)率分別為91.31%和84.92%,相比wtCpCR分別提高了1.36倍和1.20倍。L309W產(chǎn)率降至2%以下,Q60W產(chǎn)率降低至29.9%,其余突變體酶的產(chǎn)率均有不同程度的提升。

a-相對(duì)酶活力;b-催化合成2-PE產(chǎn)率

酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和催化特性參數(shù)反映了酶結(jié)合底物能力和催化反應(yīng)速率,以wtCpCR和7種突變體酶為對(duì)象測(cè)定酶對(duì)PAAH的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和催化特性參數(shù),結(jié)果如表1所示,羰基還原酶wtCpCR及其突變體對(duì)PAAH的親和力均較高,其中T171F和L165D的最大反應(yīng)速率分別為wtCpCR的2.59倍和2.42倍。每個(gè)T171F分子和L165D分子1 s分別可以轉(zhuǎn)化16個(gè)和14個(gè)左右的PAAH分子。雖然較高的Km值意味著對(duì)底物的親和力低,但較高的kcat值更可取,因?yàn)樯a(chǎn)應(yīng)用中高底物負(fù)荷可以完全彌補(bǔ)低親和力的不足,催化效率的衡量標(biāo)準(zhǔn)是高kcat值而不是高kcat/Km[25]。此外,酶與底物親和力較低,其底物抑制可能更弱[26]。本文中T171F的2-PE產(chǎn)率和kcat值均高于L165D,而其kcat/Km值卻低于后者,與SU等[25]的研究結(jié)論一致。

表1 不同突變株對(duì)PAAH的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)及催化特性參數(shù)Table 1 Enzyme kinetic parameters and catalytic characteristic parameters of different mutants for PAAH

2.2.3 羰基還原酶及其突變體的熱穩(wěn)定性研究

從圖7-a中可以看出,在PB緩沖液中,T171F、S50N、A97K的半衰期相比wtCpCR有所提升,其中T171F的半衰期提升至28 h。其余突變體酶半衰期均下降。由圖7-b可知,突變酶的熱穩(wěn)定性有一定的變化,其中T171F的T50值為37 ℃,比wtCpCR提高1 ℃。L309W、Q60W和L165D的T50值為30～32 ℃,下降較大,酶的耐溫性降低。

a-半衰期;b-T50值

結(jié)合突變酶的相對(duì)比活力、催化合成2-PE產(chǎn)率、催化特性參數(shù)kcat值、以及半衰期和T50值,突變體T171F具有更強(qiáng)的催化能力和熱穩(wěn)定性,具有更好應(yīng)用前景。因此,選擇突變體T171F與wtCpCR進(jìn)行催化合成2-PE條件研究。

2.3 突變體酶催化合成2-PE條件研究

以2.2節(jié)中篩選得到突變體酶T171F和wtCpCR催化合成2-PE的條件相對(duì)比,考察了催化時(shí)間、溫度、pH、底物添加量等關(guān)鍵因素對(duì)酶催化合成2-PE的影響。

2.3.1 催化時(shí)間對(duì)合成2-PE的影響

酶催化相比于整細(xì)胞催化具有用時(shí)短,效率高的特點(diǎn),按照1.2.4.1節(jié)中的方法,考察了突變體酶T171F和wtCpCR在12 h內(nèi)2-PE的轉(zhuǎn)化合成情況。結(jié)果如圖8所示,wtCpCR可在10 h內(nèi)基本完成轉(zhuǎn)化反應(yīng),產(chǎn)率為42.61%,而突變體酶可在4 h內(nèi)完成轉(zhuǎn)化反應(yīng)且產(chǎn)率可達(dá)90%以上,說(shuō)明突變體酶T171F的催化效率相比wtCpCR有著較大的提升。

圖8 酶催化時(shí)間對(duì)合成2-PE的影響Fig.8 Effect of reaction time on enzyme synthesis of 2-PE

2.3.2 最適催化溫度

溫度可通過(guò)影響酶活性來(lái)影響產(chǎn)物的合成。參考wtCpCR溫度穩(wěn)定性以及最適溫度條件[24],按照1.2.3.2節(jié)中的方法考察了28～38 ℃下的2-PE的合成情況。結(jié)果如圖9所示,突變體酶T171F的最適催化溫度為30 ℃,與wtCpCR一致。且其在28～32 ℃之間產(chǎn)率都能達(dá)到80%以上。

圖9 溫度對(duì)酶催化合成2-PE的影響Fig.9 Effect of temperature on enzymatic synthesis of 2-PE

2.3.3 最適催化pH

pH值可以改變酶活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài),從而影響酶與底物的結(jié)合,按照1.2.4.3節(jié)中的方法,考察了突變體酶T171F和wtCpCR在pH 5.5～8.5條件下2-PE的轉(zhuǎn)化合成情況,結(jié)果如圖10所示,wtCpCR最適催化pH值為7.0,產(chǎn)率可達(dá)54.7%,相比初始條件pH 7.5提高了近25%,且其在偏堿性范圍內(nèi)產(chǎn)率更高。T171F最適催化pH值為6.5,產(chǎn)率可達(dá)95%,但其在偏酸性范圍內(nèi)的產(chǎn)率更高,達(dá)到80%以上,且當(dāng)pH值超過(guò)7.5時(shí)產(chǎn)率迅速降低至60%左右。說(shuō)明171位的氨基酸突變改變了酶對(duì)PAAH的pH條件要求,從偏堿性改變?yōu)槠嵝浴?/p>

圖10 pH對(duì)酶催化合成2-PE的影響Fig.10 Effect of pH on enzymatic synthesis of 2-PE

2.3.4 底物濃度對(duì)酶催化合成2-PE的影響

底物濃度是酶催化效率的重要指標(biāo),在一定濃度的底物范圍內(nèi),反應(yīng)速率隨底物濃度的增大而增大,但底物濃度過(guò)高時(shí)反而會(huì)出現(xiàn)抱團(tuán)現(xiàn)象,導(dǎo)致酶底物結(jié)合口袋不適合容納大基團(tuán)底物,影響酶的催化效果[26],按照1.2.4.4節(jié)中的轉(zhuǎn)化方法,考察了突變體酶T171F和wtCpCR在不同底物質(zhì)量濃度(400～1 600 mg/L)下2-PE的轉(zhuǎn)化合成情況。由圖11可知,wtCpCR在底物質(zhì)量濃度為400 mg/L時(shí)產(chǎn)率達(dá)到87%,但產(chǎn)率卻隨著底物濃度的增大而迅速降低,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為800 mg/L時(shí)產(chǎn)率降至43%。而T171F的產(chǎn)率在底物質(zhì)量濃度≤1 000 mg/L時(shí)均可達(dá)90%以上,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度>1 000 mg/L時(shí),產(chǎn)率迅速降低。因此,突變體酶T171F能夠耐受更高的底物濃度,具有更好的應(yīng)用前景。

圖11 底物濃度對(duì)酶催化合成2-PE的影響Fig.11 Effect of substrate concentration on enzymatic synthesis of 2-PE

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建PAAH還原為2-PE的醛基還原酶突變文庫(kù),利用DNPH與醛基形成苯腙的特點(diǎn)高通量篩選獲得正突變體,結(jié)合基因測(cè)序找出氨基酸突變位點(diǎn),再通過(guò)Discovery Studio軟件進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)和定點(diǎn)飽和突變技術(shù)構(gòu)建7個(gè)突變體酶S50N、Q60W、A97K、L165D、T171F、P284E、L309W。結(jié)合相對(duì)酶活力、酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)、酶的熱穩(wěn)定性及催化合成2-PE產(chǎn)率分析,突變體T171F具有更強(qiáng)的催化能力和熱穩(wěn)定性。進(jìn)一步研究了突變株T171F與wtCpCR進(jìn)行酶催化轉(zhuǎn)化2-PE工藝條件研究。結(jié)果表明,酶最適催化合成2-PE的溫度為30 ℃;T171F最適pH為6.5,wtCpCR最適pH為7.0;PAAH質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí),T171F產(chǎn)率可達(dá)90%以上,wtCpCR則只有31.7%。而且突變體T171F相比wtCpCR催化時(shí)間由10 h降低到4 h,催化效率得到很大的提高。本研究為羰基還原酶CpCR催化合成2-PE提供重要的科學(xué)依據(jù)。