熔融尿素法提取廢棄羊毛角蛋白的機(jī)制

薩如拉,曹 蝶,張志潔,楊曉雪,邢佳佳,劉 爽,宋媛媛

(赤峰學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

羊毛作為一種天然蛋白質(zhì)資源,其角蛋白含量高達(dá)95%,被認(rèn)為是一種有巨大潛在價(jià)值的蛋白質(zhì)資源[1-2]。山羊毛經(jīng)提絨后殘留大量的廢棄粗長毛,回收利用率低,我國每年平均生產(chǎn)9 萬t左右的粗長毛及廢棄羊毛織物,它們的質(zhì)量低下、加工難度大、不易降解,絕大部分都被廢棄、填埋、焚燒而很難得到充分利用,不僅污染環(huán)境,而且浪費(fèi)了大量的動(dòng)物性蛋白資源[3-5]。開發(fā)新型羊毛角蛋白提取技術(shù)是實(shí)現(xiàn)廢棄羊毛高效利用、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的途徑[6-7]。羊毛主要成分為角蛋白[8],角蛋白由胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等18種氨基酸組成[9],具有親膚性、生物相容性、對人體無毒無刺激性等多種優(yōu)良特性,有較高的再生價(jià)值[10]。角蛋白的提取是廢棄羊毛有效利用的至關(guān)重要的步驟,目前羊毛角蛋白的提取方法主要有氧化法、酸堿法、還原法、金屬鹽法、酶法、離子液體法、低共熔體系法、熔融尿素法[11-13]等。熔融尿素法采用價(jià)格低廉的尿素為原料,在尿素熔點(diǎn)(132.7 ℃)以上溫度進(jìn)行溶解羊毛試驗(yàn)。溶融尿素法用料單一,需要時(shí)間短,尿素和羊毛角蛋白的分離過程簡便,羊毛溶解率較高,熔融后產(chǎn)生的尿素廢液可以作為農(nóng)業(yè)肥料回收利用[7-8]。利用熔融尿素法提取羊毛角蛋白綠色環(huán)保,具有實(shí)用價(jià)值,適合未來發(fā)展趨勢。

根據(jù)Tanahashi等[14]、Murate 等[15]的研究,尿素溶解羊毛可能是熔融尿素在高溫下分解產(chǎn)生氨氣,進(jìn)入角蛋白結(jié)晶區(qū),破壞角蛋白之間的氫鍵所致。本文以羊毛為原料,采用熔融尿素法提取羊毛角蛋白,研究羊毛/尿素質(zhì)量比、提取溫度、提取時(shí)間對羊毛溶解率和羊毛角蛋白提取率的影響。同時(shí),為了研究羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解機(jī)制,以白蛋白模擬羊毛角蛋白的化學(xué)鍵及結(jié)構(gòu),推測了羊毛角蛋白在熔融尿素中的溶解程度及溶解機(jī)制,為后續(xù)廢棄羊毛的高效利用以及動(dòng)物性纖維的再利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

材料:羊毛(產(chǎn)于內(nèi)蒙古克什克騰旗),色氨酸、苯丙氨酸、尿素、乙酸乙酯、硫酸鈉、丙酮均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),白蛋白(分子量40 000,北京亞米生物科技有限公司),纖維素透析袋(分子量8 000～10 000,上海源葉生物科技有限公司)。

儀器:HH-SA型高溫油浴鍋(金壇市順華儀器有限公司)、CS101-AB烘干箱(重慶試驗(yàn)設(shè)備廠)、FA-1004型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)、BR4I型離心機(jī)(Thermo公司)、RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、GCMS-TQ8040型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司)、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羊毛預(yù)處理

羊毛先用洗潔精清洗干凈,再用蒸餾水清洗至無洗潔精殘留,曬干,備用。

1.2.2 熔融尿素法提取羊毛角蛋白

稱取一定量的尿素倒入燒杯中,把燒杯放入加熱至一定溫度的油浴鍋中恒溫加熱,尿素完全熔融后放入一定量的羊毛溶解一定時(shí)間,從油浴鍋中取出燒杯,為了防止尿素凝固,在燒杯中加入100 mL蒸餾水,過濾,烘干被截留物,作為不溶物。濾液裝入纖維素透析袋中靜止透析48 h(每12 h換一次蒸餾水),最后烘干透析袋中的溶液,得到主要成分為角蛋白的羊毛角蛋白[7-8]。羊毛的溶解率按式(1)計(jì)算,羊毛角蛋白的提取率按式(2)計(jì)算。

(1)

(2)

式中:D1為不溶物質(zhì)量,g;D0為羊毛質(zhì)量,g;D2為羊毛角蛋白質(zhì)量,g。

1.2.3 白蛋白分子量的測定

準(zhǔn)確稱量4份6.25 g尿素倒入燒杯中,把燒杯放入160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,在熔融尿素中各加入0.5 g白蛋白,分別反應(yīng)10、20、40、80 min后取出燒杯,燒杯中加入100 mL 蒸餾水后倒入纖維素透析袋中進(jìn)行靜止透析 48 h(每12 h換一次蒸餾水),過濾透析袋中的溶液,沉淀為非水溶性蛋白,濾液為水溶性蛋白。以白蛋白為參照物,將水溶性蛋白為原料,以15% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定其分子量[16-17]。

1.2.4 白蛋白與熔融尿素的反應(yīng)

準(zhǔn)確稱量6.25 g尿素倒入燒杯中,把燒杯放入 160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,在熔融尿素中加入0.5 g 白蛋白,反應(yīng)20 min 后取出燒杯,燒杯中加100 mL蒸餾水后倒入纖維素透析袋中進(jìn)行靜止透析,透析3 h后取透析外液150 mL,使用150 mL乙酸乙酯分液3次,取有機(jī)層,硫酸鈉脫水有機(jī)層,濃縮干燥。稱取濃縮物1 mg于10 mL離心管中,加入1 mL丙酮溶解,使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行分析。

使用設(shè)備及測定條件: GC-MS-QP5050A;毛細(xì)管柱: DB-5MS(J&W Scientific)、0.25 mm (I.D.)× 30 m ( L) × 0.5 μm;載氣He;電離方式EI;電離電壓 70 eV。成分分析條件為:進(jìn)樣溫度230 ℃;氣化室溫度300 ℃;升溫程序:初始溫度100 ℃保持5 min,以10 ℃/min 速率升至300 ℃,保持5 min;分析時(shí)間 5～30 min。

1.2.5 氨基酸與熔融尿素的反應(yīng)

準(zhǔn)確稱量2份6.25 g 尿素倒入燒杯中,把燒杯放入160 ℃恒溫油浴鍋中使尿素完全熔融,熔融尿素中分別加入色氨酸和苯丙氨酸各0.5 g,反應(yīng)20 min后取出燒杯,燒杯中加50 mL 蒸餾水,再加100 mL乙酸乙酯分液3次,取有機(jī)層,硫酸鈉脫水有機(jī)層,濃縮干燥。稱取濃縮物1 mg于10 mL離心管中,加入1 mL丙酮溶解,進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)分析。使用設(shè)備及測定條件為同1.2.4節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊毛與尿素質(zhì)量比對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法,稱取5份1 g羊毛,分別放入7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g、160 ℃的熔融尿素中,反應(yīng)20 min提取羊毛角蛋白,測試并計(jì)算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

羊毛/尿素質(zhì)量比對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖1所示。隨著尿素質(zhì)量比例的增加,羊毛溶解率和角蛋白提取率也增加,當(dāng)m(羊毛)∶m(尿素)達(dá)到1∶12.5時(shí),溶解率和提取率都達(dá)到了最高值。m(羊毛)∶m(尿素)小于1∶12.5時(shí),熔融尿素量較小,不能完全浸沒羊毛,雖然有攪拌,但有些羊毛仍然未能與熔融尿素充分接觸,導(dǎo)致溶解率和提取率較低。m(羊毛)∶m(尿素)增加至1∶12.5以上時(shí),熔融尿素與羊毛能夠充分接觸,提高了羊毛溶解率和角蛋白提取率。m(羊毛)∶m(尿素)再增加時(shí)溶解率和提取率的提高幅度較小,基本不再提升,說明羊毛溶解率和角蛋白提取率都達(dá)到了最高值。因此,最佳羊毛與尿素質(zhì)量比為1∶12.5。本文試驗(yàn)中提取率比溶解率低的可能原因?yàn)樵?60 ℃、20 min條件下,被溶解的羊毛蛋白質(zhì)(高分子)的一部分被降解成較小分子的蛋白質(zhì)或多肽,甚至有可能降解成氨基酸,部分分子量小于8 000的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸透過透析袋進(jìn)入了透析外液中被棄掉,因此提取率低于溶解率。

圖1 羊毛與尿素質(zhì)量比對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of wool/urea mass ratio on wool dissolution rate and keratin extraction rate

2.2 反應(yīng)溫度對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法,稱取5份1 g羊毛,分別放入140、150、160、170、180 ℃的12.5 g熔融尿素中,反應(yīng)20 min提取羊毛角蛋白,測試并計(jì)算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反應(yīng)溫度對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖2所示。雖然160 ℃時(shí)羊毛溶解率最高,但各加熱溫度條件下羊毛溶解率變化幅度較小。反應(yīng)溫度140 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min以上時(shí),能夠溶于熔融尿素的羊毛角蛋白全部溶解。隨著反應(yīng)溫度的上升角蛋白提取率逐漸下降,可能原因?yàn)榉磻?yīng)溫度較低時(shí)羊毛角蛋白的化學(xué)鍵不易斷裂、角蛋白降解程度較低、角蛋白分子量較大,不易透過透析袋,較多的角蛋白留在透析袋中,因此角蛋白的提取率較高。但是隨著反應(yīng)溫度的上升,角蛋白的有些化學(xué)鍵被斷裂,高分子量角蛋白可能降解成低分子量的角蛋白、短肽、游離氨基酸等,容易透過透析袋,使提取率降低。

圖2 反應(yīng)溫度對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

2.3 反應(yīng)時(shí)間對溶解率和提取率的影響

按照1.2.2節(jié)試驗(yàn)方法,稱取5份1 g羊毛,放入160 ℃、12.5 g熔融尿素中,分別反應(yīng)10、15、20、25、30 min提取羊毛角蛋白,測試并計(jì)算羊毛溶角率和角蛋白提取率。

反應(yīng)時(shí)間對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響如圖3所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長溶解率的變化幅度較小,反應(yīng)時(shí)間20 min時(shí)溶解率最高,延長反應(yīng)時(shí)間溶解率幾乎不變,說明羊毛中能夠溶于熔融尿素的成分已經(jīng)全部溶解,因此最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長角蛋白提取率逐下降,在10 ～15 min之間的提取率下降的幅度較小為1.58%,但15～20 min之間的提取率下降的幅度較大為18.26%。在160 ℃高溫熔融尿素中,羊毛角蛋白的一些化學(xué)鍵在反應(yīng)時(shí)間小于15 min時(shí)不會(huì)斷裂,超過15 min時(shí)逐漸斷裂,部分高分子角蛋白降解成小分子蛋白、多肽、氨基酸等,這些小分子很容易透過透析袋,使羊毛角蛋白的提取率下降,并且反應(yīng)時(shí)間越長角蛋白的降解程度越大,提取率越低。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對羊毛溶解率和角蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of reaction time on dissolution rate and keratin extraction rate of wool

綜上所述,使用熔融尿素法提取羊毛角蛋白時(shí)羊毛與尿素質(zhì)量比1∶12.5、反應(yīng)溫度160 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min時(shí),羊毛角蛋白全部溶解于熔融尿素中,但隨著反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間的增加羊毛角蛋白的提取率降低。

2.4 溶解白蛋白的分子量測定

由于羊毛角蛋白的分子量未知[16],確認(rèn)分子量降低程度的試樣不充分,因此,以已知分子量的白蛋白為原料,以便于推測羊毛與熔融尿素反應(yīng)后角蛋白分子量變化的規(guī)律。白蛋白與熔融尿素反應(yīng)后分子量的測定結(jié)果如圖4所示。參照白蛋白在分子量40 000 Da的位置出現(xiàn)了電泳帶,反應(yīng)時(shí)間10、20 min時(shí),白蛋白分子量出現(xiàn)了片斷性電泳帶,分子量21 000～40 000 Da之間的位置有較濃的電泳帶,分子量14 000 Da以下的位置有2條較淡的電泳帶,可見10、20 min時(shí)大部分蛋白質(zhì)仍然保持較高的分子量,但部分蛋白質(zhì)已經(jīng)降解成分子量小于14 000 Da的蛋白質(zhì)或氨基酸。反應(yīng)時(shí)間40、80 min時(shí)的白蛋白分子量在14 000 Da以下的位置出現(xiàn)了較濃的電泳帶,可見大部分蛋白質(zhì)降解成分子量小于14 000 Da的蛋白質(zhì)或氨基酸。以上結(jié)果表明,白蛋白與尿素的反應(yīng)時(shí)間越長,更多的白蛋白降解成低分子量蛋白質(zhì)或多肽,甚至有可能降解成氨基酸。因此可以推測,雖然羊毛角蛋白的分子量較大、結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,但適宜的反應(yīng)條件下熔融尿素使羊毛角蛋白降解、分子量降低。

圖4 白蛋白分子量的測定Fig.4 Determination of albumin molecular mass

2.5 白蛋白、氨基酸與熔融尿素的反應(yīng)

白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應(yīng)物的GC測定結(jié)果與色譜峰對應(yīng)的化合物如圖5所示。色氨酸與白蛋白反應(yīng)透析外液都在保留時(shí)間26 min出現(xiàn)了色譜峰,通過MS進(jìn)一步分析確定了二者26 min色譜峰的化合物為同一種化合物,即色氨酸與尿素反應(yīng)產(chǎn)物。白蛋白與熔融尿素透析外液在保留時(shí)間26 min時(shí)化合物的峰值最大,可以確定在白蛋白降解過程中產(chǎn)生最多的氨基酸為色氨酸。苯丙氨酸與白蛋白反應(yīng)透析外液都在保留時(shí)間19 min出現(xiàn)了色譜峰,通過MS進(jìn)一步分析確定了二者19 min色譜峰的化合物為同一種化合物,即苯丙氨酸與尿素反應(yīng)產(chǎn)物。通過以上試驗(yàn)結(jié)果可以看出,熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸,以此類推熔融尿素也可以使羊毛角蛋白降解成氨基酸。依據(jù)GC-MS檢測結(jié)果推測的氨基酸、蛋白質(zhì)與熔融尿素的反應(yīng)機(jī)制如圖6所示。

圖5 色氨酸、白蛋白、苯丙氨酸與熔融尿素反應(yīng)物GC測定結(jié)果與色譜峰對應(yīng)的化合物Fig.5 Compounds corresponding to chromatographic peaks in the gc determination results of albumin, tryptophan, phenylalanine and molten urea reactants. (a)Albumin reacts with molten urea;(b)Tryptophan reacts with molten urea in dialysis fluid;(c)Phenylalanine reacts with molten urea

圖6 氨基酸、蛋白質(zhì)與熔融尿素反應(yīng)機(jī)制Fig.6 Reaction mechanism of amino acid, protein and molten urea

色氨酸、苯丙氨酸和熔融尿素的第1階段反應(yīng)從氨基酸的氨基開始,與尿素的羰基進(jìn)行親核反應(yīng),形成氨基酸尿素中間體;第2階段反應(yīng)為分子內(nèi)部反應(yīng),原尿素的氨基與原氨基酸的羰基進(jìn)行親核反應(yīng)而形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)(乙內(nèi)酰脲環(huán)),最終色氨酸、苯丙氨酸與尿素結(jié)合形成乙內(nèi)酰脲環(huán)。在氨基酸與尿素反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ)上,推測了蛋白質(zhì)與尿素的反應(yīng)機(jī)制,第1階段反應(yīng)為蛋白質(zhì)N末端氨基酸的氨基與尿素的羰基進(jìn)行親核反應(yīng),形成蛋白質(zhì)尿素中間體;第2階段反應(yīng)也是分子內(nèi)部反應(yīng),原尿素的氨基與原氨基酸的羰基進(jìn)行親核反應(yīng),肽鍵斷裂,N末端的氨基酸形成乙內(nèi)酰脲環(huán),蛋白質(zhì)降解1分子氨基酸,蛋白質(zhì)本身變成比原來少1個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

3 結(jié) 論

為了高效提取羊毛角蛋白及探究羊毛角蛋白溶于熔融尿素的溶解機(jī)制,采用熔融尿素法優(yōu)化了提取工藝、測定了與熔融尿素作用降解后白蛋白的分子量、分析了白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應(yīng)的溶解液,得到了以下結(jié)論:

①熔融尿素法溶解羊毛的最佳工藝條件:羊毛與尿素質(zhì)量比1∶12.5、反應(yīng)溫度160 ℃、反應(yīng)時(shí)間20 min,羊毛溶解率為86.32%。隨反應(yīng)溫度的上升及反應(yīng)時(shí)間的增加羊毛角蛋白的提取率均降低。

②白蛋白與熔融尿素反應(yīng)后白蛋白分子量降低,反應(yīng)時(shí)間越長分子量降低幅度越大。

③對比分析白蛋白、色氨酸、苯丙氨酸與熔融尿素反應(yīng)溶解液發(fā)現(xiàn),白蛋白透析外液中存在色氨酸與苯丙氨酸,證明了熔融尿素使白蛋白降解成氨基酸。

④推測羊毛角蛋白與熔融尿素反應(yīng)的機(jī)制為熔融尿素使角蛋白的N端肽鍵斷裂,從角蛋白的N端開始釋放氨基酸,最終角蛋白可以降解成較低分子蛋白質(zhì)、肽、氨基酸。