熒光標(biāo)記技術(shù)在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中的應(yīng)用現(xiàn)狀及進(jìn)展

文 鼎，張 亞，劉雙清，王 翀，廖曉蘭

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的戰(zhàn)略物資，在預(yù)防、控制或消除病蟲草害以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方面都有不可或缺的作用，但是不合理使用農(nóng)藥導(dǎo)致農(nóng)藥過(guò)量殘留和目標(biāo)生物抗藥性，而高毒或高殘留農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用危害人體健康及其生存環(huán)境，嚴(yán)重威脅著人類生命安全和生態(tài)環(huán)境安全[1]。新型農(nóng)用化合物的創(chuàng)制過(guò)程漫長(zhǎng)，從最初的化合物篩選到最后劑型設(shè)計(jì)與大田檢驗(yàn)都要耗費(fèi)大量的時(shí)間與資金。即時(shí)確定化合物對(duì)目標(biāo)生物的作用機(jī)制，觀察化合物在目標(biāo)生物中的傳遞與積累等情況可以大大加快新型農(nóng)用化合物的創(chuàng)制速度。熒光標(biāo)記技術(shù)是將熒光染料標(biāo)記在目標(biāo)物質(zhì)上的技術(shù)，是一種高效、便捷的輔助技術(shù)，可以快速對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行觀察與分析，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)等領(lǐng)域，在有害物質(zhì)檢測(cè)、腫瘤及病癥診斷和藥物開發(fā)方面有著重要貢獻(xiàn)，可分為熒光探針技術(shù)與免疫熒光技術(shù)等。近年來(lái)，在農(nóng)用化合物的創(chuàng)制中，熒光標(biāo)記技術(shù)受到了特別的青睞，常應(yīng)用于篩選特定靶點(diǎn)的新型農(nóng)用化合物、相關(guān)靶點(diǎn)驗(yàn)證、目標(biāo)生物活體成像等方面[2-3]。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)主要聚焦于量子點(diǎn)、近紅外熒光探針、免疫熒光層析法等單一技術(shù)報(bào)道，缺乏對(duì)近10 a 熒光染料、熒光探針技術(shù)與免疫熒光技術(shù)在農(nóng)用化合物創(chuàng)制領(lǐng)域的綜合性報(bào)道?；诖耍C述了熒光標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)用化合物創(chuàng)制領(lǐng)域應(yīng)用的新進(jìn)展，以期為農(nóng)用化合物創(chuàng)制提供新思路與理論依據(jù)。

1 熒光染料分類及特殊熒光染料在農(nóng)用化合物創(chuàng)制中的應(yīng)用

不同種類的熒光染料是熒光標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)。熒光染料種類眾多，不同熒光染料有其獨(dú)特的光物理化學(xué)性質(zhì)，并且隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的推廣與發(fā)展，越來(lái)越多有著特殊作用或特殊功能的熒光染料被發(fā)現(xiàn)與改進(jìn)。熒光染料通常分為常見(jiàn)熒光染料與特殊熒光染料。常見(jiàn)熒光染料代表的是技術(shù)成熟、物理化學(xué)性質(zhì)及修飾改造方向已經(jīng)基本明確的染料，此類染料大都有著成熟的產(chǎn)品面市，具有相對(duì)固定的優(yōu)勢(shì)與缺陷；而特殊熒光染料是指結(jié)構(gòu)相似或某種性質(zhì)相似的一類染料，與常見(jiàn)熒光染料相比具有某些突出的優(yōu)點(diǎn)，但相關(guān)研究及修飾改造方向尚未被完全開發(fā)，仍然存在著許多的問(wèn)題，同時(shí)也有著許多的可能性。新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中需要設(shè)計(jì)出有特定熒光特性的熒光染料，對(duì)熒光染料進(jìn)行修飾與改造是必不可少的。不同的修飾與改造會(huì)使熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)、熒光穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度等熒光特性發(fā)生改變，從而制作出符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的熒光染料，如鹵代熒光素中鹵素原子越大或越多都會(huì)造成鹵代熒光素發(fā)射波長(zhǎng)越大，氯原子取代則會(huì)造成鹵代熒光素的熒光壽命和量子產(chǎn)率增大[4]。

1.1 常見(jiàn)熒光染料

常見(jiàn)的熒光染料通常按照化合物結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行分類（表1），可以分為熒光素類、羅丹明類和芘類等，都有較為成熟的技術(shù)及產(chǎn)品。常見(jiàn)的熒光染料都有著不同的優(yōu)點(diǎn)與不足，經(jīng)過(guò)對(duì)熒光染料的修飾與改造后可以增加該種熒光染料的優(yōu)點(diǎn)或彌補(bǔ)其不足，如熒光素類熒光染料具有光穩(wěn)定性高、量子產(chǎn)率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5]，但其具有細(xì)胞毒性與細(xì)胞膜通透性差等不足[5-6]，對(duì)熒光素修飾與改造后形成的異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）解決了細(xì)胞毒性與細(xì)胞膜通透性差的問(wèn)題，在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中常用于細(xì)胞成像和農(nóng)用化合物抗體結(jié)合檢測(cè)等方面。

表1 不同類別的常見(jiàn)熒光染料Tab.1 Classification of common fluorescent dyes

1.2 特殊熒光染料在農(nóng)用化合物創(chuàng)制中的應(yīng)用

特殊熒光染料的開發(fā)研究通常晚于常見(jiàn)熒光染料，同時(shí)其具有更獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和相應(yīng)的缺陷。特殊熒光染料在農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面的研究雖然不如常見(jiàn)熒光染料，但特殊熒光染料研究熱點(diǎn)中的石墨烯量子點(diǎn)、稀土材料及納米粒子等憑借著突出的優(yōu)點(diǎn)在農(nóng)用化合物創(chuàng)制中有著不可小覷的應(yīng)用潛力。

1.2.1 石墨烯量子點(diǎn) 量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）一般是由Ⅳ、Ⅱ-Ⅵ、Ⅳ-Ⅵ或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的準(zhǔn)零維類球形半導(dǎo)體納米材料。常見(jiàn)的量子點(diǎn)有碳量子點(diǎn)（Carbon quantum dots，CDs）、碲化鎘（CdTe）量子點(diǎn)和石墨烯量子點(diǎn)（Graphene quantum dots，GQDs）等。量子點(diǎn)通過(guò)不同條件的合成與修飾方法可使其在紫外到近紅外范圍內(nèi)都有吸收峰，并且優(yōu)異的熒光穩(wěn)定性和抗光漂白特性提高了熒光標(biāo)記的準(zhǔn)確性，但在活體生物體內(nèi)聚集進(jìn)行標(biāo)記仍然有一定的細(xì)胞毒性[23]。量子點(diǎn)中石墨烯量子點(diǎn)具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性、高量子產(chǎn)率和良好的生物相容性等特點(diǎn)，是現(xiàn)今量子點(diǎn)開發(fā)的熱點(diǎn)[24]。出色的熒光特性使量子點(diǎn)在成像和傳感器方面應(yīng)用廣泛，而在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面，量子點(diǎn)主要應(yīng)用于靶點(diǎn)檢測(cè)上。乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是農(nóng)用化合物重要的作用靶點(diǎn)，化合物有效成分能與乙酰膽堿酯酶結(jié)合使目標(biāo)生物體內(nèi)乙酰膽堿不斷積累從而殺死目標(biāo)生物。HE 等[25]使用蛋白質(zhì)交聯(lián)劑將石墨烯量子點(diǎn)固定在乙酰膽堿酯酶上，運(yùn)用低濃度Hg2+猝滅石墨烯量子點(diǎn)熒光以及硫代膽堿與Hg2+作用恢復(fù)熒光石墨烯量子點(diǎn)熒光的原理，開發(fā)了一種高靈敏度的乙酰膽堿酯酶石墨烯量子點(diǎn)熒光傳感器，試驗(yàn)使用2種傳統(tǒng)乙酰膽堿酯酶抑制劑對(duì)氧磷（Paraoxon）和他克林（Tacrine）來(lái)驗(yàn)證石墨烯量子點(diǎn)熒光傳感器的靈敏度和檢測(cè)限，結(jié)果顯示，對(duì)氧磷和他克林的半抑制濃度（IC50）分別為63.76 nmol/L和14.07 nmol/L，低于其他熒光標(biāo)記文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)（5.25 μmol/L 和67.5 nmol/L）[26]，后續(xù)可通過(guò)此石墨烯量子點(diǎn)熒光傳感器更好地篩選并設(shè)計(jì)作用于乙酰膽堿酯酶的新型農(nóng)用化合物。量子點(diǎn)熒光傳感器為篩選作用于特定靶點(diǎn)的新型農(nóng)用化合物提供了方法和理論支撐，減少了新型農(nóng)用化合物的開發(fā)時(shí)間與成本。另外，石墨烯量子點(diǎn)還具有低細(xì)胞毒性這一特點(diǎn)，使得量子點(diǎn)也可以朝活體熒光染料方向發(fā)展，其與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，具有更大的比表面積和直徑，可以容納更多的

活性基團(tuán)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已實(shí)現(xiàn)了體外細(xì)胞成像和體內(nèi)初步成像，但在農(nóng)用化合物創(chuàng)制領(lǐng)域鮮有報(bào)道，這與石墨烯量子點(diǎn)制備耗時(shí)多、難度大以及在紅外成像波段石墨烯量子產(chǎn)率不高有關(guān)[27-28]，能否解決上述問(wèn)題，是石墨烯量子點(diǎn)在農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面發(fā)展的關(guān)鍵。

1.2.2 綠色熒光蛋白 綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）是由238 個(gè)氨基酸殘基組成的自發(fā)熒光蛋白，熒光穩(wěn)定好，相比于熒光素類物質(zhì)，GFP 抗光漂白能力和靈敏度更強(qiáng)。將GFP 片段連接在目標(biāo)生物體片段中，其產(chǎn)生熒光是生物細(xì)胞的自主功能，不需要任何外源反應(yīng)底物，這一特性使得GFP 具有低細(xì)胞毒性特點(diǎn)，可以進(jìn)行活體生物示蹤和成像等檢測(cè)，更適用于定量測(cè)定與分析，如王淼等[29]將GFP 與生防菌株變形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）336x 基因片段連接，在小麥組織中根據(jù)GFP 產(chǎn)生的綠色熒光跟蹤觀察336x的定殖與分布，為研究生防菌株336x的作用機(jī)制提供了依據(jù)。GFP 相關(guān)衍生物還有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（Enhanced yellow fluorescent protein，EYFP）和增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白（Enhanced blue fluorescent protein，EBFP）等，都是由GFP 氨基酸突變而來(lái)。在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中，GFP 常用來(lái)指示目標(biāo)生物基因片段或蛋白質(zhì)，也用來(lái)測(cè)定目標(biāo)生物基因調(diào)控差異等方面。SHEN 等[30]將朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）體內(nèi)蛻皮激素受體（Ecdysone receptor，EcR）進(jìn) 行RNA 干 擾（RNA interference，RNAi）并用GFP 標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素受體表達(dá)被沉默時(shí)，73.1%的朱砂葉螨未能存活到幼蟲期，成蟲率僅為11.7%，而對(duì)照組各階段存活成功率為86.7%，說(shuō)明螨類蛻皮激素受體是良好的殺蟲劑靶點(diǎn)，為后續(xù)研制相關(guān)靶點(diǎn)抑制劑提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。GFP 是良好的體內(nèi)蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記物，對(duì)于篩選與探究新型農(nóng)用化合物的作用位點(diǎn)及作用方式等方面具有重要作用。

1.2.3 長(zhǎng)余輝納米粒子 長(zhǎng)余輝納米粒子（Persistent luminescence nanoparticle，PLNP）是一種在被激發(fā)后能持續(xù)發(fā)光的特殊納米材料。PLNP 具有激發(fā)后自持續(xù)發(fā)射、穿透深度強(qiáng)、高信噪比與可重復(fù)激發(fā)等特有光物理化學(xué)性質(zhì)。ZHAO 等[31]與XUE 等[32]分別制作了可用于檢測(cè)癌細(xì)胞的PLNP 探針和可重復(fù)激發(fā)PLNP 探針，證明PLNP 探針在生化分析檢測(cè)、癌細(xì)胞追蹤、腫瘤靶向成像與診療一體化等方面有著廣泛的應(yīng)用前景[27]。在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面，PLNP 并未在國(guó)內(nèi)得到有效應(yīng)用，但ZHANG 等[33]通過(guò)PLNP（La3Ga5GeO14：Cr3+、Zn2+）制作了能夠特異性結(jié)合并示蹤敵百蟲的納米載體LGGO@MIP，展示了敵百蟲在小鼠血液和腸胃中的運(yùn)動(dòng)過(guò)程和在肝臟中的積累過(guò)程。未來(lái)新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制階段后期也可以通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)結(jié)合農(nóng)用化合物進(jìn)行非靶標(biāo)生物的毒性代謝與檢測(cè)試驗(yàn)。但PLNP 材料仍然存在成本過(guò)高、不易修飾和靈敏度不足的缺點(diǎn)[34]，這也是未來(lái)PLNP 材料需要攻克的難題。

1.2.4 稀土納米材料 稀土發(fā)光納米材料（Rareearth nanoparticles，RENPs）是利用稀土特殊性質(zhì)研發(fā)的一類優(yōu)質(zhì)光學(xué)材料，具有壽命長(zhǎng)和熒光穩(wěn)定性高等特點(diǎn)。RENPs 在生物傳感器、細(xì)胞成像和活體成像中都有應(yīng)用，在農(nóng)用化合物檢測(cè)中也有較好的應(yīng)用。硝基還原酶廣泛存在于細(xì)菌中，可以降解具有農(nóng)用作用的硝基芳香化合物如硝磺草酮等[35-36]。BRENNECKE 等[37]發(fā)明了一種檢測(cè)細(xì)菌中硝基還原酶的RENPs 復(fù)合探針，運(yùn)用此探針在與硝基還原酶作用時(shí)發(fā)光的原理檢測(cè)硝基還原酶的質(zhì)量濃度，雖然探針檢出限僅為4.4 ng/mL，但該探針能在活體細(xì)菌中進(jìn)行檢測(cè)，為研究細(xì)菌硝基還原酶代謝循環(huán)提供了方法，也為創(chuàng)制含有硝基的芳香族農(nóng)用化合物提供了一種觀察與檢測(cè)途徑。RENPs 長(zhǎng)壽命的特點(diǎn)使其非常適用于時(shí)間分辨生物熒光成像的研究，但是其檢測(cè)能力大小與RENPs 大小和目標(biāo)的結(jié)合率有關(guān)，而且水溶性與量子產(chǎn)率不高也是制約稀土發(fā)光納米材料應(yīng)用的關(guān)鍵問(wèn)題[38-40]。

2 熒光探針技術(shù)

與傳統(tǒng)熒光染料直接標(biāo)記目的物質(zhì)的原理不同，熒光探針技術(shù)是指使用熒光染料與研究對(duì)象結(jié)合后熒光染料熒光特性發(fā)生改變，利用熒光特性的差異分析研究對(duì)象的技術(shù)。熒光探針技術(shù)在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，使得其作為一種熱門標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)研究領(lǐng)域，并取得了迅速發(fā)展。熒光探針技術(shù)具有非放射性、操作簡(jiǎn)便、高穩(wěn)定性、高靈敏度和高選擇性等特點(diǎn)，且熒光標(biāo)記染料種類多、方法靈活，可應(yīng)用于多種生物大分子及藥物的標(biāo)記[41]。

2.1 熒光探針結(jié)構(gòu)及原理

熒光探針大多由三部分組成，熒光受體（Fluorescent receptors）、連接體（Spacer）、識(shí)別基團(tuán)（Receptor）（圖1）。當(dāng)識(shí)別基團(tuán)與被識(shí)別物質(zhì)相結(jié)合時(shí)，熒光受體就會(huì)作出響應(yīng)，表現(xiàn)出熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱、光譜的位移和顏色的改變等現(xiàn)象，從而可以觀察并檢測(cè)到研究對(duì)象的位置與數(shù)量。常見(jiàn)的熒光探針響應(yīng)機(jī)制有熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photo-induced electron transfer，PET）、分 子 內(nèi) 電 荷 轉(zhuǎn) 移（Intramolecular charge transfer，ICT）、激 基 締/復(fù) 合 物（Excimer-exciplex，ME）4種。

2.2 近紅外熒光探針

近紅外熒光探針是一類發(fā)射波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)域（Near infrared，NIR）的熒光探針，不會(huì)被紫外-可見(jiàn)光波長(zhǎng)區(qū)域的非靶標(biāo)自發(fā)熒光物質(zhì)影響，有較高的信噪比，并且具有熒光組織穿透能力強(qiáng)和對(duì)生物組織無(wú)光損傷等特點(diǎn)，受到各研究學(xué)者的關(guān)注，在近紅外一區(qū)（NIR-1，700～900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-2，1 000～1 700 nm）都產(chǎn)生了不少優(yōu)秀的熒光探針。設(shè)計(jì)并開發(fā)具有穩(wěn)定性強(qiáng)、水溶性好、安全性高且有較理想的發(fā)射波長(zhǎng)和生物相容性的熒光探針成為最近近紅外熒光成像的研究熱點(diǎn)[42]。但是近紅外熒光探針仍然有不少缺點(diǎn)，如光穩(wěn)定性差、光漂白性差、細(xì)胞膜通透性差和細(xì)胞毒性等問(wèn)題[43-44]，還需進(jìn)一步發(fā)展。近紅外熒光探針在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面作為良好的體內(nèi)成像探針被廣泛應(yīng)用，如生物體內(nèi)的腸道微生物是近年農(nóng)用化合物研發(fā)的熱點(diǎn)，特定生物腸道內(nèi)的菌群有良好的殺菌、殺蟲[45-47]或影響害蟲腸道內(nèi)微生物[48]的作用，俞添賀[49]通過(guò)修飾近紅外二區(qū)小分子熒光探針CQ，解決了探針細(xì)胞毒性和光穩(wěn)定性差等問(wèn)題，制作出能夠特異性結(jié)合具有廣譜殺菌作用的羅伊氏乳桿菌的熒光探針CQDB，運(yùn)用熒光成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)小鼠食用帶有探針的羅伊氏乳桿菌后菌株在腸道中的定殖情況和運(yùn)動(dòng)軌跡，為后續(xù)對(duì)腸道內(nèi)微生物的研究提供了思路。JIANG 等[50]設(shè)計(jì)了一種新型近紅外熒光探針SQ，此探針可以特異性結(jié)合敵草快，穩(wěn)定性和特異性高，通過(guò)熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定量檢測(cè)，并且能在斑馬魚體內(nèi)生物成像，具有高組織穿透率和低細(xì)胞毒性，在斑馬魚體內(nèi)可以實(shí)時(shí)定量檢測(cè)敵草快的可信度，為聯(lián)吡啶類農(nóng)藥創(chuàng)制提供了生物檢測(cè)的新方式，具有很好的前景。雖然近紅外熒光探針仍然存在不同組織穿透率不同、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)干擾等問(wèn)題，但在農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面，利用近紅外熒光探針技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)農(nóng)用化合物進(jìn)行實(shí)時(shí)定位研究具有準(zhǔn)確、直觀、損傷小等特點(diǎn)，能在細(xì)胞水平加深對(duì)藥理學(xué)機(jī)制的理解。

2.3 熒光探針在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中的應(yīng)用

新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程，從最初的先導(dǎo)化合物的設(shè)計(jì)與開發(fā)到最后農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，活性物質(zhì)篩選檢測(cè)、化合物的作用位點(diǎn)與機(jī)制研究等方向都可以運(yùn)用熒光探針來(lái)輔助驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，不僅縮短了新型農(nóng)用化合物的開發(fā)時(shí)間，降低了開發(fā)成本，還能準(zhǔn)確地驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。其中，作用位點(diǎn)及作用機(jī)制的創(chuàng)新是農(nóng)用化合物創(chuàng)制最重要的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，近年來(lái)在潛在作用位點(diǎn)方面已經(jīng)有很多的發(fā)現(xiàn)（表2）。

表2 農(nóng)用化合物潛在作用位點(diǎn)Tab.2 Potential action sites of agricultural compounds

2.3.1 農(nóng)用化合物活性物質(zhì)篩選 熒光探針可結(jié)合特定基因片段或者受體蛋白，通過(guò)檢測(cè)探針熒光強(qiáng)弱來(lái)篩選針對(duì)此基因片段或者受體蛋白的新型農(nóng)用化合物，為新型農(nóng)用化合物的活性物質(zhì)篩選提供一種思路。熒光探針的結(jié)合方式如果設(shè)計(jì)不合理，將會(huì)導(dǎo)致熒光探針特異性不高，甚至對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成較大的影響，BAHMED 等[67]設(shè)計(jì)并合成了一種含丹磺酰熒光染料的幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase，CHS）小分子熒光探針6-O-丹磺?；?N-乙酰氨基葡萄糖（DNAG），通過(guò)定量檢測(cè)DNAG 與CHS 結(jié)合后熒光的減弱強(qiáng)度，可以較為準(zhǔn)確地評(píng)估CHS 的活性，且與放射性檢測(cè)方法獲得的結(jié)果一致，初步證明DNAG 在試驗(yàn)環(huán)境中是與CHS 特異性結(jié)合的，說(shuō)明此熒光探針可以運(yùn)用于針對(duì)幾丁質(zhì)合成酶的農(nóng)用化合物篩選過(guò)程，但在后續(xù)篩選過(guò)程中，仍然需要注意試驗(yàn)環(huán)境是否會(huì)影響熒光探針的特異性，造成假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果。乙酰羥酸合成酶（Acetohydroxyacid synthase，AHAS）是一種分布于植物、細(xì)菌、真菌和藻類中但不存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的催化纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸3 種支鏈氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶，是廣泛應(yīng)用于多種農(nóng)作物除草劑的作用靶點(diǎn)[68]。XIE 等[69]基于AHAS 的酶催化反應(yīng)機(jī)制，利用苯甲醛衍生物作識(shí)別基團(tuán)，成功設(shè)計(jì)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）熒光致變型小分子熒光探針probe-1。在probe-1與AHAS 特異性結(jié)合后，由于醛羰基對(duì)分子共軛體系的吸電子效應(yīng)被打破產(chǎn)生熒光藍(lán)移從而構(gòu)建了適于快速發(fā)現(xiàn)AHAS靶向型除草劑的高通量篩選體系，為后續(xù)研究乙酰羥酸合成酶作用位點(diǎn)農(nóng)用化合物提供支持?，F(xiàn)階段農(nóng)用化合物活性物質(zhì)篩選采用的方式依舊是對(duì)峙試驗(yàn)，這種方法只適合于不確定性的物質(zhì)篩選，只能確定物質(zhì)是否具有生物活性。熒光探針技術(shù)能定性定量檢測(cè)并篩選出作用于目標(biāo)物質(zhì)的化合物，但在試驗(yàn)周期和成本上卻不如傳統(tǒng)方法，其更適用于通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)和使用分子對(duì)接技術(shù)后已經(jīng)確定作用于目標(biāo)物質(zhì)的活性物質(zhì)檢測(cè)，這樣既能夠驗(yàn)證計(jì)算機(jī)模擬的準(zhǔn)確性，又能夠檢測(cè)活性物質(zhì)的最佳抑制濃度，減少了活性物質(zhì)的篩選時(shí)間，為后續(xù)作用機(jī)制研究提供了一些方向。但仍然需要注意熒光探針的設(shè)計(jì)合成過(guò)程較長(zhǎng)和特異性等問(wèn)題，理解并能自主設(shè)計(jì)探針是未來(lái)新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制的必備技術(shù)之一。熒光探針在農(nóng)用化合物活性物質(zhì)篩選方面的發(fā)展在解決上述問(wèn)題后會(huì)更加迅速。

2.3.2 農(nóng)用化合物作用位點(diǎn)及作用機(jī)制研究 在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面，熒光探針可用于研究農(nóng)用化合物作用機(jī)制和原理。熒光探針在作用位點(diǎn)與機(jī)制研究中可以通過(guò)與農(nóng)用化合物活性物質(zhì)連接來(lái)進(jìn)行研究，但攜帶熒光探針的活性物質(zhì)與原物質(zhì)可能會(huì)在空間結(jié)構(gòu)甚至理化性質(zhì)方面不盡相同，自然不能夠稱為同種物質(zhì)，需及時(shí)進(jìn)行檢驗(yàn)以保證熒光探針未對(duì)活性物質(zhì)造成影響。李鑫[70]在研究有除草活性的4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯的作用機(jī)制時(shí)，設(shè)計(jì)合成了4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯查爾酮熒光探針LX-2，試驗(yàn)驗(yàn)證LX-2 不改變?cè)衔锍輨┗钚郧页莅Y狀一致，初步說(shuō)明熒光探針對(duì)4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯暫無(wú)影響并且成功觀察到LX-2 在擬南芥根和葉片中初步定位，闡述了4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯通過(guò)使幼根細(xì)胞壁加厚抑制根系吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及激發(fā)擬南芥內(nèi)葉綠素酶活性從而引起葉綠素的分解進(jìn)而影響植物整體的生物合成途徑來(lái)達(dá)到除草效果，完成了4-羥基-3-甲氧基肉桂酸乙酯作用機(jī)制的部分研究，為后續(xù)繼續(xù)確定活性物質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制提供了方向。王蘭英[71]通過(guò)合成抗菌化合物天名精內(nèi)酯酮熒光標(biāo)記物（TTY）對(duì)小麥全蝕病菌進(jìn)行細(xì)胞共定位研究，發(fā)現(xiàn)天名精內(nèi)酯酮在細(xì)胞中的作用位點(diǎn)在線粒體，為后面天名精內(nèi)酯酮靶點(diǎn)的研究做出了初步定位。在農(nóng)用化合物的研究中常常涉及多個(gè)試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證活性物質(zhì)的作用位點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制，而作用位點(diǎn)的研究除了熒光探針?lè)?，常用的方法還有直接篩選法與間接篩選法[72]，直接篩選法中多種方法都需破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)提取活性物質(zhì)結(jié)合受體，間接法則是通過(guò)活性物質(zhì)作用后基因表達(dá)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的差異來(lái)推斷活性物質(zhì)的作用位點(diǎn)，這2 種方法都不能直接驗(yàn)證出農(nóng)用化合物在細(xì)胞內(nèi)的作用位點(diǎn)，熒光探針則可以直觀地展示農(nóng)用化合物在生物體內(nèi)的結(jié)合和運(yùn)動(dòng)軌跡以及聚集情況，為農(nóng)用化合物作用原理的探究初步確定了思路和方向，大大縮減了農(nóng)用化合物的創(chuàng)制過(guò)程，但是不同的農(nóng)用化合物也需根據(jù)熒光染料自身光物理化學(xué)性質(zhì)、農(nóng)用化合物結(jié)構(gòu)和目標(biāo)生物特性綜合考慮熒光探針的制作。合理有效利用熒光探針技術(shù)可以在農(nóng)用化合物靶點(diǎn)和作用機(jī)制的研究中提供關(guān)鍵證據(jù)來(lái)驗(yàn)證試驗(yàn)猜想，不僅可以節(jié)約相關(guān)試驗(yàn)的成本，而且減少了農(nóng)用化合物創(chuàng)制的時(shí)間。

3 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence，IF）是利用抗原和熒光染料標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合后識(shí)別待測(cè)物的分析技術(shù)，有直接法和間接法2 種形式（圖2）。最常用的方法是間接法，其關(guān)鍵是抗體和二抗的用量預(yù)試驗(yàn)，不然會(huì)導(dǎo)致無(wú)熒光信號(hào)和假陽(yáng)性情況的產(chǎn)生，如顏世君等[73]和羅俊等[74]運(yùn)用免疫熒光技術(shù)間接法，分別檢測(cè)了試驗(yàn)制備的非洲豬瘟病毒p22 蛋白的單克隆抗體和雞異質(zhì)核糖核蛋白AB（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein AB，hnRNPAB）的單克隆抗體，結(jié)果顯示，熒光標(biāo)記二抗均能與各自單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合并產(chǎn)生綠色熒光，證明2 個(gè)單克隆抗體制備成功。在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制的過(guò)程中，運(yùn)用到免疫熒光技術(shù)的分析方法有免疫熒光層析法（Fluorescent immunochromatography，F(xiàn)ICA）、熒光偏振免疫技術(shù)（Fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）和時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)（Time-resolved fluorescence immunoassay，TRFIA）等。

圖2 免疫熒光技術(shù)原理示意Fig.2 Schematic diagram of immunofluorescence technology

免疫熒光技術(shù)常用在已知農(nóng)用化合物的檢測(cè)上，有快速、便捷和成本低等特點(diǎn)，在農(nóng)用化合物創(chuàng)制過(guò)程中可以憑借這些特點(diǎn)對(duì)大量的待檢測(cè)物進(jìn)行篩選，也可以通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合準(zhǔn)確定位目標(biāo)位置，但免疫熒光技術(shù)也有假陽(yáng)性率高、定量誤差大、背景干擾和檢測(cè)限比色譜法檢測(cè)高等缺點(diǎn)。近年來(lái)，通過(guò)不斷的技術(shù)革新開發(fā)了更多不同的免疫熒光技術(shù)如熒光偏振技術(shù)，大大降低了檢測(cè)時(shí)背景熒光的干擾等。

3.1 免疫熒光層析法

免疫熒光層析法是在免疫滲透技術(shù)基礎(chǔ)上建立的固相標(biāo)記分析技術(shù)，結(jié)合了免疫熒光分析技術(shù)和色譜層析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。其物化形式是免疫層析試紙條，主要由樣品墊（Sample pad）、硝酸纖維素膜（Nitrocellulose membrane，NC 膜）、吸 水 紙（Absorbent pad）、PVC 底板組成。免疫熒光層析法具有檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可視化、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制過(guò)程中是進(jìn)行大量鑒定與篩選的一種技術(shù)手段。GHOSH 等[75]等建立了一種新型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）的免疫熒光層析檢測(cè)法CTV-RT-RPALFICA，能夠快速、即時(shí)、低成本診斷CTV，在針對(duì)CTV 的新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制前期也可對(duì)潛在農(nóng)用化合物進(jìn)行篩選，但免疫熒光層析法也會(huì)受到假陽(yáng)性、靈敏度低等問(wèn)題影響。未來(lái)在消除這些問(wèn)題帶來(lái)的影響后，免疫熒光層析法在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中將會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用。

3.2 熒光偏振免疫技術(shù)

熒光偏振免疫分析技術(shù)是基于免疫競(jìng)爭(zhēng)原理和熒光偏振原理的快速篩選分析技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記抗原在結(jié)合特異性抗體前后的熒光偏振值變化來(lái)檢測(cè)抗體。當(dāng)檢測(cè)物的溫度和濃度一定時(shí)，熒光偏振值的大小只與熒光粒子的大小相關(guān)，解決了激發(fā)光強(qiáng)度波動(dòng)給試驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)的誤差問(wèn)題，并且熒光偏振免疫技術(shù)還有著穩(wěn)定性高、檢測(cè)速度快和檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。熒光偏振免疫技術(shù)在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制早期階段中可用于潛在農(nóng)用化合物大量且快速的篩選，如赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的一種有毒物質(zhì)，HUANG 等[76]構(gòu)建了一種基于FPIA 的玉米與大米中OTA 含量檢測(cè)技術(shù)，該方法檢測(cè)的OTA 質(zhì)量濃度為0.03～0.78 ng/mL，IC50值為0.09 ng/mL，相較于其他免疫分析技術(shù)更加靈敏和快速，10 min 便能完成檢測(cè)。此項(xiàng)技術(shù)通過(guò)改進(jìn)可以快速地篩選出針對(duì)OTA 的廣譜性抑菌農(nóng)用化合物，在農(nóng)用化合物創(chuàng)制后期也能夠用于大田試驗(yàn)的效果檢測(cè)，大大縮減了農(nóng)用化合物的創(chuàng)制時(shí)間，也降低了相應(yīng)的研發(fā)成本。

3.3 時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)

稀土離子螯合物具有熒光壽命較長(zhǎng)（100～1 000 μs）的特點(diǎn)，在激發(fā)光停止后仍然會(huì)持續(xù)釋放熒光，這種檢測(cè)技術(shù)被稱為時(shí)間分辨熒光。這種技術(shù)可以有效消除底物熒光的干擾，并且時(shí)間分辨熒光Stokes位移寬，螯合物的熒光發(fā)射峰狹窄，可通過(guò)波長(zhǎng)分辨的方式進(jìn)一步區(qū)別于背景熒光。以稀土離子螯合物作為抗原或抗體的標(biāo)記物，將時(shí)間分辨熒光與免疫分析技術(shù)相結(jié)合的方法稱為時(shí)間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）[77]。TRFIA 在國(guó)內(nèi)新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面的研究較少，而在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛，如杜梅[78]建立了以鑭系元素銪離子（Eu3+）作為熒光標(biāo)記物標(biāo)記抗體與二抗來(lái)檢測(cè)土壤和糙米中吡蟲啉的時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)PTRFIA-1 和P-TRFIA-2。其中P-TRFIA-1 的線性范圍為0.02～2.3 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.02 ng/mL，P-TRFIA-2 的線性范圍為0.017～0.24 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.017 ng/mL，靈敏度相比于此文獻(xiàn)之前的時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)[79]提高了5 倍。在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制中也可以運(yùn)用到此項(xiàng)技術(shù)，將時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)與新型農(nóng)用化合物抗體相結(jié)合便能夠建立相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，為新型農(nóng)用化合物的殘留檢測(cè)試驗(yàn)提供一種新的思路。

4 討論與展望

熒光標(biāo)記技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)廣泛運(yùn)用于疾病診斷、癌細(xì)胞研究與追蹤、藥物開發(fā)等領(lǐng)域，而在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，熒光標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用最為廣泛的方面是農(nóng)藥殘留檢測(cè)，在農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面的運(yùn)用不多且不夠深入，許多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域運(yùn)用的最新熒光標(biāo)記手段未能使用在農(nóng)用化合物創(chuàng)制上，熒光染料的開發(fā)是熒光標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)用化合物方面發(fā)展的方向之一。常見(jiàn)熒光染料憑借自身優(yōu)良的熒光特性在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域備受青睞，而特殊熒光染料也在不斷地被修飾改造，增加自身的優(yōu)點(diǎn)，完善自身的不足，這些熒光染料在新型農(nóng)用化合物的創(chuàng)制中也有著不可或缺的作用。但是熒光染料自身仍然有光漂白、細(xì)胞毒性和熒光持續(xù)時(shí)間短等缺點(diǎn)。尋找具有特定光物理化學(xué)特點(diǎn)的新式熒光染料或不斷修飾與改造常見(jiàn)熒光染料創(chuàng)造出功能更強(qiáng)、特異性更高、更加簡(jiǎn)單精確的熒光染料是現(xiàn)今熒光染料開發(fā)的研究熱點(diǎn)。

針對(duì)農(nóng)用化合物的熒光探針設(shè)計(jì)也在不斷發(fā)展。為了減少熒光染料本身的缺點(diǎn)，在熒光探針的設(shè)計(jì)上仍然要做許多工作以改進(jìn)熒光染料特定的性質(zhì)或繞過(guò)它們本身的局限性。在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面，熒光探針能夠給研究者提供生物體內(nèi)清晰準(zhǔn)確的圖像及數(shù)據(jù)，為農(nóng)用化合物的篩選及作用機(jī)制研究提供快速便捷的技術(shù)。盡管熒光探針對(duì)于新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制有著獨(dú)特的作用，但是其暴露出的不足仍然明顯，細(xì)胞毒性、靈敏性低、背景光源的干擾、熒光強(qiáng)度不足及成本較高等問(wèn)題都不可忽視，設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)、熒光強(qiáng)度高、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)和穿透力高的熒光探針仍是研究者不斷追求的目標(biāo)?，F(xiàn)在，近紅外區(qū)域熒光探針憑借著高信噪比和強(qiáng)熒光穿透力成為生物活體成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，未來(lái)熒光探針活體生物成像技術(shù)將會(huì)更多地應(yīng)用于新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制方面。

免疫熒光技術(shù)在新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制過(guò)程中最常應(yīng)用在對(duì)農(nóng)用化合物目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)中，在已知農(nóng)用化合物檢測(cè)領(lǐng)域中也有著重要作用，是農(nóng)用化合物檢測(cè)的常用手段之一。目前，熒光標(biāo)記技術(shù)中仍然存在幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決：一是不同試驗(yàn)設(shè)計(jì)中試驗(yàn)環(huán)境與要求常會(huì)造成熒光染料的選擇困難，同時(shí)無(wú)法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)熒光染料的修飾結(jié)果，對(duì)熒光染料與待測(cè)物質(zhì)結(jié)合往往還需考慮特異性問(wèn)題；二是熒光探針的設(shè)計(jì)與免疫熒光中抗原抗體的制作都需耗費(fèi)大量的時(shí)間與成本；三是熒光探針需將分析物質(zhì)連接于檢測(cè)物質(zhì)上，可能造成檢測(cè)物質(zhì)光物理化學(xué)性質(zhì)的改變，使得試驗(yàn)結(jié)果不能直接證明研究猜想，仍需要相關(guān)輔助試驗(yàn)結(jié)合才能完整證明。相信，隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的不斷成熟、優(yōu)化，熒光染料修飾方法將逐步得到完善，重組抗體的研究也將極大縮短抗體的制備周期，這將為加速新型農(nóng)用化合物創(chuàng)制提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。