基于HPLC指紋圖譜及內含成分結合網絡藥理學的雨花茶抗腫瘤機制研究

許晨新，張景正，嚴寶飛，張思訪，劉 嘉

江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院 藥學院，江蘇 南京 211800

我國是茶葉生產、加工和消費大國，茶葉資源種類豐富，是我國特色地理標志性產品[1]。唐代《茶經》中記載茶葉有助于睡眠、促進消化、利尿排毒等功效?，F(xiàn)代研究亦表明茶葉富含多種營養(yǎng)物質，如茶多酚、氨基酸、生物堿、微量元素和糖類等成分[2]，具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、調血脂、殺菌消炎等藥理作用[3-9]。茶葉中的主要活性成分含量因產地不同而略有差異，其有效物質的種類和含量成為評價茶葉品質的重要依據[10]。雨花茶是我國十大名茶之一，是江蘇省優(yōu)質名茶代表，2005年獲批國家地理標志保護產品[11-12]。雨花茶屬于綠茶，作為未發(fā)酵茶，保留了許多天然成分，其茶多酚含量高于其他茶類[13]。

茶多酚是茶葉中的活性成分，主要由多羥基酚類化合物構成，是茶葉中多酚類物質的總稱[14-15]。茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、黃酮醇類和花色苷類等多酚物質，約占茶葉干重的20%～35%[16]，其中兒茶素類約占60%～80%[17]，主要由沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡因、表沒食子兒茶素等組成[18]。目前，茶多酚已廣泛應用于食品、醫(yī)藥、保健品和化妝品等領域[19]。有關茶多酚抗腫瘤機制研究多集中在其單體中，不能整體體現(xiàn)茶多酚的多成分、多靶點和多通路抗腫瘤的機制。

近年來，指紋圖譜技術已廣泛應用于食品和藥用植物領域，其可以直觀反映食品和藥物的質量標示成分并用于品質控制和鑒別[20]。網絡藥理學作為探索中藥作用機制及活性成分開發(fā)的一種有力工具，其通過“藥物-靶點-疾病”的網絡圖，一方面可以有效揭示多分子協(xié)同機制，另一方面可以預測中藥成分分子的潛在作用機制，從而進一步尋求新藥物[21]。本研究擬采用HPLC分析方法，建立雨花茶的HPLC指紋圖譜及其含量測定方法。在此基礎上，結合網絡藥理學研究方法構建雨花茶“主要成分-核心靶點-主要通路”的網絡圖，以期為雨花茶抗腫瘤機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雨花茶樣品購于南京及周邊地區(qū)，來源信息詳見表1，茶品均置于冰箱冷藏保存。

表1 雨花茶信息Table 1 Origin of Yuhua tea product

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要試劑

色譜級乙腈購于Merck公司，分析純甲酸購于上海凌峰化學試劑有限公司，分析純乙醇購于上海久億化學試劑有限公司；對照品沒食子酸（批號：RP191126）、表沒食子兒茶素（批號：RP210614）、兒茶素（批號：RP210819）、咖啡堿（批號：RP201026）、表兒茶素（批號：RP190620）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（批號：RP210806）、表兒茶素沒食子酸酯（批號：RP210727）均購于成都麥德生科技有限公司；對照品質量分數(shù)均大于98%。

1.2.2 儀器設備

安捷倫1260 Infinity高效液相色譜儀：配有G1311C型四元梯度泵、G1329B型自動進樣器、G1316A型柱溫箱、G4212B型DAD檢測器及ChemStation工作站（美國安捷倫公司）；X105BDU型十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Heraeus Fresco 21型高速冷凍離心機（賽默飛科技有限公司）；KH5200B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Milli-Q實驗室純水儀（德國Milli-Q達姆施塔特默克集團）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A），乙腈（B）；梯度洗脫（0～5 min，5% B；5～35 min，5%～12% B；35～50 min，12%～16% B；50～60 min，16%～80% B；60～70 min，80%～5% B）；進樣量為5 μL；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為1.03 mg/mL、2.28 mg/mL、2.12 mg/mL、1.62 mg/mL、2.11 mg/mL、2.84 mg/mL、2.03 mg/mL的對照品貯備液。臨用時稀釋成系列濃度的對照品工作液。

1.3.3 供試品溶液的制備

取各批次雨花茶樣品0.50 g，加15 mL濃度為55%的乙醇，稱定質量，超聲提取90 min，取出放冷補足失重，經0.45 μm濾膜過濾即得供試品溶液。

1.3.4 含量測定

（1）專屬性考察。分別取混合對照品溶液和供試品溶液進行進樣分析，考察樣品各組分的分離度。

（2）線性關系考察。取對照品溶液稀釋成系列濃度的對照品工作液進樣測定并記錄峰面積。以濃度為橫坐標（X，μg）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，進行回歸分析。

（3）精密度實驗。取同一對照品溶液連續(xù)進樣6次，以咖啡堿為參照峰，測定各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

（4）穩(wěn)定性實驗。取S1供試品溶液，分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h連續(xù)進樣測定，以咖啡堿為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

（5）重復性實驗。取6份S1供試品溶液分別進樣測定，以咖啡堿為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值。

（6）加樣回收率實驗。分別稱取已知含量的6份樣品，每份0.1 g，加適量對照品溶液進樣測定，計算各成分的含量及平均加樣回收率。

1.3.5 指紋圖譜構建及相似度評價

按照“1.3.3”方法制備S1～S12供試品溶液，將12批雨花茶樣品的AIA數(shù)據采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”進行分析，建立其指紋圖譜并進行相似度評價。

1.3.6 雨花茶網絡藥理學分析

（1）主要成分及其靶點的篩選。根據雨花茶的指紋圖譜特征峰與定量成分，基于TCMSP、Swiss Target Prediction、PubChem、UNIPROT數(shù)據庫獲取其活性成分信息并對其成分的靶點信息去重，基于Gene cards、OMIM數(shù)據庫檢索腫瘤相關靶點將藥物靶點和疾病靶點取交集得到共有靶點。

（2）成分-靶點網絡圖構建。將成分和靶點信息導入Cytoscape 3.9.0軟件，構建“成分-靶點”可視化網絡圖。

（3）PPI網絡構建及核心靶點的篩選。將交集靶點導入String數(shù)據庫，選擇物種為“人類”，設置最低要求互作分數(shù)為0.9，構建蛋白互作關系，得出核心靶點。

（4）GO生物過程富集分析。通過DAVID數(shù)據庫，選擇人類基因對交集靶點對應的基因進行GO分析（p＜ 0.05）。

（5）KEGG信號通路富集分析。通過DAVID數(shù)據庫，選擇人類基因對交集靶點對應的基因進行KEGG生物富集分析（p＜ 0.05）。

（6）成分-靶點-通路的可視化網絡構建。將成分和靶點以及前10條通路的相關信息導入Cytoscape 3.9.0軟件，構建雨花茶的“成分-靶點-通路-疾病”的網絡關系圖。

2 結果與分析

2.1 方法學考察結果

2.1.1 系統(tǒng)適應性

混合對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。各組分分離度均大于1.5，表明該方法的系統(tǒng)適應性和專屬性良好。

圖1 樣品（A）和對照品（B）色譜圖Figure 1 Chromatogram of sample（A）and standard（B）

2.1.2 線性關系

以濃度為橫坐標（X，μg），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。線性回歸方程見表2。線性關系良好。

表2 雨花茶中7個成分的線性關系考察結果Table 2 Linear relationship of 7 components in Yuhua tea

2.1.3 精密度

精密吸取混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，以咖啡堿為參照峰，結果各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別小于0.56%和1.32%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性

S1供試品溶液分別在0 h、4 h、8 h、16 h、24 h、32 h、48 h內各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別小于0.73%和3.22%，表明供試品溶液穩(wěn)定。

2.1.5 重復性

6份S1供試品溶液中各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別小于0.61%和2.75%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率

沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的平均加樣回收率分別為96.32%、98.12%、97.77%、101.25%、99.87%、102.75%和96.32%，RSD值分別為2.39%、1.78%、3.02%、2.89%、1.64%、2.49%和2.33%。

2.2 茶樣中兒茶素等活性成分及含量

12批雨花茶中7種（個）成分含量測定結果見表3。12批茶樣中沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯的含量分別為2.809～3.776 mg/g、24.900～37.619 mg/g、1.771～3.452 mg/g、34.598～47.811 mg/g、12.716～14.965 mg/g、98.753～132.464 mg/g和22.370～29.978 mg/g；從上述7種（個）成分來看，茶樣中表沒食子兒茶素沒食子酸酯的平均含量最高為115.599 mg/g，兒茶素的平均含量最低為2.706 mg/g；從茶多酚總量來看，高淳地區(qū)雨花茶的平均含量最高為261.430 mg/g，江寧地區(qū)雨花茶的平均含量次之為251.896 mg/g，溧陽和棲霞地區(qū)雨花茶的平均含量最低且兩地區(qū)較為接近，分別為215.330 mg/g和217.865 mg/g。從茶多酚平均含量來看，高淳和江寧地區(qū)的雨花茶質量較優(yōu)。

表3 雨花茶中7種活性成分含量測定結果Table 3 Content determination results of 7 components in Yuhua tea mg·g-1

2.3 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評價

共標定13個共有峰，生成對照指紋圖譜R（圖2）。12批雨花茶相似度均大于0.990，表明各批次雨花茶之間組分相似，所建立的指紋圖譜質量穩(wěn)定。

圖2 雨花茶HPLC指紋圖譜Figure 2 HPLC fingerprint of Yuhua tea

2.4 基于成分-靶點-通路的網絡藥理學分析

2.4.1 主要成分及其靶點

根據雨花茶的指紋圖譜特征峰與定量成分，基于TCMSP、Swiss Target Prediction、PubChem、UNIPROT數(shù)據庫獲取沒食子酸、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡堿、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯7個化合物的成分信息（表4），同時獲取7個成分的靶點信息并去除重復靶點共得到231個靶點。基于Gene cards、OMIM數(shù)據庫檢索腫瘤相關靶點。將藥物靶點和疾病靶點取交集，共得到134個靶點（圖3）。

圖3 雨花茶成分-疾病靶點交集Venn圖Figure 3 Venn diagram of the intersection of Yuhua tea components and disease targets

表4 雨花茶7個成分的MOLID信息Table 4 MOLID information of 7 components of Yuhua Tea

2.4.2 成分-靶點網絡圖

雨花茶7個成分與134個共有靶點的“成分-靶點”可視化網絡圖如圖4所示，該網絡由141個節(jié)點和388條邊組成。應用“Analysis network”對其進行網絡拓撲分析，得到Degree中位數(shù)為1，Betweenness Centrality中位數(shù)為0，Closeness Centrality中位數(shù)為0.410 557 185。根據Degree值的大小，排名前三位的成分分別為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（MOL006821）、咖啡堿（MOL003973）及表兒茶素沒食子酸酯（MOL005467）；排名前三的靶點為PTGS1、PTGS2和ESR1，提示這些成分與靶點和腫瘤相關。

圖4 雨花茶成分-靶點的網絡圖Figure 4 Network construction of Yuhua Tea Components and targets

2.4.3 PPI網絡構建及核心靶點篩選

134個交集靶點的蛋白互作關系如圖5所示。根據Degree值大小，排名前10的關鍵靶點依次為JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1和RELA，提示這些關鍵靶點可能是雨花茶抗腫瘤的核心靶點。

圖5 蛋白互作網絡（PPI）分析Figure 5 Protein interaction network（PPI）analysis

2.4.4 GO生物過程富集分析

通過DAVID數(shù)據庫，選擇人類基因對134個靶點對應的基因進行GO分析（p＜ 0.05）（圖6）。結果顯示，GO生物過程富集分析共富集得到2455個條目。其中BP有2224個條目，主要涉及對外來生物刺激的反應（Response to xenobiotic stimulus）、氧化應激反應（Response to oxidative stress）、細胞對化學應激的反應（Cellular response to chemical stress）等；CC共有66個條目，主要涉及細胞膜筏（Membrane raft）、細胞膜微結構域（Membrane microdomain）、RNA聚合酶II轉錄調節(jié)復合物（RNA Polymerase II transcription regulator complex）等；MF共有165個條目，主要涉及磷酸酶結合（Phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結合（Protein phosphatase binding）、DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）等。

圖6 生物學過程（GO）富集分析Figure 6 Enrichment analysis of biological processes（GO）

2.4.5 KEGG信號通路富集分析

通過DAVID數(shù)據庫，選擇人類基因對134個靶點對應的基因進行KEGG生物富集分析（p＜ 0.05），如圖7所示。結果顯示，KEGG生物過程富集共得到165條信號通路，篩選出前20條信號通路，其中排名靠前的10條信號通路分別為前列腺癌（hsa05215）、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染（hsa05167）、胰腺癌（hsa05212）、乙型肝炎（hsa05161）、內分泌的阻力（hsa01522）、人類巨細胞病毒感染（hsa05163）、黑色素瘤（hsa05218）、非小細胞肺癌（hsa05223）、癌癥中的蛋白聚糖（hsa05205）和膀胱癌（hsa05219）。KEGG富集分析結果表明，雨花茶中7個成分均與腫瘤作用關系密切。

圖7 KEGG信號通路富集柱狀圖及氣泡圖Figure 7 Enrichment column and bubble diagram of KEGG signal pathway

2.4.6 雨花茶成分-靶點-通路的可視化網絡關系

構建了雨花茶的“成分-靶點-通路-疾病”的網絡關系圖。如圖8所示，綠色部分代表雨花茶及其7個成分，藍色部分代表靶點，橙色部分代表通路及疾病。由圖可知，圖形面積大小與Degree值呈正相關。排名前10的靶點分別為TP53、CDKN1A、MAPK1、MAPK3、MAP2K1、RAF1、E2F1、AKT1、CCND1和RB1，提示這些靶點可能是雨花茶抗腫瘤的重要靶點。

圖8 成分-靶點-通路的網絡圖Figure 8 Network diagram of components-targets-pathways

3 結論與討論

3.1 討論

雨花茶作為我國十大名茶之一，具有清熱解毒、利尿通便、提神明目等多重功效。唐代《新修本草》中記載：“茗味甘、苦，微寒，無毒。主瘺瘡，利小便，祛痰熱渴?！迸R床上已有包含茶多酚提取物的心腦健膠囊用于高血脂、高血壓、頭暈目眩等癥狀的治療。目前，已有文獻應用網絡藥理學方法研究茶葉抗癌的作用機制，但尚未有指紋圖譜結合網絡藥理學的研究方法對雨花茶抗腫瘤作用機制的研究。本研究在前期研究基礎上建立了不同產地雨花茶指紋圖譜及兒茶素組分的含量測定方法。結果發(fā)現(xiàn)，不同產地雨花茶中兒茶素組分含量差異較大，表沒食子兒茶素沒食子酸酯為雨花茶中含量最高的成分，兒茶素為含量最低的成分。

本研究利用網絡藥理學方法構建了“雨花茶成分-靶點-疾病通路”的網絡，探究雨花茶抗腫瘤潛在分子作用機制，得到7種成分的134個潛在靶點和165條信號通路。7種成分中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡堿、表兒茶素沒食子酸酯三個成分在網絡中作用較大。已有研究表明，表沒食子兒茶素沒食子酸酯可以通過促進抑制癌癥基因的表達、誘導細胞凋亡、調節(jié)甲基化水平，影響多條信號通路等多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤效應[22]。咖啡堿具有興奮中樞神經、促進血液循環(huán)、利尿和醒酒作用[23]，亦有研究表明[24-25]咖啡堿能保護肉毒堿抵抗細胞性神經腫瘤病和抑制肝細胞性肝癌干細胞的增殖，誘導細胞凋亡，從而增強對肝癌干細胞的殺傷作用。表兒茶素沒食子酸酯在芳基乙酰胺脫乙酰酶的代謝中具有特異性抑制作用[26]，同時對于B16F10黑素瘤細胞中黑素的生成具有明顯抑制作用[27]?？梢?，茶葉中的兒茶素等成分具有抑菌、消炎、降“三高”和抗腫瘤等多重作用，對于抵抗多種腫瘤細胞具有潛在的防治作用。

根據PPI蛋白互作得到的核心靶點中，排名前十的靶點為JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1和RELA，說明這些靶點具有重要作用。JUN和FOS蛋白組成的AP-1轉錄因子，可通過調節(jié)含有AP-1結合位點靶基因的轉錄表達，從而調節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化以及腫瘤血管生成及腫瘤轉移[28]。缺氧誘導因子1A（HIF1A）是腫瘤缺氧信號通路的中樞調節(jié)因子，可參與血管新生、糖酵解、紅細胞生成以及在細胞的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮作用[29]。細胞信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是一條雙重功能信號通路，可通過介導細胞的惡性轉化、參與腫瘤的增殖、分化、血管生成、侵襲轉移和免疫逃避等多項生理調節(jié)[30-31]。雌激素受體α（ESR1）基因與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移和治療反應密切相關[32]。絲裂原活化蛋白激酶3/1（MAPK3、MAPK1）信號通路對于LH誘導的卵母細胞減數(shù)分裂、排卵和黃體的生成必不可少[33]；同時MAPK1在癌癥形成過程中發(fā)揮重要作用，如在卵巢癌中MAPK1過度激活可促進癌細胞的增殖侵襲及遷移[34]。TP53作為一個抑癌基因，突變頻率較高，在晚期非小細胞肺癌中大約50%存在突變失活，研究已證實TP53基因發(fā)生突變后腫瘤往往更具侵襲性，預后較差，因而我國人群中TP53突變可能是晚期非小細胞肺癌不良預后因素[35]。特異性蛋白1（SP1）作為一種轉錄因子，可通過結合RNA和調節(jié)轉錄穩(wěn)定性的能力從而影響癌癥。研究表明SP1通過促進ARRB1表達促進細胞凋亡，從而抑制T-ALL進程[36]。真核細胞轉錄因子（RELA）通過調節(jié)多種靶基因的表達，參與炎癥因子、免疫反應和腫瘤細胞的凋亡、增殖和分化的調控，RELA還可通過磷酸化、乙?；图谆刃揎椇缶珳收{控NF-κB的轉錄活性，在調節(jié)炎癥、腫瘤、代謝等重要生理活動中發(fā)揮重要作用[37]。

3.2 結論

雨花茶中的成分可能通過JUN、HIF1A、STAT3、ESR1、MAPK3、TP53、MAPK1、FOS、SP1、RELA介導腫瘤相關通路和NF-κB信號通路，參與炎癥反應與發(fā)揮免疫調節(jié)、抗氧化、抗缺氧、抗腫瘤等作用。本研究首次采用指紋圖譜結合網絡藥理學探究雨花茶抗腫瘤的作用機制，并測定其中7種活性成分的含量，可為基于抗腫瘤作用的雨花茶等茶的質量控制等提供參考依據。