茶樹咖啡堿合成酶基因分子變異檢測及其關(guān)聯(lián)分析

劉碩謙，葉潔連

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128

茶多酚、生物堿、茶氨酸是茶葉中的三大次生代謝產(chǎn)物，三者相互協(xié)同決定了茶葉的主要品質(zhì)。生物堿在茶樹體內(nèi)主要是嘌呤類生物堿，最重要的是茶葉堿、咖啡堿和可可堿三種，其中咖啡堿含量最高，是茶葉中最主要的生物堿。咖啡堿化學(xué)名為1,3,7-三甲基嘌呤，本身帶有苦味，能與多酚類化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸等結(jié)合提高茶葉的品質(zhì)，使得茶湯呈現(xiàn)鮮爽滋味。茶樹除種子外，全株都有咖啡堿積累[1]，葉片及莖上半段含量較豐富，其中新梢中咖啡堿含量最高，尤其是幼嫩芽葉中，其次是第一葉和第二葉，老葉含量最低[2]?？梢娍Х葔A在茶樹新梢內(nèi)的分布規(guī)律是隨新梢生育程度的加深而減少[3]，這可作為茶葉老嫩度的標(biāo)志成分之一?？Х葔A也是茶葉中主要的藥理成分，具有許多藥理作用[4]，如興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。茶葉中咖啡堿的興奮作用比較溫和，在人體內(nèi)能迅速轉(zhuǎn)化和消除，對人體沒有傷害。此外，咖啡堿還有利尿及影響體內(nèi)代謝等作用?？Х葔A在茶樹體內(nèi)的合成途徑有多條[5]。以腺嘌呤為初始物質(zhì)的途徑為腺苷酸（AMP）生成次黃嘌呤核苷酸（IMP），次黃嘌呤核苷酸在次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（IMPDH）的作用下生成黃嘌呤核苷酸（XMP），黃嘌呤核苷酸生成黃嘌呤核苷（XR），黃嘌呤核苷在7-甲基黃嘌呤核苷合成酶的作用下生成7-甲基黃嘌呤核苷，7-甲基黃嘌呤核苷生成7-甲基黃嘌呤（7-MX），7-甲基黃嘌呤在咖啡堿合成酶的作用下合成可可堿，可可堿最后在咖啡堿合成酶的作用下生成咖啡堿。

近年來，低、高或者無咖啡堿等特色茶樹品種選育成為國內(nèi)外茶樹新品種選育的熱點并取得了較好的研究進(jìn)展。日本通過對茶樹和茶樹近緣物種進(jìn)行物種間雜交，選育出多個咖啡堿含量低于1.5%的茶樹資源[6]。葉創(chuàng)興等[7]從毛葉茶中選育低咖啡堿的可可茶，為低咖啡堿品種的選育打下了良好的基礎(chǔ)。廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所與中山大學(xué)合作，以野生型的南昆山白毛茶作為親本雜交出一批可可茶新品種，其中‘可可茶1號’和‘可可茶2號’的咖啡堿含量幾乎為零[8]。楊維時等[9]在2005年用同屬不同種的油茶和茶樹進(jìn)行胚軸嫁接，其中的‘輻射早’咖啡堿含量降低到2.85%，‘黃葉早’降低到2.49%，2007年采用地上部根頸嫁接法，經(jīng)嫁接后的‘多抗香’茶樹咖啡堿含量下降到2.01%。Ogino等[10]從雜交組合Camellia taliensis×Camelliasinensis的后代中選育出2個咖啡堿非常低的茶樹品種。所有這些成就，為培育綜合性狀優(yōu)良且具咖啡堿特色的茶樹新品種奠定了堅實基礎(chǔ)。但是，常規(guī)育種技術(shù)具有較多的局限性，使得茶樹新品種選育進(jìn)展緩慢[11]。分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)在水稻、玉米等作物上的應(yīng)用，顯著提高了新品種選育的效率，大幅度縮短了育種周期。分子標(biāo)記輔助選擇育種的準(zhǔn)確、可靠及高效率等優(yōu)越性，也將會加快茶樹品種選育的進(jìn)程[12]。目前，咖啡堿含量相關(guān)的分子標(biāo)記尚未報道。本研究以咖啡堿含量變異豐富的黃金茶群體為材料，通過分子變異檢測與分析，篩選與茶樹咖啡堿含量相關(guān)的變異位點，為咖啡堿含量相關(guān)的分子標(biāo)記奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因數(shù)據(jù)庫

本研究使用的數(shù)據(jù)庫為美國生物技術(shù)信息中心（NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2 分析工具

基本BLAST檢索：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast；ORF開放閱讀框分析：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi；蛋白序列及理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析：https://web.expasy.org/protparam。

1.3 數(shù)據(jù)分析軟件

本研究使用的數(shù)據(jù)分析軟件主要包括R語言、DNAMAN和MEGA11等。

1.4 生物信息學(xué)分析方法

利用Expasy提供的程序Protparam tool推測蛋白的氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)，運用NCBI-BLASTP工具對獲得的基因序列及其編碼蛋白進(jìn)行同源性搜索，用DNAMAN和MEGA11軟件進(jìn)行多序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用ProTScale分析蛋白的親/疏水性，利用NCBI Conserved Domain Search分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，通過TMHMMserver 2.0在線預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，通過Signal P5.0預(yù)測分析信號肽，運用SOPMA預(yù)測TCS蛋白的二級結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL在線分析工具預(yù)測TCS蛋白的三級結(jié)構(gòu)。

1.5 TCS基因分子變異檢測

選取保靖‘黃金茶’群體200份，通過高效液相色譜法檢測咖啡堿含量，篩選59份咖啡堿含量差異明顯的樣本送諾禾致源生物科技有限公司（北京）對TCS基因組DNA進(jìn)行測序，以‘鐵觀音’基因組為參考基因組，通過SNP calling獲得TCS基因的分子變異數(shù)據(jù)。

1.6 TCS突變位點的基因型與咖啡堿水平的關(guān)聯(lián)分析

利用R軟件對保靖‘黃金茶’群體59份樣本的分子變異數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，選用顯性、隱性、共顯性等模型對其位點的基因型與茶樹咖啡堿含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TCS基因序列及其蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)

ORF finder分析表明，TCSgene ID: TGY007486序列開放閱讀框為1 104 bp，起始密碼子可能位于1 bp處，終止密碼子位于1 104 bp，編碼一個含有367個氨基酸的蛋白質(zhì)。ProParam toll在線預(yù)測，表明TCS蛋白分子量為41 188.29 Dal，理論等電點（pl）為5.54，呈酸性。帶負(fù)電荷的殘基即堿性氨基酸精氨酸（Arg）和賴氨酸（Lys）36個，帶正電荷的殘基即酸性氨基酸天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）為46個。TCS蛋白的異亮氨酸（Leu）的含量最高，達(dá)10.6%；L-半胱氨酸（Cys）含量最少，為2.2%。不穩(wěn)定系數(shù)為37.11，TCS蛋白為穩(wěn)定蛋白。脂肪族指數(shù)為86.81，親水性總平均值為-0.136，推測TCS蛋白為親水蛋白。

2.2 TCS蛋白同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為進(jìn)一步鑒定TCS蛋白序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST對TCS蛋白序列進(jìn)行同源性比較，運用DNAMAN對茶樹TCS蛋白的氨基酸序列與其他物種的咖啡堿合成酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析[16]。結(jié)果（圖1）表明，TCS蛋白與‘狹葉油茶’（Camellia oleifera）、‘榴梿’（Duriozibethinus）、‘可可’（Theobromacacao）、‘阿月渾子’（Pistaciavera）中咖啡堿合成酶序列的一致性分別為96.19%、54.72%、54.28%和54.16%。運用MEGA 11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖2）可看出TCS蛋白與‘狹葉油茶’（CICS2）進(jìn)化距離最近，歸為一類。

圖1 TCS蛋白同源性分析Figure 1 TCS protein homology analysis

圖2 TCS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 2 Phylogenetic tree of TCS proteins

2.3 TCS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

結(jié)果（圖3）表明，茶樹TCS蛋白在氨基酸序列第59和第363個之間含有N7-甲基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域（cl04109），屬于SAM依賴性N甲基轉(zhuǎn)移酶，為N7-甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員，進(jìn)一步驗證本研究目標(biāo)序列的正確性。

圖3 TCS蛋白保守結(jié)構(gòu)域Figure 3 The conserved structural domain of TCS protein

圖 4 TCS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)（a）及信號肽（b）預(yù)測Figure 4 Prediction of the transmembrane structure (a) and signal peptide (b) of TCS protein

2.4 TCS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖4a）表明，TCS蛋白的1～367個氨基酸均位于細(xì)胞膜表面，預(yù)測沒有跨膜蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)可能的跨膜結(jié)構(gòu)，因此推測TCS蛋白屬于非分泌蛋白。信號肽結(jié)果（圖4b）表明，TCS蛋白是信號肽的可能性為0.002，說明TCS蛋白不具有信號肽，所以茶樹TCS蛋白不屬于分泌蛋白，只在細(xì)胞內(nèi)參與反應(yīng)，與其跨膜結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果（圖4a）相同。

2.5 TCS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析

TCS蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖5所示，能夠推測α-螺旋（Alpha helix）和無規(guī)則卷曲（Random coil）是TCS蛋白主要的二級結(jié)構(gòu)。367個氨基酸中有172個可能形成α-螺旋，其占總二級結(jié)構(gòu)的46.87%；有132個氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲，其占比為35.97%；有50個氨基酸可能形成延伸鏈（Extended strand），其占比為13.62%；這些氨基酸中有13個可能形成β-轉(zhuǎn)角（Beta turn），其占比為3.54%。

圖5 TCS蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Figure 5 Secondary structure analysis of TCS protein

2.6 TCS蛋白三級結(jié)構(gòu)建模及分析

利用SWISS-MODEL對TCS蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果TCS蛋白三級結(jié)構(gòu)模型如圖6所示。經(jīng)模型可靠性評估分析表明，模型覆蓋范圍為第24個氨基酸到第366個氨基酸，其GMQE為0.89，說明該模型可靠性高、質(zhì)量好；且其GMEANDisCo global為0.84±0.05，其序列一致性為86.07%，QMEAN值為-2.49，說明該模型可信度較高。

圖6 TCS蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 6 Prediction of the tertiary structure of TCS protein

2.7 TCS基因及其啟動子變異分析

通過上述的序列系統(tǒng)分析證實在‘鐵觀音’茶樹基因組中基因號為TGY007486的序列為茶樹咖啡堿合成酶基因TCS。在此基礎(chǔ)之上，我們進(jìn)一步對59份茶樹樣本的TCS基因的變異數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測與分析，結(jié)果表明在TCS基因的編碼區(qū)中含有11個變異位點。其中包括2個同義突變位點，分別是Chr01：183517193和Chr01： 183519016；9個非同義突變位點，分別是Chr01：183517108、Chr01：183518919、Chr01：183518924、Chr01：183519002、Chr01：183519023、Chr01：183519083、Chr01：183519209、Chr01：183519225和Chr01：183519228。由圖7可看出，Chr01：183517108變異位點在HJ01、HJ02、HJ03等樣本中有T→C的轉(zhuǎn)換；Chr01：183518919變異位點在HJ04、HJ05、HJ25等樣本中有C→T的轉(zhuǎn)換；Chr01：183518924變異位點在HJ02、HJ15等樣本中有T→C的轉(zhuǎn)換；Chr01：183519002變異位點在HJ02、HJ04等樣本中有A→G的轉(zhuǎn)換；Chr01：183519023變異位點在HJ07、HJ08、HJ09等樣本中有C→CCAA的插入；Chr01：183519083變異位點在HJ05、HJ03、HJ02等樣本中有G→T的顛倒；Chr01：183519209變異位點在HJ10、HJ13等樣本中有A→G的轉(zhuǎn)換；Chr01：183519225變異位點在HJ02、HJ15等樣本有G→A的轉(zhuǎn)換，而在HJ04中有A→G的轉(zhuǎn)換；Chr01：183519228變異位點在HJ14、HJ42等樣本中有C→G的顛倒。突變類型分析結(jié)果表明，在所檢測的樣本中11個變異位點中均有雜合突變，其中變異位點Chr01：183518919、Chr01：183518924和Chr01：183519228的雜合突變最多，而位點Chr01：183519209和Chr01：183517108的雜合突變最少。此外，TCS基因的啟動子區(qū)位點Chr01：183522617存在變異，在HJ02、HJ06、HJ07中有T→A的顛倒，在HJ04、HJ05等樣本中有A→T的顛倒，在所考察樣本中以純合突變?yōu)橹?。Chr01：183518418極顯著變異位點在HJ04樣本中有G→A的轉(zhuǎn)換，在HJ04、HJ33等樣本中有A→G的轉(zhuǎn)換，在所考察樣本中以純合突變?yōu)橹鳌hr01：183521387極顯著變異位點在HJ02、HJ03等樣本中有T→G的顛倒，在所考察樣本中以純合突變?yōu)橹鳌?/p>

圖7 TCS基因變異分析Figure 7 TCS gene variance analysis

2.8 咖啡堿含量分子標(biāo)記的篩選

在獲得了TCS基因及其啟動子的變異數(shù)據(jù)后，對各樣本各位點的基因型與咖啡堿含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果（圖8）表明，與咖啡堿含量顯著相關(guān)（-log10(p-value)≥1.3）的位點有32個，其中在共顯性模型下有23個變異位點與咖啡堿含量顯著相關(guān)，分別是Chr01：183516630、Chr01：183516636、Chr01：183517108、Chr01：183517359、Chr01：183518359、Chr01：183518536、Chr01：183518834、Chr01：183518862、Chr01：183518873、Chr01：183519083、Chr01：183519228、Chr01：183520073、Chr01：183520149、Chr01：183520186、Chr01：183521143、Chr01：183521146、Chr01：183521194、Chr01：183521221、Chr01：183521243、Chr01：183521780、Chr01：183521799、Chr01：183521819和Chr01：183521821；在顯性模型下有2個變異位點與咖啡堿含量顯著相關(guān)，分別是Chr01：183516630和Chr01：183516636；在隱性模型下有3個變異位點與咖啡堿含量顯著相關(guān)，分別是Chr01：183521194、Chr01：183521221和Chr01：183521243；在超顯性模型下有2個變異位點與咖啡堿含量顯著相關(guān)，分別是Chr01：183516630和Chr01：183519863。而與咖啡堿含量極顯著相關(guān)（-log10(p-value)≥3.1）的位點有2個，分別是Chr01：183518418和Chr01：183521387，因此這兩個變異位點均可作為茶樹咖啡堿含量的分子標(biāo)記開發(fā)。

圖8 TCS變異位點基因型與茶樹咖啡堿含量的關(guān)聯(lián)分析Figure 8 Association analysis of TCS variant loci genotypes and caffeine content in tea plant

3 結(jié)論與討論

茶葉具有多種藥理功效[13-14]。飲茶作為一種受歡迎的健康生活方式，具有多種好處，如提高注意力、改善心情和消除疲勞。然而，高咖啡因飲料（如咖啡或能量飲料）的攝入可能對身體有害，導(dǎo)致失眠、心悸、頭痛等癥狀，并增加心血管疾病和中風(fēng)的風(fēng)險。為解決這一問題，低咖啡堿茶樹新品種的選育成為熱點。但傳統(tǒng)低咖啡堿茶樹的選育是一個長期的過程，而分子標(biāo)記輔助育種具有高效率及較高的準(zhǔn)確性等優(yōu)越性能夠為茶樹低咖啡堿選育帶來很大的助力。

本研究首先通過同源性分析從‘鐵觀音’茶樹參考基因組中篩選到茶樹TCS基因序列，該序列ORF為1 104 bp，編碼367個氨基酸，與‘狹葉油茶’咖啡堿合成酶序列一致性為96.19%?？疾斓?0多個物種中，TCS蛋白與‘狹葉油茶’咖啡堿合成酶遺傳距離最近，且聚為一類。由此可推測，本研究的目標(biāo)序列為咖啡堿合成酶基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TCS蛋白為非跨膜蛋白且不具有信號肽，僅能在細(xì)胞內(nèi)參與反應(yīng)。通過保守結(jié)構(gòu)域分析，確定TCS蛋白屬于N7-甲基轉(zhuǎn)移酶超家族的成員，即SAM依賴性N甲基轉(zhuǎn)移酶，這與劉玉飛等[15]的研究結(jié)果一致。TCS蛋白二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其中α-螺旋占總二級結(jié)構(gòu)的46.87%，而無規(guī)則卷曲占35.97%，β-轉(zhuǎn)角占3.54%，這與劉玉飛等[15]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步預(yù)測的TCS蛋白三級結(jié)構(gòu)與圖6的三級結(jié)果模型一致，屬于典型的咖啡堿合成酶結(jié)構(gòu)。一般來說，目標(biāo)蛋白三級結(jié)構(gòu)與模型的GMQE值越高表示可靠性越高，可信度范圍為0～1，值越大表明質(zhì)量越好。本研究的GMQE值為0.89，GMEANDisCo global值為0.84 ± 0.05，QMEAN值為-2.49，其序列一致性為86.07%，表明預(yù)測結(jié)果可信度較高。綜合上述序列分析、同源性分析以及結(jié)構(gòu)分析，系統(tǒng)驗證了本研究的序列確實為咖啡堿合成酶基因，可開展下一步的分子變異分析。

分子變異是指生命在遺傳的基礎(chǔ)上同一基因庫中不同個體之間在DNA水平上的差異，也稱為“遺傳變異”，是對同一物種個體之間遺傳差別的定性或定量描述。遺傳與變異是生物界不斷普遍發(fā)生的現(xiàn)象，也是物種形成和生物進(jìn)化的基礎(chǔ)。常見的分子變異類型有單核苷酸多態(tài)性、插入缺失突變、錯義突變、無義突變及移碼突變等，生物的分子變異能夠使生物個體產(chǎn)生新的性狀以至于形成新的物種，有利于生物的進(jìn)化。Jang Su等[16]通過對候選等位基因做DNA標(biāo)記，堆疊幾個有利的等位基因具有顯著提高水稻每穗穗數(shù)的潛力，有利于增加每個穗的小穗數(shù)量。Ravi Samathmika等[17]對甜菜土壤中不同程度受立枯絲核菌感染的植物進(jìn)行限制性位點相關(guān)DNA（RAD）測序，位于染色體6上的RsBv1n能夠抵抗絲核菌。單核苷酸多態(tài)性（SNP）是指由于單個核苷酸以及較短片段的插入或缺失所引起的多態(tài)性[18]。根據(jù)它的分布位點可以分為基因編碼區(qū)SNPs、基因間SNPs等[19]。相比于第二代分子標(biāo)記SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記它需要對其多態(tài)性進(jìn)行驗證，費時費力，開發(fā)的成本較高；而SNP遺傳標(biāo)記技術(shù)是第三代分子標(biāo)記，它的優(yōu)點有高通量、快速、分析簡單、成本較低、全基因組覆蓋等，因此它的多態(tài)性幾乎是在所有被研究的物種中都被用作有效的遺傳標(biāo)記，在動物和植物中均被應(yīng)用。另外，樊曉靜等[20]研究得出SNP分子標(biāo)記也可以用來作為茶樹品種種質(zhì)資源的身份證。

本研究通過TCS基因的分子變異檢測發(fā)現(xiàn)茶樹中TCS基因分子變異豐富，包含了SNP、插入突變及缺失突變。通過單核苷酸多態(tài)性分析共檢測到11個TCS基因變異位點，其中7個轉(zhuǎn)換，包括A/G 4個和T/C 3個；4個顛倒，包括C/G 1個、A/T 2個、G/T 1個；1個C/CCAA插入，無缺失位點，9個非同義變異位點，2個同義變異位點；兩個極顯著變異位點分別是2個A/G的轉(zhuǎn)換，1個T/G的顛倒。

為了驗證TCS基因分子變異是否影響茶樹咖啡堿在茶樹中的積累，首先檢測了‘黃金茶’群體中各樣本的咖啡堿含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)‘黃金茶’群體咖啡堿含量差異顯著，變異范圍從0.2%～4.6%。通過表型與基因型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，在TCS基因變異位點中有Chr01：183518418和Chr01：183521387兩個位點的基因型與茶樹咖啡堿含量極顯著相關(guān)。Chr01：183518418和Chr01：183521387可以作為茶樹咖啡堿含量分子標(biāo)記開發(fā)的候選位點。

本研究篩選了兩個茶樹咖啡堿含量關(guān)聯(lián)位點，將在茶樹咖啡堿特色茶樹新品種的分子標(biāo)記輔助選擇育種中有廣闊的應(yīng)用前景。但由于TCS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制尚不明確，本研究未對其轉(zhuǎn)錄因子或其他相關(guān)基因的分子變異進(jìn)行分析。我們下一步將分析茶樹咖啡堿含量相關(guān)的變異位點以期獲得更全面的咖啡堿含量分子標(biāo)記，更好地服務(wù)于茶樹的分子育種。