吡哆醇對魯氏接合酵母高鹽脅迫耐受的影響

陳 勝， 王文欣， 劉子雄， 宋慶怡， 上官玲玲， 姚婉婷， 陳 雄， 代 俊

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068）

醬油作為我國最受歡迎的調(diào)味品之一，它是以蛋白質(zhì)和淀粉為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵作用釀造而成的一種產(chǎn)物，具有獨(dú)特、渾厚、濃郁的風(fēng)味，已經(jīng)成為人們生活中不可或缺的調(diào)味品之一[1]。 在醬油發(fā)酵過程中，酵母這類微生物具有產(chǎn)香、增鮮特性，能使醬油的風(fēng)味更加良好[2]。 但是高鹽稀態(tài)法釀造醬油需要在高鹽的環(huán)境下才能實(shí)施，因此研究酵母抗高鹽脅迫的能力是提高醬油風(fēng)味的重要途徑之一。魯氏接合酵母作為典型的耐鹽性酵母[3]，可以應(yīng)用于食品發(fā)酵中產(chǎn)生獨(dú)特的香氣與風(fēng)味物質(zhì)，但為了更好地適應(yīng)高鹽環(huán)境，還需要進(jìn)一步提高魯氏接合酵母抗高鹽脅迫的能力。

關(guān)于魯氏接合酵母的耐鹽機(jī)制前人已有探索，發(fā)現(xiàn)其耐鹽性主要與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜組成成分和形態(tài)、Na+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、細(xì)胞內(nèi)生物相容性物質(zhì)以及抗氧化還原能力有關(guān)[4]。 為了增加發(fā)酵食品的風(fēng)味，進(jìn)一步深入研究魯氏接合酵母的耐鹽機(jī)制是至關(guān)重要的。

前人通過外源添加物質(zhì)來改變魯氏接合酵母的代謝性質(zhì)， 比如添加D-果糖來改變呋喃酮代謝機(jī)制[5]，因此作者通過添加外源物質(zhì)來提高魯氏接合酵母對高鹽環(huán)境的適應(yīng)性。 已有文獻(xiàn)報(bào)道，維生素B6（vitamin B6，VB6）能夠調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上離子通道，增強(qiáng)細(xì)胞抗脅迫能力等[6]。VB6作為一種營養(yǎng)豐富的物質(zhì)， 添加后能提供發(fā)酵菌株更好的生長[7]；而且，VB6還能提高細(xì)胞活性，提高發(fā)酵菌株的抗逆性。 VB6是由吡哆醇（PN）、吡哆醛（PL）、吡哆胺（PM）及其磷酸化衍生物在細(xì)胞內(nèi)相互轉(zhuǎn)化形成的[8]，并且磷酸吡哆醛（PLP）是由PN、PL 或PM 形成的最主要的活性形式， 還能在氨基酸代謝過程中行使輔酶的作用[9]；吡哆醇的生物合成也與硫胺素相互聯(lián)系[8]。 近年來，植物中已證明維生素B6可作為活性氧自由基（ROS）清除劑，具有增加對生物和非生物脅迫抗性因子的附加功能[10]。由此考慮吡哆醇作為提高魯氏接合酵母耐鹽性營養(yǎng)物質(zhì)的可能性。

目前，國內(nèi)外已有報(bào)道闡明了維生素對動(dòng)植物的影響，不僅可以增強(qiáng)植物抗氧化能力，并且還可對動(dòng)物的免疫功能產(chǎn)生影響[11-12]，但外源添加維生素對魯氏接合酵母耐鹽性影響的探究還比較少，因此本研究中主要是基于前期調(diào)研基礎(chǔ)上，通過在高鹽脅迫條件下，研究外源添加吡哆醇對菌株的生長狀況、 產(chǎn)甘油和海藻糖等生物相容性物質(zhì)的能力、轉(zhuǎn)運(yùn)Na+的能力等生理代謝過程的影響， 進(jìn)一步提高魯氏接合酵母在增強(qiáng)發(fā)酵食品比如醬油風(fēng)味品質(zhì)的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株

魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii ）A 菌株： 中國典型培養(yǎng)物保藏中心提供， 保藏號(hào)為CCTCCM 2013310[13]，由作者所在實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.2 材料與儀器

YEPD 培養(yǎng)基： 20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L 酵母浸粉。 固體培養(yǎng)基則另加入20 g/L 瓊脂。 根據(jù)鹽質(zhì)量濃度的不同分別加入18 g/dL NaCl或者14 g/dL NaCl，115 ℃滅菌20 min。

酵母浸粉：安琪酵母公司產(chǎn)品；葡萄糖、NaCl、無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)產(chǎn)品；蛋白胨：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠產(chǎn)品；吡哆醇、三氯乙酸：上海麥克林公司產(chǎn)品；甘油含量測定試劑盒：北京普利萊公司產(chǎn)品；腺苷三磷酸酶試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

UV-722 型紫外可見光分光光度計(jì)： 上海精密科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；YXQ-LS-100SⅡ型高壓蒸汽滅菌鍋、SPX-150D 型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)公司產(chǎn)品；5810R 型高速冷凍離心機(jī)： 德國Eppendorf 公司產(chǎn)品；SBA-90 型生物分析傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所提供；Synergy H1 全功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器公司產(chǎn)品；ZA3300 型原子吸收光譜儀： 日本HITACHI 公司產(chǎn)品；7890B 型氣相色譜儀、Ultimate 3000 型高效液相色譜儀： 賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及培養(yǎng)條件 首先將魯氏接合酵母菌種活化于YEPD 培養(yǎng)基，間隔24 h 后再次活化得到次級(jí)種子液，然后取次級(jí)種子液按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量分別接種于含有2 g/L 吡哆醇、18 g/dL NaCl 的YEPD 培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）和不添加吡哆醇的YEPD 培養(yǎng)基中（對照組），最后在30 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)并取各個(gè)生長階段的樣品測定各項(xiàng)生理生化特征數(shù)據(jù)。

1.3.2 吡哆醇質(zhì)量濃度的確定 為了更明顯地看出不同質(zhì)量濃度吡哆醇的添加對魯氏接合酵母生長的影響，避免在含18 g/dL NaCl 的YEPD 平板上生長區(qū)分度不高，因此降低鹽質(zhì)量濃度，采用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 平板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 先將次級(jí)種子液稀釋到OD600nm為1, 然后按照10、100、1 000 倍梯度稀釋， 之后取0.8 μL 點(diǎn)樣于添加6 種梯度質(zhì)量濃度吡哆醇（0～2 g/L） 的含14 g/dL NaCl的YEPD 固體培養(yǎng)基上，最后30 ℃恒溫培養(yǎng)60 h，觀察菌落的生長狀況。

1.3.3 生物量的測定 取5 mL 搖瓶發(fā)酵液，5 000 r/min 離心10 min，去上清液，加5 mL 去離子水重懸酵母細(xì)胞，相同條件離心水洗3 次，最后用5 mL去離子水重懸細(xì)胞，稀釋后以去離子水為對照在紫外可見光分光光度計(jì)600 nm 處進(jìn)行比色測定，光密度OD600nm為OD 讀數(shù)與稀釋倍數(shù)的乘積。

1.3.4 細(xì)胞干質(zhì)量的測定 分別用電子天平稱量干燥的離心管質(zhì)量以及5 mL 搖瓶發(fā)酵液經(jīng)過離心洗滌烘干至質(zhì)量恒定的離心管和菌體的總質(zhì)量，利用兩者之差計(jì)算出每毫升發(fā)酵液的細(xì)胞干質(zhì)量。

1.3.5 葡萄糖質(zhì)量濃度的測定 取2 mL 搖瓶發(fā)酵液，12 000 r/min 離心5 min， 取上清液采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS）測定發(fā)酵液中葡萄糖的質(zhì)量濃度[14]。

1.3.6 乙醇產(chǎn)量的測定 取2 mL 搖瓶發(fā)酵液，12 000 r/min 離心5 min， 取上清液使用SBA-90 型生物分析傳感儀測量[15]。

1.3.7 甘油含量的測定 使用甘油含量測定試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)外甘油的含量。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 取5 mL 搖瓶發(fā)酵液，5 000 r/min 離心10 min，去上清液，用冰水清洗3 次后收集菌體。 在菌體中加入4 mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸，振蕩均勻后置于冰水混合物中，每15min 振蕩一次，1 h 后于3 000 r/min 離心5 min，吸取1 mL 上清液于試管中， 加入5 mL 硫酸蒽酮，沸水浴10 min，冷卻后于630 nm 處測定OD 值。 再制作海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品測得的OD630nm值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)[16]。

1.3.9 細(xì)胞內(nèi)鈉鉀比率（Na+/K+）的測定 使用原子吸收光譜儀測定細(xì)胞內(nèi)的鈉和鉀離子的質(zhì)量濃度[13]。

1.3.10 Na+/K+-ATP 酶活性的測定 采用腺苷三磷酸酶試劑盒測定，結(jié)果以蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì)[13]。

1.3.11 2-苯乙醇產(chǎn)量的測定 取1 mL 搖瓶發(fā)酵液，5 000 r/min 離心10 min， 收集上清液， 用0.22 μm 有機(jī)系濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定2-苯乙醇的產(chǎn)量。 檢測條件為Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相中甲醇與水體積比為6∶4，流量為0.6 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm，檢測時(shí)間為20 min[17]。

1.3.12 統(tǒng)計(jì)分析 采用Origin 9.0、GraphPad Prism 5等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖，顯著性水平設(shè)置為1%。 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，圖表中數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 促進(jìn)魯氏接合酵母生長的最佳吡哆醇質(zhì)量濃度的確定

吡哆醇主要是通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成磷酸吡哆醛（PLP）的活性形式來作為相關(guān)反應(yīng)酶的輔酶或者底物，從而參與各種合成代謝反應(yīng)。 魯氏接合酵母可以耐受18 g/dL 的NaCl，但基于前期基礎(chǔ)，為了使酵母生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果對比更加明確，本實(shí)驗(yàn)中選用了含14 g/dL NaCl 的YEPD 固體培養(yǎng)基來探究添加不同質(zhì)量濃度的吡哆醇對魯氏接合酵母生長的影響，結(jié)果如圖1 所示。 結(jié)果表明，魯氏接合酵母在不同質(zhì)量濃度吡哆醇的影響下， 外源添加2 g/L 吡哆醇時(shí)的生長狀況最好，而其他質(zhì)量濃度對魯氏接合酵母的促生長作用并不明顯。沒有做更高質(zhì)量濃度下吡哆醇的促生長作用是因?yàn)? g/L 的質(zhì)量濃度相對較高，再提高質(zhì)量濃度已經(jīng)不再適合工業(yè)上擴(kuò)大生產(chǎn)。 所以最終選取外源添加2 g/L 的吡哆醇來探究其對魯氏接合酵母抗高鹽脅迫機(jī)制的影響。

圖1 不同質(zhì)量濃度吡哆醇對魯氏接合酵母生長的影響Fig. 1 Effect of pyridoxine with different concentrations on the growth of Zygosaccharomyces rouxii

2.2 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞生長和葡萄糖消耗的影響

魯氏接合酵母在生長過程中伴隨著糖類物質(zhì)的消耗，從而提供能量供自己生長以及產(chǎn)生其他物質(zhì)如乙醇、甘油等來應(yīng)對外界脅迫的壓力。 探究在含18 g/dL NaCl 的YEPD 液體培養(yǎng)基中添加吡哆醇對魯氏接合酵母細(xì)胞生長和葡萄糖消耗的影響，結(jié)果如圖2 所示。 在對照組中，魯氏接合酵母經(jīng)歷了36 h 的延滯期后才進(jìn)入對數(shù)期快速生長，葡萄糖也是剛好在36 h 被快速消耗。 與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組消耗葡萄糖的速度更快，進(jìn)入對數(shù)期的時(shí)間也提前了24 h，相當(dāng)于縮短了2/3 的延滯期，并且從圖中可以判斷出在72 h 后兩者進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)對照組與實(shí)驗(yàn)組的OD600nm值分別為9.4、10.4，生物量提高了10.6%， 表明吡哆醇的添加不僅可以縮短延滯期的時(shí)間，還可以促進(jìn)魯氏接合酵母的生物量積累。

圖2 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞生長和葡萄糖消耗的影響Fig. 2 Effect of pyridoxine on cell growth and glucose consumption of Zygosaccharomyces rouxii

在12 h 內(nèi)， 實(shí)驗(yàn)組的葡萄糖質(zhì)量濃度降低了8%，但OD600nm值總體變化很小，這種現(xiàn)象表明添加吡哆醇能夠促進(jìn)魯氏接合酵母對葡萄糖的利用，生物量變化很小，進(jìn)一步說明對葡萄糖的利用更可能用于合成維持細(xì)胞滲透壓穩(wěn)定的物質(zhì)來抵抗外界的脅迫。 細(xì)胞內(nèi)主要是甘油和海藻糖等物質(zhì)，合成的這些物質(zhì)可以提高魯氏接合酵母在高鹽脅迫下的耐受性。 但這只是初步推測，吡哆醇的添加能否加快葡萄糖的代謝來用于合成甘油以及海藻糖等物質(zhì)還需下一步實(shí)驗(yàn)來判斷。而在12 h 之后隨著葡萄糖的不斷消耗，生物量快速增加，這種現(xiàn)象表明，添加吡哆醇能加快生物代謝，促進(jìn)葡萄糖的吸收利用。 磷酸吡哆醛是吡哆醇的活性形式，在140 多種不同的酶反應(yīng)中行使輔因子功能，在酵母的生長代謝中發(fā)揮重要作用[18]。因此，在高鹽脅迫下添加吡哆醇能夠加快氨基酸代謝刺激酵母的生長，合成相關(guān)物質(zhì)維持細(xì)胞的滲透壓平衡。

2.3 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響

乙醇作為來源廣泛、清潔、可再生的燃料，有利于發(fā)展綠色循環(huán)經(jīng)濟(jì)。 在醬油生產(chǎn)過程中，乙醇有利于醬油的保存[19]，提高乙醇產(chǎn)量可提高醬油的質(zhì)量。 添加吡哆醇對魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響如圖3 所示。 結(jié)果表明，添加吡哆醇的實(shí)驗(yàn)組在剛進(jìn)入對數(shù)期后乙醇產(chǎn)量大幅度提高，隨著葡萄糖的消耗， 乙醇產(chǎn)量從12 h 的0.15 g/L 漲到最大值30 h的4.20 g/L，當(dāng)葡萄糖幾乎消耗完時(shí)，乙醇產(chǎn)量才逐漸下降。 與對照組相比（對照組乙醇產(chǎn)量最大達(dá)到4.00 g/L），乙醇產(chǎn)量增加了5%。

圖3 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母乙醇產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of pyridoxine on the ethanol production of Zygosaccharomyces rouxii

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源添加吡哆醇可以提高魯氏接合酵母的乙醇產(chǎn)量，這可能是因?yàn)榘被岽x形成的碳骨架有利于糖的合成，為糖酵解途徑產(chǎn)生乙醇提供了可能[20]。 而且芳香族氨基酸代謝有利于提高菌株對乙醇的耐受性從而增加乙醇的產(chǎn)量[21]。外源添加吡哆醇還可以促進(jìn)硫胺素的合成[8]， 硫胺素焦磷酸能作為輔助因子促進(jìn)丙酮酸脫羧形成乙醛，乙醛進(jìn)一步還原成乙醇，進(jìn)而提高乙醇的產(chǎn)量[13]。

2.4 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母甘油含量和細(xì)胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

甘油和海藻糖作為重要的生物相容性物質(zhì)，在魯氏接合酵母受到高鹽脅迫時(shí)會(huì)發(fā)揮關(guān)鍵的作用。比如擁有較好親水性能的多羥基的甘油，能夠維持細(xì)胞內(nèi)的水分活度，平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓，并且高滲甘油(high osmolarity glycerol, HOG)應(yīng)答途徑是真核細(xì)胞應(yīng)答高滲透壓脅迫的關(guān)鍵響應(yīng)機(jī)制[22]，能讓細(xì)胞在高鹽條件下避免脫水死亡。 海藻糖是一種典型的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，由于其特殊的物理性質(zhì)和穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在酵母細(xì)胞面臨高滲透壓等惡劣環(huán)境時(shí)形成一層保護(hù)膜，能有效地保護(hù)酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)不被破壞；此外海藻糖的水解還可為蛋白質(zhì)恢復(fù)活性提供能量，從而維持酵母細(xì)胞在脅迫條件下的生存[23]。 因此，甘油和海藻糖的含量變化關(guān)系著酵母細(xì)胞抗逆性的強(qiáng)弱。 探究在高鹽脅迫下吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)外甘油含量的影響，結(jié)果如圖4 所示。 由圖4（a）可知，對照組在前48 h 內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)甘油隨著葡萄糖的消耗而穩(wěn)定地合成，在48 h 時(shí)達(dá)到最大積累量（48.81 mg/g，以細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)），此時(shí)魯氏接合酵母剛好進(jìn)入對數(shù)期中期，細(xì)胞快速生長，之后細(xì)胞內(nèi)甘油代替葡萄糖作為碳源快速消耗，以維持細(xì)胞繼續(xù)生長。 在實(shí)驗(yàn)組中，添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)甘油在24 h 時(shí)達(dá)到最大積累量（45.46 mg/g），隨后也如對照組一般快速消耗，但兩組每克干細(xì)胞所積累甘油的最大值并無明顯差別（P＞0.05）。 這說明在吡哆醇的外源添加影響下，魯氏接合酵母能在高鹽高滲環(huán)境中提前激活HOG 應(yīng)答途徑，從而提前合成和積累甘油，為延滯期細(xì)胞提供更多地保護(hù)， 平衡細(xì)胞內(nèi)的滲透壓，以盡快適應(yīng)高鹽高滲環(huán)境。

圖4 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)外甘油含量的影響Fig. 4 Effect of pyridoxine on the intracellular and extracellular glycerol content of Zygosaccharomyces rouxii

吡哆醇的添加對細(xì)胞外甘油的影響如圖4（b）所示。 實(shí)驗(yàn)組在前30 h 內(nèi)細(xì)胞外甘油不斷積累，且在30 h 達(dá)到最大值13.95 mmol/L， 隨后快速消耗。而對照組細(xì)胞外甘油在前54 h 內(nèi)積累， 在54 h 達(dá)到最大值18.05 mmol/L，比實(shí)驗(yàn)組高出29%。這表明在細(xì)胞剛開始生長時(shí)， 葡萄糖作為主要碳源被消耗，從而細(xì)胞外甘油開始積累，而在葡萄糖消耗完后，細(xì)胞外甘油可以被吸收到細(xì)胞內(nèi)作為遲效碳源繼續(xù)供細(xì)胞生長。 在高鹽高滲條件下，外源添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞外甘油進(jìn)入細(xì)胞，從而達(dá)到更多的生物量，并且還可以更好地平衡滲透壓， 使細(xì)胞在高鹽高滲條件下生存下去，提高酵母耐鹽性。

吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響如圖5 所示。 實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞內(nèi)海藻糖都在前12 h 快速消耗，并且在前48 h 內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組的海藻糖比對照組的海藻糖消耗的更多，分解速率更快，由此可知外源添加吡哆醇后，細(xì)胞內(nèi)海藻糖消耗加快，為細(xì)胞代謝提供碳源，這是因?yàn)檫炼叽紩?huì)參與氨基酸的各種反應(yīng)，促進(jìn)酵母細(xì)胞的生長代謝，從而加速海藻糖的吸收利用。

圖5 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 5 Effect of pyridoxine on the intracellular trehalose content of Zygosaccharomyces rouxii

高鹽脅迫條件下，酵母會(huì)產(chǎn)生一些生物相容性物質(zhì)來平衡滲透壓，以防止細(xì)胞失水死亡或維持細(xì)胞內(nèi)各種穩(wěn)態(tài)。 甘油和海藻糖作為經(jīng)典的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，魯氏接合酵母更依賴于甘油的富集來對抗高鹽的脅迫， 而并非海藻糖的積累。 在高鹽脅迫條件下，添加吡哆醇后，魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)甘油合成明顯提前， 細(xì)胞外甘油外排減少，從而提高細(xì)胞在高鹽條件下的適應(yīng)性。 而對于海藻糖而言，添加吡哆醇后，消耗反而增加，這表明外源添加的吡哆醇會(huì)促進(jìn)海藻糖作為碳源被消耗，而非將其作為保護(hù)性物質(zhì)，但其加速消耗也為酵母生長提供了有利條件。 上述結(jié)果表明，魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下主要是利用甘油的生物相容性來增強(qiáng)其抗脅迫的能力， 而外源添加吡哆醇后，有利于甘油提前合成， 更早去抵抗高鹽脅迫的環(huán)境，同時(shí)也加快了海藻糖的利用，提高生物量，使細(xì)胞能更快適應(yīng)高鹽高滲環(huán)境。

2.5 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影響

Na+/K+-ATP 酶作為分布在細(xì)胞膜上的膜結(jié)合蛋白酶，主要功能是排出過量鈉離子，解除鈉離子對細(xì)胞的毒性，維持鉀離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)pH 穩(wěn)定，平衡細(xì)胞內(nèi)外滲透壓與維持細(xì)胞膜完整性，其酶活性大小關(guān)系著細(xì)胞抗高鹽脅迫能力的強(qiáng)弱[24]。 魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下， 細(xì)胞內(nèi)Na+含量遠(yuǎn)大于K+， 此時(shí)為了避免Na+的毒性， 就需要Na+/K+-ATP 酶依賴于ATP 的能量將Na+從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，將K+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，平衡細(xì)胞內(nèi)外離子差以及滲透壓。 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)Na+/K+及Na+/K+-ATP 酶活性的影響如圖6 所示。 結(jié)果表明，整個(gè)生長時(shí)期，對照組細(xì)胞內(nèi)Na+/K+一直持續(xù)下降， 而實(shí)驗(yàn)組Na+/K+是對數(shù)期先下降， 穩(wěn)定期Na+/K+些許上升，原因可能為在高鹽脅迫下，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一些活性氧自由基（ROS）[25],而這些活性氧自由基會(huì)對細(xì)胞膜造成損傷，從而影響Na+/K+-ATP 酶活性，導(dǎo)致Na+/K+上升。 在延滯期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的Na+/K+比對照組低26.5%（P＜0.05）；而在對數(shù)期，實(shí)驗(yàn)組的Na+/K+比對照組低82.3%（P＜0.05）。從延滯期到對數(shù)期，添加吡哆醇后，實(shí)驗(yàn)組的Na+/K+下降的幅度遠(yuǎn)高于對照組，表明在高鹽脅迫條件下，吡哆醇增強(qiáng)了細(xì)胞膜上離子通道的調(diào)節(jié)作用，有利于Na+的外排。由圖6（b）可知，在對數(shù)期，實(shí)驗(yàn)組Na+/K+-ATP 酶活性比對照組高16.9%； 在穩(wěn)定期， 實(shí)驗(yàn)組Na+/K+-ATP 酶活性比對照組高35.2%。 而無論是對數(shù)期還是穩(wěn)定期，實(shí)驗(yàn)組的Na+/K+-ATP 酶活性都比對照組的高，這一點(diǎn)證明了在高鹽脅迫下，外源添加吡哆醇能夠促進(jìn)Na+/K+-ATP 酶活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外離子平衡以及滲透平衡， 降低Na+對酵母細(xì)胞的毒害作用從而增加細(xì)胞活性。

圖6 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)Na+/K+及細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性的影響Fig. 6 Effect of pyridoxine on the ratio of Na+/K+ in the cell and the activity of Na+/K+-ATPase on the cell membrane of Zygosaccharomyces rouxii

2.6 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產(chǎn)量的影響

2-苯乙醇作為效用普遍、價(jià)值可觀的高級(jí)芳香醇，其特有的玫瑰香氣對醬油風(fēng)味的形成起重要作用。 醬油發(fā)酵中若是缺少這種香味物質(zhì)，則其風(fēng)味就會(huì)淡薄[26]。 因此提高2-苯乙醇的產(chǎn)量不僅有利于增加發(fā)酵食品的風(fēng)味，使其更受歡迎，并且也為生產(chǎn)2-苯乙醇提供一定的參考。吡哆醇的添加對魯氏接合酵母2-苯乙醇產(chǎn)量的影響如圖7 所示。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組在對數(shù)期魯氏接合酵母的2-苯乙醇產(chǎn)量為11.50 mg/L，比對照組的2-苯乙醇產(chǎn)量（1.55 mg/L）提高了6.42 倍；在穩(wěn)定期，對照組的2-苯乙醇產(chǎn)量為13.13 mg/L，實(shí)驗(yàn)組為29.64 mg/L，相比于對照組提高了1.26 倍。這表明，在高鹽脅迫條件下，外源添加的吡哆醇可以通過在氨基酸代謝中行使輔酶功能（包括轉(zhuǎn)氨作用、脫羧作用等[18]）提高魯氏接合酵母2-苯乙醇的產(chǎn)量。這是因?yàn)榻湍府a(chǎn)生2-苯乙醇涉及氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與調(diào)控，而吡哆醇在其氨基酸代謝中起著重要作用， 因此才促進(jìn)產(chǎn)量增加高達(dá)6.42 倍。上述結(jié)果表明， 魯氏接合酵母在高鹽脅迫條件下，外源添加行使輔酶功能的吡哆醇能夠促進(jìn)2-苯乙醇產(chǎn)量的提高。

圖7 吡哆醇的添加對魯氏接合酵母的2-苯乙醇產(chǎn)量影響Fig. 7 Effect of pyridoxine on the production of 2-phenylethanol of Zygosaccharomyces rouxii

3 結(jié) 語

研究結(jié)果表明，在高鹽脅迫條件下，添加吡哆醇（2 g/L）提高了魯氏接合酵母細(xì)胞對高鹽脅迫的耐受性， 縮短了高鹽脅迫條件下酵母生長的延滯期，提高了生物量，有利于食品發(fā)酵中香味物質(zhì)的提前形成以及風(fēng)味增加； 還促進(jìn)了甘油的提前合成，使細(xì)胞提前適應(yīng)高鹽環(huán)境，以及提高了細(xì)胞膜上Na+/K+-ATP 酶活性，降低Na+的毒害作用從而提高細(xì)胞活性。 除此之外，吡哆醇的添加還提高了乙醇和2-苯乙醇的產(chǎn)量，對醬油的保存和增香有很大的促進(jìn)作用，最終提高了醬油的風(fēng)味。

由此可見，吡哆醇的添加能提高魯氏接合酵母對高鹽脅迫的耐受能力，提高在高鹽脅迫條件下的生物量，增加發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果給工業(yè)上提高醬油等發(fā)酵食品風(fēng)味提供了一定的思路和參考，以及有助于探索耐鹽產(chǎn)香酵母風(fēng)味形成的機(jī)理。 作者初步探索了吡哆醇這類維生素對魯氏接合酵母高鹽脅迫耐受的影響，更深的分子機(jī)理以及其他類物質(zhì)對其是否有同類作用還需進(jìn)一步探究。